Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 3:07 min • August 31st, 2026
Prenez un milieu contenant des particules rétrovirales codant pour des oncogènes viraux et un gène de résistance à un antibiotique.
Centrifuger le milieu pour éliminer les débris cellulaires.
Recueillir le surnageant contenant les particules virales et l'ajouter en surcouche sur une culture de cellules endothéliales.
Incuber pour permettre l'entrée virale.
L'ARN viral est transcrit en ADN par transcription inverse, lequel s'intègre dans le génome de l'hôte.
Le gène de résistance aux antibiotiques produit une protéine de résistance. Les oncogènes produisent des protéines qui se lient aux protéines suppresseurs de tumeur contrôlant la division cellulaire et les inactivent, prolongeant ainsi la durée de vie cellulaire.
Remplacer le milieu par un milieu frais.
Incuber à nouveau pour assurer une intégration stable de l'ADN viral.
Retirer le milieu et laver les cellules.
Ajouter une solution de dissociation enzymatique pour détacher les cellules.
Transférez la suspension cellulaire, centrifugez et éliminez le surnageant.
Resuspendre le culot et le transférer dans un flacon.
Ajouter un antibiotique au milieu.
Seules les cellules exprimant la protéine de résistance à l'antibiotique survivent, permettant ainsi de sélectionner les cellules immortalisées par les protéines oncogènes virales.
Après une incubation nocturne, récupérez le milieu de la culture cellulaire PA317 et clarifiez-le par centrifugation à 300 × g pendant cinq minutes à température ambiante. Remplacez le milieu EGM d'une culture de cellules endothéliales à 50 % de confluence par 12 millilitres du milieu PA317 clarifié. Incubez les cellules pendant quatre heures.
Ensuite, remplacez six millilitres du milieu PA317 par six millilitres de milieu EGM frais et incubez les cellules toute la nuit. Par la suite, retirez le milieu de la culture de cellules endothéliales et nourrissez les cellules avec 12 millilitres de milieu EGM frais. Poursuivez l'incubation des cellules pendant 48 heures supplémentaires.
Pour repiquer les cellules endothéliales, retirez le milieu et lavez les cellules avec 12 millilitres de PBS sans cations. Ajoutez ensuite 3 millilitres d'une solution commerciale de dissociation enzymatique et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez les cellules à 300 × g pendant cinq minutes à température ambiante.
Une fois le culot obtenu, resuspendre les cellules dans un milieu EGM frais et répartir la suspension uniformément dans trois flacons T75. Ajuster le volume des cultures à 12 millilitres de EGM par flacon. Puis ajouter 200 microgrammes par millilitre de G418 afin de sélectionner les cellules endothéliales transduites.