JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 vues • 3:33 min • August 31st, 2026
Prenez une culture cellulaire humaine.
Ajouter des lentivirus codant pour un ARNip ciblant de manière conditionnelle l'ARNm de l'hôte sous un promoteur sensible à la tétracycline fusionné à un opérateur.
Le lentivirus porte également des gènes codant pour un répresseur de la tétracycline et une protéine de résistance aux antibiotiques, placés sous un promoteur constitutif.
Incuber pour permettre la livraison de l'ARN viral dans les cellules hôtes.
L'ARN se convertit en ADNc et s'intègre dans le génome de l'hôte.
Lavez, ajoutez le milieu et incubez pour permettre l'expression du répresseur de la tétracycline et de la protéine de résistance à l'antibiotique, générant ainsi des cellules transduites. Le répresseur de la tétracycline se lie à l'opérateur et supprime l'expression de l'ARNi en épingle à cheveux (shRNA).
Lavez, ajoutez le milieu supplémenté en antibiotique et incubez.
Les cellules transduites expriment la protéine de résistance à l'antibiotique, ce qui permet leur survie sélective en présence de l'antibiotique.
Ajouter de la doxycycline, un analogue de la tétracycline, dans la culture.
La doxycycline se lie au répresseur de la tétracycline, empêchant sa liaison à l'opérateur et permettant l'expression de l'ARNi court (shRNA).
Le ARNsh est transformé en ARNsi, qui s'insère dans le CIR et dégrade l'ARNm cible.
Ceci permet d'obtenir des cellules présentant une inhibition conditionnelle dépendante de la doxycycline.
Pour générer des lignées cellulaires stables, commencez par ensemencer des cellules de cancer du côlon HCT-116 et des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 dans une plaque de 12 puits à raison de 50 000 cellules par puits.
Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules sont confluentes à 60-70 %, laver les cellules avec du PBS et ajouter un millilitre de milieu contenant le virus dans chaque puits. Le jour suivant, retirer soigneusement le milieu contenant le virus par aspiration.
Ensuite, après avoir lavé les cellules avec du PBS, ajouter le milieu contenant du FBS sans tétracycline. Après 72 heures, laver les cellules comme précédemment et ajouter du milieu supplémenté avec un microgramme par millilitre de puromycine pour la sélection des cellules transduites par le virus. Sélectionner les cellules transduites par le virus en cultivant les cellules en présence de puromycine pendant trois à 14 jours.
Observer une mort partielle des cellules par la puromycine dans les puits contenant des cellules transduites par le virus. Les cellules non transduites ne pousseront pas en présence de puromycine.
Vérifiez l'efficacité de l'extinction conditionnelle dans les cellules de cancer du côlon HCT-116 et de cancer du sein MDA-MB-231 résistantes à la puromycine en ajoutant un milieu contenant différentes concentrations de doxycycline et en cultivant les cellules pendant 72 heures.