Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
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Commencez avec une culture de cellules épithéliales rénales humaines cultivées dans un milieu nutritif riche.
Remplacer le milieu par un milieu à faible teneur en sérum afin de minimiser les interférences du sérum et d'améliorer l'efficacité de la transfection.
Ajouter la mixture de transfection goutte à goutte sur les cellules.
Le mélange contient un ADN rétroviral portant le gène d'intérêt, un plasmide d'emballage fournissant les protéines virales essentielles, et de la polyéthylènimine, qui forme des complexes avec l'ADN plasmidique pour faciliter la transfection.
Incuber les cellules pour permettre la prise en charge du complexe d'ADN.
Remplacer le milieu pour éliminer les réactifs résiduels de transfection.
À l'intérieur de la cellule, l'ADN plasmidique pénètre dans le noyau, où il dirige la production de protéines virales et d'ARN viral portant le gène d'intérêt.
Ces composants s'assemblent et bourgeonnent dans le milieu sous forme de particules rétrovirales recombinantes.
Recueillir le milieu contenant le virus et le conserver brièvement à une basse température pour maintenir la stabilité virale.
Centrifuger pour former un culot des débris cellulaires.
Aliquoter le surnageant viral, l
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