Purification de particules virales recombinantes à partir de cellules rénales humaines transfectées

Commencez avec un lysat cellulaire contenant de l'ADN cellulaire agrégé avec des protéines cellulaires et des particules virales.

Ajouter des ions magnésium, suivis d'une nucléase, afin d'activer la dégradation enzymatique de l'ADN cellulaire et de rompre les agrégats ADN–protéine.

Centrifuger pour séparer les débris et recueillir le surnageant contenant les particules virales.

Superposer le surnageant sur un gradient discontinu d'iodixanol dont les concentrations augmentent du haut vers le bas, puis remplir le tube avec du tampon.

Effectuer une ultracentrifugation pour séparer les composants selon leur densité. Les particules virales s'accumulent à l'interface entre les couches de forte et de moyenne densité.

Insérez une aiguille à cette interface et recueillez les particules virales dans un tube.

Ajouter un tampon contenant des composants stabilisants, qui empêche l'agglutination des particules virales.

Transférez ensuite la solution dans un tube muni d'un filtre à membrane.

Centrifuger pour concentrer les particules virales au-dessus du filtre.

Ajouter le tampon enrichi de l'agent stabilisant et centrifuger à nouveau afin d'obtenir les particules virales purifiées.

Pour récolter les cellules transfectées, détacher et suspendre les cellules en utilisant le milieu de culture pour les aspirer et les expulser à l’aide d’une pipette. Ensuite, transférer les suspensions cellulaires dans des tubes stériles de 50 millilitres. Centrifuger les cellules à 500 × g pendant cinq minutes.

Ensuite, ajouter cinq millilitres de PBS dans chaque tube et resuspendre les culots cellulaires avant de combiner toutes les suspensions dans un tube de 50 millilitres. Après avoir centrifugé les cellules à 500 × g pendant cinq minutes, éliminer le surnageant. Pour purifier l'AAV, resuspendre le culot dans 10 millilitres de tampon de lyse.

Congelez le lysat à moins 80 degrés Celsius ou dans un bain de glace sèche–éthanol. Ensuite, décongelez-le à 37 degrés Celsius. Vortexez le lysat pendant une minute avant de répéter les cycles de congélation et de décongélation deux fois supplémentaires.

Ensuite, ajoutez du chlorure de magnésium à une concentration de un millimolaire au lysat décongelé. Puis ajoutez la nucléase à une concentration finale de 250 unités par millilitre. Incubez la solution à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes afin de dissoudre l'agrégation ADN-protéine.

Centrifuger l'échantillon à 4 800 ×g et à 4 °C pendant 20 minutes. Ensuite, récupérer le surnageant. Pendant ce temps, pour préparer une solution de gradient d'iodixanol à 17 %, mélanger 5 millilitres de PBS 10X avec 0,05 millilitre de chlorure de magnésium 1 molaire, 0,125 millilitre de chlorure de potassium 1 molaire, 10 millilitres de chlorure de sodium 5 molaires et 12,5 millilitres de milieu de gradient de densité.

Utiliser de l'eau pour ajuster le volume total à 50 millilitres. Après avoir préparé les solutions de gradient à 25 %, 40 % et 60 % selon le protocole décrit, utiliser une aiguille et une seringue pour charger cinq millilitres de solution de gradient à 17 % dans un tube en polypropylène. Ajouter ensuite cinq millilitres de chacune des solutions de gradient à 25 %, 40 % et 60 %.

Déposer le lysat sur le dessus du gradient. Ensuite, remplir le tube avec le tampon de lyse et le recouvrir d'un bouchon. Centrifuger le gradient à 185 000 ×g et à 16 °C pendant 90 minutes.

Après la centrifugation, utilisez une seringue pour récupérer la fraction virale à 40 % en insérant une aiguille de calibre 21 au niveau de l'intersection entre les fractions à 40 et 60 %, en évitant complètement la couche à 25 %. Mélangez la fraction virale avec une solution stérile de polyoxyéthylène polyoxypropylène, ou solution PBS de copolymère bloc PEG-PPG, jusqu'à un volume total de 15 millilitres. Chargez le mélange dans un tube filtrant ayant une limite de poids moléculaire de 100 kilodaltons.

Ensuite, centrifuger l'échantillon à 2 000 ×g et à 4 degrés Celsius pendant 30 minutes. Verser la solution depuis le fond du tube. Puis utiliser du PEG-PPG pour reconstituer le volume du tube filtrant à 15 millilitres.

Centrifuger le tube à 2 000 × g et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Après avoir répété le remplissage et la centrifugation deux fois supplémentaires, recueillir la fraction purifiée du virus rAAV9 toujours située au-dessus du filtre.