Purification de l'intégrase virale par chromatographie d'affinité

Commencez avec une suspension de cellules bactériennes exprimant une intégrase virale marquée par un polyhistidine.

Soniquez la suspension pour rompre les membranes bactériennes et libérer l'intégrase.

Transférez le lysat dans un tube d'ultracentrifugation.

Centrifuger à grande vitesse pour faire précipiter les débris cellulaires et récupérer le surnageant.

Ensuite, prenez une colonne de chromatographie remplie de résine chargée en nickel et équilibrez-la avec du tampon.

Chargez le lysat clarifié sur la colonne.

Les protéines contenant des histidines se lient faiblement au nickel, tandis que l'intégrase portant une étiquette polyhistidine se lie fortement.

Lavez avec du tampon pour éliminer les protéines non liées, puis ajoutez le tampon d'élution avec une concentration croissante d'imidazole de manière linéaire.

L'imidazole entre en compétition avec l'histidine pour la liaison au nickel et libère l'intégrase.

Recueillir les fractions et transférer des aliquotes dans des tubes contenant du tampon de charge.

Chauffer pour dénaturer les protéines, puis charger sur un gel de polyacrylamide.

Réaliser l'électrophorèse et analyser les bandes protéiques.

Identifier les fractions contenant l'intégrase pure, sans aucune protéine contaminante, et les regrouper pour obtenir l'intégrase virale purifiée.

Commencez par décongeler un culot de E. coli exprimant l'intégrase du virus foamy prototype sur de la glace. Utilisez un sonicateur équipé d'une sonde biohorn de 0,5 pouce de diamètre avec une micro-pointe conique de 0,125 pouce de diamètre pour soniquer pendant 30 secondes à une amplitude de 30 %, le tube étant placé sur de la glace. Après la sonication, transférez l'échantillon cellulaire dans un tube d'ultracentrifugation prérefroidi et centrifugez à 120 000 × g pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, il devrait y avoir un culot bien visible, et le surnageant peut présenter une couleur jaune. Transférez le surnageant dans un tube conique de 50 millilitres froid. Ensuite, préparez la colonne FPLC de 110 millimètres de long et de cinq millimètres de diamètre, contenant 1,5 millilitre de résine chargée au nickel.

Commencez par raccorder la colonne à l'instrument de chromatographie liquide à haute performance (FPLC) et appliquez le tampon. L'instrument doit recueillir en temps réel les données de conductivité et d'absorbance UV à 280 nanomètres. Les mesures de conductivité et d'absorbance UV doivent se stabiliser.

Si nécessaire, continuez à faire circuler les tampons à travers la colonne jusqu'à ce que les mesures soient stables. À l’aide d’une boucle d’injection, chargez l’échantillon protéique sur la colonne à un débit de 0,15 millilitre par minute avec une limite de pression maximale de 0,5 mégapascal. Fixez la boucle d’injection à l’AKTA FPLC.

Après avoir lavé la colonne et élué les protéines, prélevez des aliquotes de 15 microlitres du flux initial, du lavage et des fractions présentant un pic d'absorbance à 280 nanomètres, puis ajoutez 15 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS-PAGE 2X à chaque échantillon. Faites bouillir les échantillons pendant trois minutes. Chargez 10 microlitres de chaque échantillon sur des gels SDS-PAGE à 10 %, ainsi que 4 microlitres d'étalons protéiques pré-colorés.

Inspecter visuellement le gel pour identifier les fractions qui semblent contenir une intégrase du virus foamy prototype presque pure. Combiner ces fractions et noter le volume lors du pipetage. Ce volume est généralement de huit à dix millilitres.