Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
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Prélevez des surnageants de culture contenant des virions progéniteurs libérés à partir de cellules hôtes infectées soit par une variante test du VIH-1, soit par un témoin de type sauvage.
Le virus testé porte une variante génétique qui modifie l'efficacité de la réplication et affecte la production de particules virales progénitures.
Ajouter les surnageants à un mélange de transcription inverse contenant un nucléotide radiomarqué, un nucléotide non marqué, un ARN matrice, un initiateur, des cofacteurs, un détergent et des stabilisants.
Incuber pour permettre la formation du complexe matrice–amorce pendant que le détergent lyse les virions, libérant ainsi la transcriptase inverse, ou RT.
La RT synthétise de l'ADN à partir du complexe matrice–amorce, incorporant le nucléotide radiomarqué.
Transférez les échantillons sur une membrane de liaison aux acides nucléiques et laissez-les sécher à l'air pour immobiliser l'ADN marqué radioactivement.
Laver répétitivement avec du tampon et de l'éthanol sous agitation pour éliminer les composants non liés.
Laisser sécher à l'air et envelopper la membrane. L'exposer à un écran sensible au rayonnement et détecter les signaux à l'aide d'un phosphorimager
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