Évaluation du titre lentiviral par un test immuno-enzymatique (ELISA)

Prendre des vecteurs lentiviraux contenant l'antigène HIV-1 p24, une protéine marqueur utilisée pour la détection.

Ajouter un détergent pour lyser et libérer la p24, puis diluer l'échantillon par dilutions sérielles.

Prenez une microplaque revêtue d'anticorps monoclonaux anti-p24 et d'un agent bloquant pour prévenir la liaison non spécifique.

Ajouter les dilutions d'échantillons et les étalons p24 comme références.

Incuber pour permettre l'interaction de la p24 avec les anticorps via un épitope spécifique, puis éliminer les composants non liés.

Incuber avec des anticorps polyclonaux anti-p24 qui se lient à différents épitopes sur la protéine p24. Éliminer tous les anticorps non liés.

Ajouter des anticorps marqués par la peroxydase qui se lient aux anticorps polyclonaux. Éliminer les anticorps non liés.

Ajouter un substrat de peroxydase qui se transforme en un produit coloré.

Ajouter un acide pour inactiver la peroxydase et stabiliser le produit.

Mesurer l'absorbance correspondant à l'intensité de la couleur, qui est proportionnelle à la concentration de p24.

Générez le graphique standard et estimez les concentrations des échantillons afin de déterminer le titre viral.

Recouvrir une plaque 96 puits à liaison élevée avec 100 microlitres d'anticorps monoclonal anti-p24 dilué au 1/1 500 selon le programme NIH du vaccin contre le SIDA pour le kit de dosage par capture de l'antigène p24 du VIH-1. Incuber la plaque toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, laver la plaque trois fois avec 200 microlitres de TWEEN-20 à 0,05 % dans du PBS froid.

Pour éviter la liaison non spécifique, bloquer la plaque avec 200 microlitres d'albumine sérique bovine à 1 % pendant une heure à température ambiante. Ensuite, laver la plaque trois fois avec 200 microlitres de TWEEN-20 à 0,05 % dans du PBS froid. Puis, préparer les échantillons viraux concentrés et non concentrés à une concentration finale de 10 % en diluant le vecteur avec de l'eau doublement distillée et du Triton X-100.

Ensuite, préparez les étalons d'HIV-1 par une dilution sérielle au demi-départ de cinq nanogrammes par millilitre. Après avoir dilué les échantillons viraux concentrés et non concentrés, déposez-les sur la plaque en triplets et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, lavez la plaque, puis ajoutez 100 microlitres d'anticorps polyclonal de lapin anti-p24 sur chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant quatre heures.

Après six lavages, incuber la plaque avec de la peroxydase de chèvre anti-lapin à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après plusieurs lavages, incuber la plaque avec le substrat de peroxydase TMB à température ambiante pendant 15 minutes. Ajouter de l'acide chlorhydrique normal à 1 N pour arrêter la réaction. Puis mesurer l'absorbance à 450 nanomètres à l'aide d'un lecteur de plaques à absorbance.