Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
0 vues • 3:45 min • August 31st, 2026
Commencez avec une suspension de cellules bactériennes exprimant une intégrase virale marquée par un polyhistidine.
Soniquez la suspension pour rompre les membranes bactériennes et libérer l'intégrase.
Transférez le lysat dans un tube d'ultracentrifugation.
Centrifuger à grande vitesse pour faire précipiter les débris cellulaires et récupérer le surnageant.
Ensuite, prenez une colonne de chromatographie remplie de résine chargée en nickel et équilibrez-la avec du tampon.
Chargez le lysat clarifié sur la colonne.
Les protéines contenant des histidines se lient faiblement au nickel, tandis que l'intégrase portant une étiquette polyhistidine se lie fortement.
Lavez avec du tampon pour éliminer les protéines non liées, puis ajoutez le tampon d'élution avec une concentration croissante d'imidazole de manière linéaire.
L'imidazole entre en compétition avec l'histidine pour la liaison au nickel et libère l'intégrase.
Recueillir les fractions et transférer des aliquotes dans des tubes contenant du tampon de charge.
Chauffer pour dénaturer les protéines, puis charger sur un gel de polyacrylamide.
Réaliser l'électrophorèse et analyser les bandes protéiques.
Identifier les fractions contenant l'intégrase
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