Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 3:07 min • August 31st, 2026
Prenez une boîte de microinjection contenant une goutte de milieu de culture d'embryons au centre, recouverte d'huile minérale pour éviter l'évaporation.
Placer la boîte sous un microscope inversé.
Placer une capillaire de microinjection et une pipette de maintien sur un dispositif de micromanipulateur sous le microscope.
La capillaire de microinjection est chargée avec une suspension de vecteurs lentiviraux portant le transgène.
Ensuite, transférez les embryons de rat fécondés dans le milieu.
Fixer un embryon à l'aide de la pipette de maintien en appliquant une aspiration.
Avec un grossissement plus élevé, insérez la micropipette d'injection à travers l'enveloppe extracellulaire glycoprotéique de l'embryon, la zone pellucide, et injectez la suspension lentivirale dans l'espace périvitellin.
Ensuite, transférez les embryons injectés dans une boîte de culture et incubez-les.
Le virus pénètre dans l'embryon et libère son génome contenant le transgène dans le cytoplasme.
Ultérieurement, il est reverse transcrit en ADN et s'intègre dans le génome de l'embryon, incorporant le transgène.
Les embryons transduits sont désormais prêts à être traités.
Pour la microinjection de vecteurs lentiviraux sous la zone pellucide d'embryons au stade unidcellulaire, utilisez un tireur de pipettes pour préparer des capillaires en verre borosilicate pour microinjection avec un filament. Après chaque changement de filament ou chaque utilisation d'un nouveau capillaire en verre, effectuez un test de rampe pour définir les paramètres optimaux.
Ensuite, utilisez une pipette microloader pour charger environ deux microlitres de solution de lentivirus fraîchement décongelée par pipette de microinjection sous une hotte de flux laminaire de biosécurité. Ajoutez une goutte de 100 microlitres de milieu M2 au centre du couvercle d'une boîte de Pétri de 60 millimètres. Recouvrez le milieu d'huile minérale et fixez la pipette de maintien et la capillaire de microinjection chargée de virus sur un micromanipulateur.
Placer la boîte de microinjection sous un microscope inversé et transférer 15 à 20 embryons au stade uniloculaire dans la goutte de milieu M2 située dans la boîte de microinjection. Capturer un embryon à l’aide de la pipette de maintien et, en utilisant un grossissement de 400 fois ainsi que la capillaire en verre, injecter la solution de lentivirus sous la zone pellucide dans l’espace périvitellin, en maintenant la capillaire sous la zone pellucide pendant un instant après l’administration du virus. Une fois tous les embryons injectés, utiliser une pipette fine pour replacer les cellules injectées dans la boîte de culture, puis remettre la boîte dans l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à leur implantation.