Name: Dans la formation de biofilms in vitro dans une diapositive Chambre de 8 puits (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-20T18:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Découvrez la formation de biofilms bactériens in vitro dans une chambre à 8 puits. Cette méthode permet d'étudier la cinétique et l'architecture des biofilms par microscopie confocale.

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Le travail a été financé par NIDCD / NIH R01DC003915 à LO Bakaletz.

1. Dans la formation de biofilms in vitro <ol><li> Les colonies bactériennes (qui ont été cultivés sur gélose appropriée durant la nuit), ont été suspendues dans les médias et la DO 490 a été ajusté à 0,65 </li><li> La suspension résultante bactérienne est ensuite diluée 1:6 (1 ml de suspension bactérienne + 5 ml préchauffé moyenne) et incubées à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant environ 3 heures pour atteindre la mi-phase log. </li><li> Diluer le 1:2500 mi-log croissance en suspension avec des pré-chauffé les médias et le lieu 200 ul de dilution dans chaque puits d'une lame de chambre 8-même. </li><li> Incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Après environ 16 heures, moyenne aspirer à partir du coin de chaque chambre et ajouter 200 ul frais, pré-chauffé moyen - long dispenser paroi de la chambre afin de ne pas créer des forces de cisaillement dans la chambre qui pourrait perturber le biofilm. </li><li> Si l'incubation de plus de 24 heures, changement de milieu tous les 12 heures ou au besoin pour maintenir la viabilité bactérienne. </li></ol> 2. Visualisation des biofilms <ol><li> Aspirer moyennes de chaque chambre, comme décrit ci-dessus, et laver deux fois par biofilm résidents doucement avec une solution saline stérile. </li><li> Ajouter 200 ul de BacLight Live / Dead tache (3 uL composante A + 3 B composante ul par ml de solution saline) dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Protéger la culture de la lumière à partir de ce point. </li><li> Aspirer la tache et laver deux fois délicatement avec une solution saline stérile comme avant. </li><li> Ajouter 200 ul du formol tamponné neutre à chaque puits et incuber pendant 30 minutes à température ambiante pour fixer spécimen. </li><li> Retirer fixateur et éliminer correctement conformément aux directives institutionnelles. </li><li> Laver deux fois avec une solution saline et d'éliminer les fluides de lavage qui contiennent du formol comme ci-dessus. </li><li> Retirez le puits en plastique de la lame, ajouter suffisamment de solution saline pour chaque puits de sorte que quand une lamelle est placée sur le joint, pas de bulles d'air sont présents. </li><li> Lamelle et sceller les bords de la lamelle avec un milieu de montage. Le vernis à ongles peut être utilisée pour sceller les diapositives cependant les diapositives ne seront pas aussi permanente. </li><li> Laisser le scellant sécher pendant environ 1 heure avant d'examiner par microscopie. </li></ol> 3. Résultats <img src="/files/ftp_upload/2481/2481fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Représentant 3D des images composites d'un biofilm formé dans une chambre de diapositives 8-même. Les bactéries ont été marqués avec Live / Dead tache où des bactéries vivantes fluorescence verte et les bactéries mortes émettent une fluorescence rouge. (A) Image composite du biofilm ensemble montrant l'architecture distincte avec des tours et des canaux d'eau. (B) Même que dans le biofilm (A), maintenant vu en coupe transversale.

<ol><li>Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms+in+otitis+media%3A+evidence+and+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms in otitis media: evidence and relevance.</a> Pediatr Infect Dis J. 26, Suppl 10. S17-S19 (2007).</li>
<li>Heydorn, A., Nielsen, A. T., Hentzer, M., Sternberg, C., Givskov, M., Ersboll, B. K., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li>
</ol>

Comprendre le mécanisme par lequel former des biofilms, ainsi que la caractérisation de leurs composants de la matrice, est un domaine d&#39;intérêt intense. Ce protocole peut être utilisé pour aider à identifier les protéines ou d&#39;autres constituants qui contribuent à l&#39;intégrité structurale du biofilm, ainsi que d&#39;identifier et de cibler des protéines qui peuvent se prêter à une application thérapeutique. Le temps d&#39;incubation et des dilutions dans le protocole ci-dessus décrits ont été établies pour la formation de biofilm optimale par l&#39;Haemophilus influenzae non typables (NTHi). Certains travaux préliminaires pourraient être nécessaires afin d&#39;optimiser ces étapes pour d&#39;autres espèces bactériennes (ie dilution initiale et le temps d&#39;incubation nécessaire pour atteindre la mi-log phase de croissance). La dilution 1:2500 pour l&#39;ensemencement initial des chambres a été établi pour s&#39;assurer que le biofilm robuste se développe dans la chambre de diapositives comme induite par cet organisme et dans le temps d&#39;incubation a déclaré, sans le biofilm envahit la chambre et / ou épuiser les éléments nutritifs disponibles . En conséquence, la dilution initiale et ou de temps d&#39;incubation peut être nécessaire d&#39;ajuster pour les autres espèces bactériennes.

<table><tbody><tr><td>Agar au chocolat II</td><td>Fisher Scientific</td><td>B21267X</td><td></td></tr><tr><td>Lames à 8 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-656-18</td><td></td></tr><tr><td>Kit de viabilité bactérienne BacLight Live/Dead</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9439023</td><td></td></tr><tr><td>BHI</td><td>Fisher Scientific</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>Hémine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5533</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage Permaslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9693613</td><td></td></tr></tbody></table>

dans la formation de biofilms in vitro dans une diapositive chambre de 8 puits

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

La nature chronique de nombreuses maladies est attribué à la formation de biofilms bactériens qui sont récalcitrants à l&#39;antibiothérapie classique. Les biofilms sont communautaires associés bactéries attachées à une surface et enfermé dans une matrice. Le rôle de la matrice extracellulaire est multiforme, notamment en facilitant l&#39;acquisition des nutriments, et offre une protection significative contre les stress environnementaux (réponses de l&#39;hôte, par exemple immunitaire). Dans un effort pour acquérir une meilleure compréhension de comment les bactéries dans un biofilm de répondre aux contraintes environnementales, nous avons utilisé un protocole dans lequel nous visualisons les biofilms bactériens, qui se sont formées dans une chambre de diapositives 8-même. Les biofilms ont été colorés avec du BacLight Live / Dead taches et examinés à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal pour caractériser la taille du biofilm relative, et la structure sous différentes conditions d&#39;incubation. Z-stack images ont été recueillies par microscopie confocale et analysées par COMSTAT. Ce protocole peut être utilisé pour aider à élucider le mécanisme et la cinétique par lequel former des biofilms, ainsi que d&#39;identifier les éléments qui sont importants pour la structure du biofilm et la stabilité.

Cet article décrit la procédure pour la formation et la visualisation d&#39;un biofilm bactérien grandi au sein d&#39;une chambre de glisser de 8 puits

Dans la formation de biofilms in vitro dans une diapositive Chambre de 8 puits

Le caractère chronique de nombreuses maladies est attribué à la formation de biofilms bactériens, lesquels sont résistants aux thérapies antibiotiques conventionnelles. ...

L'objectif général de cette procédure est de faire croître des biofilms bactériens dans les puits d'une lamelle-chambre. Chaque puits est d'abord ensemencé avec des bactéries en milieu de croissance, puis cultivé à 37 degrés Celsius. Une fois les biofilms formés, un colorant vital est utilisé pour colorer les cellules.Les biofilms sont ensuite lavés et fixés, puis les puits sont scellés à l’aide d’une lame couvre-objet. Enfin, les cellules peuvent être observées par microscopie confocale et la morphologie des différents biofilms caractérisée. Un avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les cellules d’écoulement, est que les volumes sont beaucoup plus faibles et réduisent ainsi la quantité de tout composé expérimental utilisé.En outre, un plus grand nombre de variables peut être comparé simultanément dans une lame à huit puits par rapport à une cellule d'écoulement à trois chambres. Cette méthode pourrait aider à répondre à plusieurs questions clés dans le domaine de la microbiologie, telles que la cinétique de la formation des biofilms. Elle peut également fournir des informations sur diverses maladies comportant un composant biofilm, comme l'otite moyenne chronique, la mucoviscidose et les infections chroniques de la vessie, pour n'en citer que quelques-unes.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car de nombreuses étapes risquent de perturber artificiellement le biofilm existant. Par conséquent, une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d'élimination et d'ajout de liquide sont difficiles à apprendre, et le risque de perturber le biofilm en raison des forces de cisaillement est maximal à ces moments du protocole. La procédure sera démontrée aujourd'hui par Liz, une étudiante diplômée du laboratoire. Inoculer les bactéries dans un milieu de culture liquide, puis incuber la culture jusqu'à ce qu'elle atteigne la phase exponentielle moyenne. Diluer la suspension en phase exponentielle moyenne au ratio de un à 2 500 dans un milieu préchauffé pour *Haemophilus influenzae* non typable, qui est utilisé dans cet exemple.Cela permettra d'obtenir 40 000 unités formant colonies par millilitre comme concentration initiale. Transférez aseptiquement 200 microlitres de culture diluée dans chaque puits d'une lame à chambre stérile à huit puits. Incubez la lame à 37 degrés Celsius dans un incubateur contenant 5 % de dioxyde de carbone afin de permettre aux bactéries de commencer à former des biofilms 16 à 18 heures plus tard.Retirer la lamelle de l'incubateur et aspirer le milieu à partir du coin de chaque chambre. Le remplacer ensuite par 200 microlitres de milieu préchauffé frais. Veiller à dispenser le nouveau milieu le long de la paroi des chambres afin d'éviter de perturber les biofilms.Replacer la lame dans l'incubateur et laisser les cultures croître jusqu'à la densité souhaitée. Remplacer le milieu toutes les huit à 16 heures afin de maintenir la viabilité bactérienne. Pour visualiser les biofilms, retirer d'abord les surnageants de culture comme décrit précédemment, puis laver doucement les biofilms deux fois à l'aide de 200 microlitres de solution saline stérile.Une fois les biofilms lavés, ajouter 200 microlitres de colorant vésiculaire vivant-mort à chaque puits d'une lame à huit puits. Préparer un total de deux millilitres de solution de colorant. Incuber la lame à l'abri de la lumière, à température ambiante, pendant 15 minutes.À partir de cette étape, veillez à protéger la lame de la lumière. Incubez la lame à l’abri de la lumière, à température ambiante, pendant 15 minutes. Une fois les cellules colorées, retirez le colorant vivant-mort et lavez chaque puits deux fois avec du sérum physiologique.Comme indiqué précédemment, ajouter 200 microlitres de formol tamponné neutre dans chaque puits et incuber la lame à température ambiante pendant au moins 30 minutes pour fixer l'échantillon. Après cette incubation, retirer et jeter le fixateur, puis laver les biofilms deux fois à l'aide de solution saline. Retirer les puits en plastique de la lame et ajouter environ 150 microlitres de solution saline dans chaque puits. Couvrir les puits en plaçant une lamelle sur le joint, en veillant à ne pas introduire de bulles, puis sceller les bords de la lamelle avec du milieu de montage.Alternativement, du vernis à ongles peut être utilisé pour sceller la lame. Dans cet exemple, nous utilisons du vernis à ongles. Pour une meilleure visualisation de la procédure, laissez le scellant sécher à température ambiante pendant au moins une heure avant d'examiner les biofilms au microscope. Cette image est une reconstruction tridimensionnelle d'images Zack d'un biofilm de H influenza coloré en vivant-mort, recueillies à l'aide d'un microscope confocal.Le biofilm illustré ici est un exemple de biofilm formé par le NTHI après 24 heures de croissance dans la lamelle-chambre. Grâce à cette technique, les bactéries étaient viables au moment de la fixation, comme l'indique la fluorescence verte et l'absence de fluorescence rouge. L'architecture du biofilm est nettement visible, avec de nombreuses tours au sein de la structure du biofilm et de nombreux canaux d'eau présents.La vue latérale du panneau B illustre la hauteur relative du biofilm formé à ce moment précis. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'ajouter et de retirer les fluides du puits lentement afin de minimiser la génération de forces de cisaillement pouvant perturber le biofilm présent dans le puits. En suivant cette procédure, d'autres méthodes telles que le marquage immunologique pour des protéines spécifiques d'intérêt ou le marquage par lectine peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les composants biochimiques présents dans la matrice formée par les bactéries dans le biofilm.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser une lame à huit puits pour étudier la formation de biofilms bactériens.

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