Détermination de la distribution de l'ARN viral dans les cellules hôtes par hybridation in situ en fluorescence

Commencez avec une lame contenant des cellules hôtes infectées par le virus et perméabilisées, au sein desquelles les ARN viraux sont répartis entre les compartiments nucléaire et cytoplasmique.

Ajouter un tampon de pré-hybridation et incuber dans des conditions humides.

Dans le tampon, les réactifs de blocage occupent les sites de liaison non spécifiques, tandis que les inhibiteurs d'ARNases inactivent les ARNases et préservent l'intégrité de l'ARN.

Éliminer le tampon et ajouter les sondes oligonucléotidiques dénaturées, marquées à la digoxigénine, complémentaires de l'ARN viral.

Incuber à l'abri de la lumière pour permettre l'hybridation sonde-ARN, puis laver plusieurs fois.

Ajouter un fixateur pour stabiliser les hybrides sonde-ARN, puis effectuer plusieurs lavages. Ajouter un tampon contenant un détergent pour maintenir la perméabilité cellulaire.

Ajouter un anticorps anti-digoxigénine conjugué à un fluorophore vert qui interagit avec la digoxigénine, puis laver répétitivement.

Fixer les cellules pour préserver les complexes, puis laver à nouveau.

Ajouter un colorant se liant à l'ADN pour colorer les noyaux. Laver l'excès de colorant à plusieurs reprises.

Monter avec un coverslip et le