Détermination de la distribution de l'ARN viral dans les cellules hôtes par hybridation in situ en fluorescence

Commencez avec une lame contenant des cellules hôtes infectées par le virus et perméabilisées, au sein desquelles les ARN viraux sont répartis entre les compartiments nucléaire et cytoplasmique.

Ajouter un tampon de pré-hybridation et incuber dans des conditions humides.

Dans le tampon, les réactifs de blocage occupent les sites de liaison non spécifiques, tandis que les inhibiteurs d'ARNases inactivent les ARNases et préservent l'intégrité de l'ARN.

Éliminer le tampon et ajouter les sondes oligonucléotidiques dénaturées, marquées à la digoxigénine, complémentaires de l'ARN viral.

Incuber à l'abri de la lumière pour permettre l'hybridation sonde-ARN, puis laver plusieurs fois.

Ajouter un fixateur pour stabiliser les hybrides sonde-ARN, puis effectuer plusieurs lavages. Ajouter un tampon contenant un détergent pour maintenir la perméabilité cellulaire.

Ajouter un anticorps anti-digoxigénine conjugué à un fluorophore vert qui interagit avec la digoxigénine, puis laver répétitivement.

Fixer les cellules pour préserver les complexes, puis laver à nouveau.

Ajouter un colorant se liant à l'ADN pour colorer les noyaux. Laver l'excès de colorant à plusieurs reprises.

Monter avec un coverslip et le sceller.

Sous un microscope confocal, visualisez la fluorescence verte, reflétant la répartition de l'ARN viral entre le noyau et le cytoplasme de la cellule hôte.

Après trois lavages au PBS comme indiqué, fixer à nouveau les échantillons dans du formaldéhyde à 4 % dans le PBS pendant 10 à 15 minutes avant une deuxième perméabilisation comme indiqué. Ensuite, recouvrir la lame de papier d'aluminium pour préserver le signal fluorescent et éviter la photodégradation.

Et laver les cellules avec du chlorure de sodium citrate 2x, avant d'ajouter 45 microlitres de solution d'hybridation. Après une heure à 37 degrés Celsius dans une chambre humide, ajouter de l'eau distillée aux oligonucléotides antisens d'intérêt afin d'obtenir un volume de dénaturation de 10 microlitres. Dénaturer les oligonucléotides à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis ajouter 35 microlitres de solution d'hybridation fraîche par lame.

Incuber ensuite les échantillons de 10 à 24 heures dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius, protégés avec du papier d'aluminium. Le lendemain, laver les cellules deux fois pendant 10 minutes avec du SSC 2X à température ambiante, puis une fois avec du SSC 1X pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius.

Après le dernier lavage, fixer les cellules avec du formaldéhyde à 4 % prérefroidi dans du PBS pendant 10 à 15 minutes sur de la glace, puis effectuer trois lavages avec du PBS frais. Ensuite, perméabiliser les échantillons comme indiqué, puis les incuber avec de l'anti-digoxigénine-FITC et du BSA à 0,1 % prérefroidi dans du PBS, pendant une heure à quatre degrés Celsius. À la fin de l'incubation, laver les lames trois fois dans du PBS frais et fixer les échantillons avec du paraformaldéhyde à 4 % prérefroidi dans du PBS pendant 10 à 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Après trois lavages dans le PBS, marquer les noyaux avec 0,4 microgramme par millilitre de DAPI et du Triton-X 0,5 % prérefroidi dans le PBS pendant 15 minutes sur de la glace, suivis de trois lavages finaux dans le PBS. Monter les lames avec des billes fluorescentes, selon les besoins expérimentaux et dans un milieu de montage approprié. Après avoir éliminé l'excès de milieu de montage à l'aide de lingettes stériles, sceller une lame couvre-objet sur chaque lame avec plusieurs couches de vernis incolore, puis utiliser un microscope à fluorescence pour confirmer la réussite de l'expérience.

Des images peuvent ensuite être prises au microscope confocal pour collecter des images des échantillons entre une heure et une semaine après le montage, avec un grossissement de 630 fois.