Purification de vecteurs de virus adéno-associés par chromatographie d'affinité

Commencez avec un lysat cellulaire filtré contenant des vecteurs viraux adéno-associés (AAV) et des contaminants d'origine hôte.

Faites passer le lysat à travers une colonne d'affinité à base d'héparine.

Les protéines de l'capside virale se lient électrostatiquement aux groupes d'héparine chargés négativement.

Rincez la colonne avec un tampon pour éliminer les contaminants non liés.

Appliquer un tampon contenant un détergent pour solubiliser les débris membranaires.

Rincer à nouveau avec le tampon sans détergent.

Introduire un tampon supplémenté en cations afin de créer un environnement ionique, puis laver avec un tampon de force ionique modérée pour éliminer les impuretés faiblement liées.

Ajouter un tampon à haute force ionique pour rompre les interactions entre l'capside et l'héparine et éluer les particules virales.

Recueillir les fractions d'élution enrichies en particules virales intactes et les transférer dans des tubes de concentration centrifuge équipés de membranes filtrantes.

Faire centrifuger les tubes pour éliminer le tampon en excès, puis recueillir les fractions virales concentrées dans un tube.

Rincez la membrane avec le tampon pour récupérer les particules virales résiduelles et maximiser le rendement.

Décongeler le lysat brut à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Une fois décongelé, filtrer à l’aide d’un filtre de 0,22 micron. Juste avant les étapes de purification, passiver le concentrateur centrifuge en ajoutant quatre millilitres de tampon de prétraitement du filtre pour chaque colonne de sépharose héparinée utilisée. Placer le tube dans une pompe péristaltique.

Faites circuler les solutions et les milieux successivement. Préparez la chromatographie en fixant une colonne de sépharose héparine de cinq millilitres au tube, puis en faisant passer 25 millilitres de DMEM Bazell à travers la colonne. Chargez ensuite 0,2 micromolaire du lysat brut filtré sur la colonne à un débit de une à deux gouttes par seconde.

Lavez la colonne successivement pour éluer cinq millilitres cinq fois avec du HBSS contenant 300 millimolaire de chlorure de sodium, du magnésium et du calcium, et étiquetez les cinq élutions comme E1 à E5. Lorsque c'est prêt, faites tourner le concentrateur centrifuge contenant le tampon de prétraitement à 900 × g pendant deux minutes. Jetez le flux traversant. Lavez le filtre du concentrateur centrifuge avec quatre millilitres de HBSS contenant du magnésium et du calcium en centrifugeant à 1000 × g pendant deux minutes.

Ensuite, ajouter l'élution E2 au concentrateur centrifuge et centrifuger à 1000 ×g pendant cinq minutes. Jeter le flux traversant. De la même manière, centrifuger l'élution E3 dans le concentrateur centrifuge jusqu'à ce que le virus concentré atteigne environ un millilitre.

Retirer le virus concentré du concentrateur centrifuge à l’aide d’une pointe filtrante P200, et le recueillir dans un tube de centrifugation stérile de 1,5 millilitre. Après le prélèvement du virus, rincer le concentrateur centrifuge avec 200 microlitres de HBSS contenant du magnésium et du calcium. Pippeter vigoureusement de haut en bas pendant 30 secondes afin de détacher tout virus adhérent à la membrane, puis recueillir le virus concentré dans le même tube de centrifugation de 1,5 millilitre.

Mélanger soigneusement le tube.