C. elegans à l'apprentissage butanone, à court terme et à long terme Tests mémoire associative

L'objectif général de l'expérience suivante est de tester la mémoire à court et à long terme d'une association positive apprise entre la nourriture et l'attractant chimique butane, en utilisant C. elegans comme modèle. Ceci est réalisé en privant de nourriture pendant une heure des vers jeunes adultes synchronisés et bien nourris.

Ensuite, les vers sont entraînés en présence de nourriture et de butanone, par un conditionnement massé pour la mémoire associative à court terme, et par un conditionnement espacé pour la mémoire associative à long terme. Après l'entraînement, la chimiotaxie vers la butanone est mesurée et comparée à la chimiotaxie de vers naïfs. Pour étudier la rétention de la mémoire, des résultats sont obtenus qui montrent la durée de la mémoire associative à court et à long terme de l'association apprise entre la nourriture et la butanone, en se basant sur les variations de l'indice d'apprentissage.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du vieillissement cognitif et des maladies, telles que quelles voies génétiques sont nécessaires au fonctionnement neuronal lors du vieillissement normal et dans les états de maladies neurodégénératives, et comment les apprentissage et mémoire peuvent être améliorés. En cas de déficit cognitif, les vers sont préparés selon des méthodes standard sur des boîtes de milieu de croissance hautes de 100 millimètres, ensemencées avec un millilitre de E. coli OP50. Utilisez des adultes jeunes à une densité d’environ 5 000 vers ou moins par boîte.

Recueillir les vers en versant délicatement du tampon M nine sur la plaque et en faisant tournoyer doucement pour détacher les vers. S'efforcer de minimiser l'agitation, qui pourrait déloger des bactéries indésirables. Ensuite, incliner la plaque et prélever le mélange tampon-vers à partir du coin.

À l'aide d'une pipette P1000, transférez les vers dans un tube conique de 15 millilitres. Veillez à ne pas pipeter les vers contre la paroi si des vers restent sur la plaque.

Répétez cette étape une à deux fois. Laissez les vers se déposer au fond du tube par gravité. La centrifugation n'est pas recommandée pour obtenir les meilleurs résultats.

Une fois les vers en sédimentation, éliminer le surnageant par aspiration et laver avec au moins trois à quatre millilitres de tampon M9. Travailler rapidement pour éviter la privation. Répéter cette procédure deux fois, pour un total de trois lavages.

À ce stade, un groupe de vers peut être mis de côté pour servir de groupe naïf dans les tests de chimiotaxie qui seront démontrés ultérieurement. Pour préconditionner les vers avant l'entraînement, ajouter trois à quatre millilitres de tampon M9 dans le tube et laisser les vers jeûner à température ambiante pendant une heure. Préparer les boîtes de conditionnement en déposant deux microlitres de butane à 10 % dans de l'éthanol à 95 % à l'intérieur des couvercles de boîtes de milieu NGM de 60 millimètres, préalablement ensemencées avec 500 microlitres de E. coli OP50. Retirer le surnageant du tube contenant les vers affamés et utiliser une pipette P1000 pour transférer de 100 à 200 microlitres de vers vers chaque boîte de conditionnement. Incuber les boîtes de conditionnement à température ambiante pendant une heure après le conditionnement.

Lavez les vers à partir des boîtes avec environ un millilitre de tampon M neuf et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Répétez les méthodes de lavage doux démontrées précédemment jusqu'à ce que le tampon apparaisse clair. Une fois le lavage effectué, un sous-ensemble de vers peut être prélevé et testé dans le test de chimiotaxie afin de constituer le groupe temps zéro pour l'apprentissage associatif à une fois la concentration maximale, puis préparez des boîtes représentant des points temporels supplémentaires.

Transférez 100 à 200 microlitres de vers vers des boîtes de Petri NGM de 60 millimètres ensemencées. Incubez ces boîtes après conditionnement pendant 0,51 ou deux heures à température ambiante. Après chaque point temporel, rincez délicatement les vers des boîtes dans un tube conique de 15 millilitres et répétez une ou deux fois supplémentaires.

Avec le tampon M neuf en suivant les mêmes procédures de lavage douces, la mémoire associative à court terme est testée à l’aide du test de chimiotaxie, qui sera démontré ultérieurement. Préparez les boîtes de conditionnement et les vers comme indiqué pour l’entraînement à court terme, mais laissez les vers s’incuber à température ambiante pendant seulement 30 minutes. Après l’incubation, récupérez les vers comme précédemment indiqué.

Les transférer vers des plaques NGM de 60 millimètres NON ENSEMENCÉES. Maintenir les vers sur les plaques non ensemencées à température ambiante pendant 30 minutes. Une fois que les vers sont privés de nourriture, les laver avec du tampon M neuf et les remettre dans le tube conique de 15 millilitres. Répéter ces étapes jusqu'à ce qu'un total de sept blocs de conditionnement et six blocs de privation alimentaire aient été réalisés.

Lorsque le conditionnement est terminé, lavez les vers des plaques de conditionnement vers un tube conique. Comme indiqué précédemment, une cohorte de vers peut être utilisée pour tester un apprentissage associatif espacé sur sept séances immédiatement après le conditionnement. Transférez la population restante de vers sur des plaques HGM de 100 millimètres ensemencées avec un millilitre d'OP50.

Appliquez à nouveau 100 à 200 microlitres de vers par boîte pour vous assurer qu’il y a suffisamment de bactéries pour soutenir la population. Incubez les boîtes après conditionnement à 20 degrés Celsius pendant 1624 ou 40 heures, représentant les points temporels de mémoire associative à long terme, afin de tester la mémoire associative à long terme de l’association connue entre la nourriture et le butan. Lavez délicatement les vers des boîtes dans un tube conique de 15 millilitres, puis rincez-les une à deux fois avec du tampon M neuf après chaque point temporel, et soumettez les vers au test de l’essai de chimotaxie.

Pour préparer les plaques de test de chimiotaxie, marquer le fond des plaques NGM de 100 millimètres non couvertes avec des points situés près du bord à trois endroits comme indiqué ici. Déposer un microlitre de NaN₃ à une molaire sur les points d'odeur et les points de contrôle. Effectuer cette étape moins de 15 minutes avant le début du test afin de minimiser la diffusion des agents paralysants.

Placez ensuite une microlitre d'éthanol à 95 % et une microlitre de butanone à 10 % sur les emplacements appropriés de la plaque d'essai marquée, directement au-dessus de l'azoture de sodium précédemment déposé. Éliminez autant que possible le tampon M neuf du tube contenant les vers décantés.

Utilisez une pipette P20 avec une pointe pré-découpée pour délivrer 15 microlitres de vers en trois intervalles de cinq microlitres chacun à l'origine de la plaque d'essai. Ensuite, torsadez un coin d'un essuie-tout Kim pour le réduire en une petite pointe et utilisez-le pour absorber l'excès de tampon M neuf. Veillez à ne pas percer l'agar.

Le retrait du tampon en excès libère les vers sur la plaque d'essai. Si l'on utilise l'imagerie pour compter les vers, une image de l'origine immédiatement après cette libération donnera le nombre total d'animaux par plaque d'essai. Incuber la plaque d'essai de chimiotaxie pendant une heure à température ambiante après l'incubation, puis compter le nombre de vers aux points d'origine, d'éthanol et de butanone, ainsi que le nombre total de vers sur la plaque d'essai.

En général, les vers paralysés par l'azoture de sodium se trouveront dans un rayon d'un centimètre autour des points et apparaîtront droits et rigides. Lorsque de nombreux animaux sont empilés les uns contre les autres, les vers peuvent être comptés manuellement ou quantifiés à l'aide de logiciels d'imagerie et d'analyse. Nous préférons cette dernière méthode pour la facilité et la fiabilité des résultats.

Une fois les vers aux points d'origine des taches d'éthanol et de butanone quantifiés, calculez l'indice KeyAx comme indiqué ici. L'indice de chimiotaxie typique chez les vers de type sauvage naïfs en réponse à la butanone à 10 % est d'environ 0,2. Un entraînement massé ou espacé augmente généralement l'indice de CHIMIOTAXIE à 0,7-0,8 à l'instant zéro, ce qui donne un indice d'apprentissage d'environ 0,6.

La chimiotaxie naïve est très sensible aux conditions adéquates d'élevage des vers. Cette figure illustre la différence marquée de l'indice de chimiotaxie (CI) entre des vers naïfs bien nourris et des vers naïfs privés de nourriture, soulignant ainsi l'importance d'une technique appropriée. La rétention de la mémoire se manifeste par le temps nécessaire pour que l'indice de chimiotaxie revienne aux niveaux naïfs lorsque l'indice d'apprentissage atteint zéro chez des animaux de type sauvage.

La mémoire associative à court terme commence à décliner une heure après un entraînement intensif d'environ deux heures et est indépendante du facteur de transcription kreb par comparaison. La mémoire associative à long terme ne commence généralement pas à décliner de manière significative avant 16 heures après un entraînement espacé pouvant durer jusqu'à 40 heures et dépend du gène Creb. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les tests de chimiotaxie peuvent être influencés par la privation de nourriture ou des odeurs excessives dans l'environnement, et que la mémoire des vers peut être perturbée par une agitation physique trop importante.