Confirmation de la transduction virale dans le foie de rat recellularisé par marquage immunohistochimique

Commencez avec un tissu hépatique de rat recellulaire congelé, contenant des hépatocytes humains, inclus dans du milieu cryogénique.

Dans ce tissu, les hépatocytes transduits expriment la protéine fluorescente verte émeraude (EmGFP), une protéine rapporteuse codée par le vecteur viral.

Utilisez un cryotome pour couper des sections minces qui conservent l'architecture cellulaire et tissulaire. Transférez les sections sur une lame.

Traitez les sections avec un détergent doux afin de perméabiliser la membrane cellulaire.

Appliquer un anticorps primaire anti-EmGFP qui se lie spécifiquement à la protéine rapporteur fluorescente exprimée dans les cellules transduites.

Laver pour éliminer les anticorps non liés.

Introduisez un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore rouge, qui se lie à l'anticorps primaire, puis effectuez un lavage.

Ajouter un colorant fluorescent bleu spécifique de l'ADN qui se lie à l'ADN cellulaire.

Sous un microscope à fluorescence, la colocalisation de la fluorescence rouge avec les noyaux colorés en bleu confirme que les hépatocytes transduits dans le tissu hépatique expriment avec succès la protéine rapporteur virale.

À l’aide d’un scalpel, prélevez des échantillons sur chaque lobe hépatique d’environ un demi-centimètre d’épaisseur et de 1,5 à 2 centimètres de longueur. Incubez les tranches dans du paraformaldéhyde 4 % avec du saccharose 4 % pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, laver les échantillons trois fois avec du PBS pendant une minute par lavage. Après les lavages, incuber les échantillons toute la nuit dans du saccharose à 8 % à quatre degrés Celsius. Le lendemain, charger les échantillons dans des cryomoules contenant du milieu de fixation.

Évitez d'introduire des bulles d'air. Une fois chargés, recouvrez complètement les échantillons de milieu de fixation et placez-les à moins 80 degrés Celsius. Une fois congelés, préparez des cryosections de 10 micromètres à partir des échantillons à l'aide d'un cryotome.

Colorer les échantillons selon les besoins pour confirmer la recellularisation.