Purification de vecteurs adénoviraux contenant le génome par gradient de chlorure de césium

Commencez avec des cellules de mammifères infectées par un adénovirus.

Effectuez plusieurs cycles de congélation-dégeliation pour lyser les cellules et libérer les virions.

Centrifuger le lysat pour faire précipiter les débris. Recueillir le surnageant contenant les particules virales.

Disposez le surnageant viral sur un gradient pas à pas de chlorure de césium pour une séparation basée sur la densité.

Effectuer une ultracentrifugation afin de permettre aux particules virales de migrer selon leurs densités d'équilibre.

Les virions intacts contenant le génome adénoviral complet sont plus denses en raison de l'ADN empaqueté et migrent vers une bande inférieure, tandis que les capsides vides et les débris, plus légers, restent dans les couches supérieures.

Retirez les couches supérieures. Récupérez la bande inférieure des virions contenant le génome.

Resuspendre les virions dans un chlorure de césium de densité uniforme et procéder à une nouvelle ultracentrifugation afin d'affiner la séparation et de concentrer les particules complètes.

Jetez les couches supérieures et récupérez la bande inférieure.

Dialyser l'échantillon pour éliminer le chlorure de césium.

Les vecteurs adénoviraux contenant le génome et de haute pureté sont désormais prêts pour des applications en aval.

Pour préparer le lysat viral en vue de la purification par gradient de chlorure de césium, effectuez quatre cycles de congélation/décongélation de la suspension virale cellulaire. Ensuite, centrifugez le lysat viral à 500 × g pendant huit minutes à température ambiante.

Ensuite, récupérez le surnageant contenant l'adénovirus à capacité élevée. Pipetez soigneusement et lentement les solutions de chlorure de césium dans les tubes selon l'ordre suivant : 0,5 millilitre de solution à 1,5 gramme par centimètre cube, trois millilitres de solution à 1,35 grammes par centimètre cube et 3,5 millilitres de solution à 1,25 gramme par centimètre cube. Recouvrez d'environ 4,5 millilitres de surnageant viral clarifié la couche de 1,25 gramme par centimètre cube.

Centrifuger les gradients dans une ultracentrifugeuse en utilisant un rotor à bacs oscillants à 12 degrés Celsius pendant au moins deux heures à 226 000 × g afin de séparer les particules virales contenant le génome d'adénovirus à capacité élevée des particules vides et des débris cellulaires. Après la centrifugation, une bande diffuse de débris cellulaires se forme au sommet des tubes. En dessous de celle-ci, deux bandes blanches peuvent être observées.

La bande supérieure contient des particules vides, tandis que la bande inférieure correspond à l'adénovirus à haute capacité. Retirez soigneusement les couches de débris cellulaires et de particules vides. Ensuite, récupérez un millilitre des bandes inférieures de chaque tube.

Transférez le virus dans un tube stérile de 50 millilitres. Ajoutez jusqu'à 24 millilitres de solution de chlorure de césium à 1,35 gramme par centimètre cube aux particules virales recueillies et mélangez soigneusement. Remplissez les tubes de centrifugation jusqu'au bord avec la solution virale de chlorure de césium à 1,35 gramme par centimètre cube.

Ensuite, centrifuger toute la nuit à 226 000 ×g à 12 °C dans une ultracentrifugeuse en utilisant un rotor à bille avec une accélération et une décélération lentes. Retirer les couches supérieures depuis le haut à l’aide d’une pipette. Puis, recueillir l’adénovirus à capacité élevée présent dans la bande inférieure marquée à l’aide d’un nouveau embout de pipette.

Enfin, dialyser les particules virales recueillies pour échanger le tampon. Ensuite, déterminer le titre de la préparation finale selon les instructions détaillées dans le protocole écrit.