Name: C. elegans à lapprentissage butanone, à court terme et à long terme Tests mémoire associative (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Découvrez les tests de mémoire associative à court et long terme chez C. elegans utilisant la butanone et la chimiotaxie. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes neuronaux de l'apprentissage.

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Nous remercions W. Ryu pour des conseils sur notre imagerie configuration initiale, Z. Gitaï à la suggestion d&#39;utiliser ImageJ 13 pour compter les vers, et J. Achraf pour les aider avec Google SketchUp. CTM est une bourse d&#39;études Pew dans les sciences biomédicales, un chercheur McKnight, et chercheur Keck.

<ol><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-515 (1993).</li>
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<li>Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+integrates+the+signals+of+butanone+and+food+to+enhance+chemotaxis+to+butanone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone.</a> J Neurosci. 27, 741-741 (2007).</li>
<li>Silva, A. J., Kogan, J. H., Frankland, P. W., Kida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CREB+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CREB and memory.</a> Annu Rev Neurosci. 21, 127-127 (1998).</li>
<li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+image+transformations+for+an+automatic+screening+of+cervical+smears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Iterative image transformations for an automatic screening of cervical smears.</a> J Histochem Cytochem. 27, 128-128 (1979).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-62 (1979).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-71 (1974).</li>
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<li>Abramoff, M. agelhaes, Ram, P. J., J, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-36 (2004).</li>
</ol>

Le C. elegans apprentissage olfactif associatif et des dosages de mémoire présenté ici de distinguer entre les processus de l&#39;apprentissage massé, l&#39;apprentissage espacées, mémoire à court terme, et mémoire à long terme. Ces tests s&#39;appuient sur ​​les capacités des vers au sens des odeurs alimentaires et chimiques dans leur environnement et 1,2 pour former des associations positives entre les deux. 6 Par conséquent, les dosages sont très sensibles à la famine dans la population de départ des animaux, et un grand soin doit être prises pour s&#39;assurer que les vers sont bien nourris, avant et après la formation. Simple formation massés rendements à court terme la mémoire associative. L&#39;augmentation du nombre de périodes de conditionnement et le paradigme de formation espacées est essentiel pour parvenir à long terme la mémoire associative en C. elegans comme il est dans d&#39;autres organismes. Peut-être 6,8 ce test pourrait être modifié pour produire souvenirs à long terme des associations entre les différents stimuli conditionnés ou non conditionnés. Notre apprentissage associatif et les tests de mémoire peuvent être utilisées pour comparer les capacités d&#39;apprentissage et de mémoire de type sauvage au vieillissement ou génétique des animaux mutants. Par exemple, alors que les deux apprentissage associatif et à long terme la mémoire associative diminution des capacités dans le vieillissement vers de type sauvage, l&#39;apprentissage est maintenu plus longtemps avec l&#39;âge chez les animaux avec signalisation de l&#39;insuline réduite, et de l&#39;apprentissage et la mémoire est maintenue plus longtemps avec l&#39;âge chez les animaux calorique restreints 6. Ces tests sont également prête à l&#39;ARNi traitement ou la manipulation pharmacologique de C. elegans. Par exemple, le traitement des vers avec daf-2 améliore l&#39;ARNi à court et à long terme la mémoire associative, à l&#39;inverse, le blocage de la transcription génique et la synthèse des protéines avec des médicaments (actinomycine D et la cycloheximide, respectivement) pendant l&#39;entraînement espacés perturbe la formation de la mémoire à long terme. 6 Mémoire à long terme est un processus qui est crucial pour la survie de tous les animaux, et il semble que la plupart des machines moléculaires impliqués dans la mémoire d&#39;une association pavlovien est conservée par les vers pour les mammifères. 6 La capacité de distinguer et de tester l&#39;apprentissage associatif, court terme et mémoire à long terme l&#39;utilisation de ces tests olfactifs fait C. elegans un excellent système pour l&#39;étude plus approfondie de la mémoire, et peut donner un aperçu des processus neurodégénératifs qui conduisent à la perte de l&#39;apprentissage et la mémoire chez les humains.

<table><tbody><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227</td><td>Préparer une concentration de 1 M dans de l'eau distillée</td></tr><tr><td>Alcool éthylique à 190 degrés</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>DSP-CT-18</td><td>&amp;gt;95 % d'éthanol peuvent contenir des impuretés qui interfèrent avec les tests de chimiotaxie</td></tr><tr><td>2-Butanone 99+%</td><td>Acros Organics</td><td>14967-0010</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CMOS à balayage surfacique Basler IEEE-1394/FireWire</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT56-683</td><td></td></tr><tr><td>Objectif vidéo InfiniMite &amp;#8211; Alpha Industrial</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT56-202</td><td></td></tr><tr><td>Éclaireur à fibre optique Dolan-Jenner MI-150</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT55-718</td><td></td></tr><tr><td>Rétroéclairage 8&amp;#8221; x 8&amp;#8221;</td><td>Schott AG</td><td>A08927</td><td></td></tr><tr><td>Pied standard</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT54-120</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur de tige 3/4&amp;#8221; pour pieds</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT54-124</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de montage fixe standard 1/4-20</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT54-122</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans à l&#39;apprentissage butanone, à court terme et à long terme tests mémoire associative

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

La mémoire des expériences et des informations apprises est essentiel pour les organismes de faire des choix que l&#39;aide à leur survie. C. elegans navigue son environnement grâce à des neurones spécifiques de détection des odeurs de nourriture et de produits chimiques 1, 2, et peut associer des États nutritive avec 3 odeurs chimiques, température de 4, et la pathogénicité d&#39;une source de 5 nourriture. Ici, nous décrivons des dosages de C. elegans apprentissage associatif et à court et à long terme la mémoire associative. Nous avons modifié un paradigme d&#39;apprentissage aversif olfactive au lieu de 6 à produire une réponse positive, l&#39;épreuve consiste à affamer les vers ~ 400, puis nourrir les vers à la présence de l&#39;AWC neurone-butanone senti chimioattractive volatiles à une concentration qui provoque un index chimiotactique faible (similaires d&#39;Toroyama et al. 7). Une population standard chimiotactisme assay1 essais attrait des vers à l&#39;odorant immédiatement ou minutes à quelques heures après le conditionnement. Après chimiotactisme conditionné, animaux de type sauvage »aux augmentations de butanone ~ 0,6 unités Indice chimiotactisme, son« indice de l&#39;apprentissage &quot;. L&#39;apprentissage associatif est dépendante de la présence de la nourriture et le butanone pendant la formation. Accord mets et de butanone pour une période de conditionnement unique («formation massés&quot;) produit à court terme la mémoire associative, qui dure environ 2 heures. Périodes de conditionnement multiples avec des périodes de repos entre («formation espacées») des rendements à long terme la mémoire associative (&lt;40 heures), et est dépendante de la protéine AMPc Element Binding Réponse (CREB), 6 un facteur de transcription requis pour mémoire à long terme à travers espèces 8. Notre protocole comprend également des méthodes d&#39;analyse d&#39;image pour la détermination rapide et précise des indices de chimiotactisme. Haut contraste des images d&#39;animaux sur les plaques de dosage chimiotactisme sont capturés et analysés par un logiciel de comptage dans le ver MatLab. Le logiciel corrige pour le fond inégale en utilisant une transformation tophat morphologiques. Méthode 9 Otsu est ensuite utilisé pour déterminer un seuil pour les vers séparer de l&#39;arrière-plan. 10 très petites particules sont supprimés automatiquement et les grands non-ver régions (bords de la plaque ou de poinçons agar) sont enlevé par sélection manuelle. Le logiciel évalue alors la taille du seul ver, en ignorant les régions qui sont au-dessus d&#39;une taille maximale spécifiée et en prenant la taille médiane des autres régions. Le nombre de vers est alors estimée en divisant la superficie totale occupée par identifiés comme des vers par la taille estimée d&#39;un seul ver. Nous avons constaté que l&#39;apprentissage et à court terme et mémoire à long terme peuvent être distingués, et que ces processus partagent les mêmes molécules clés avec les organismes supérieurs. 6,8 Nos tests peuvent tester rapidement nouveaux gènes candidats ou des molécules qui affectent l&#39;apprentissage et à court ou à long terme de mémoire en C. elegans qui sont pertinents à travers les espèces.

Nous décrivons ici les méthodes d&#39;essais de C. elegans apprentissage associatif et à court et à long terme la mémoire associative. Ces dosages de la population utilisent les capacités des vers à chemotax vers odorants volatils, et de former des associations positives sur les accords mets butanone chimiotactique. Augmenter le nombre de périodes de conditionnement induit mémoire à long terme.

C. elegans à l&#39;apprentissage butanone, à court terme et à long terme Tests mémoire associative

La mémoire des expériences et des informations acquises est cruciale pour que les organismes puissent faire des choix favorisant leur survie. C. elegans navigue dans son environnement...

L'objectif général de l'expérience suivante est de tester la mémoire à court et à long terme d'une association positive apprise entre la nourriture et l'attractant chimique butane, en utilisant C. elegans comme modèle. Ceci est réalisé en privant de nourriture pendant une heure des vers jeunes adultes synchronisés et bien nourris.Ensuite, les vers sont entraînés en présence de nourriture et de butanone, par un conditionnement massé pour la mémoire associative à court terme, et par un conditionnement espacé pour la mémoire associative à long terme. Après l'entraînement, la chimiotaxie vers la butanone est mesurée et comparée à la chimiotaxie de vers naïfs. Pour étudier la rétention de la mémoire, des résultats sont obtenus qui montrent la durée de la mémoire associative à court et à long terme de l'association apprise entre la nourriture et la butanone, en se basant sur les variations de l'indice d'apprentissage.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du vieillissement cognitif et des maladies, telles que quelles voies génétiques sont nécessaires au fonctionnement neuronal lors du vieillissement normal et dans les états de maladies neurodégénératives, et comment les apprentissage et mémoire peuvent être améliorés. En cas de déficit cognitif, les vers sont préparés selon des méthodes standard sur des boîtes de milieu de croissance hautes de 100 millimètres, ensemencées avec un millilitre de E. coli OP50. Utilisez des adultes jeunes à une densité d’environ 5 000 vers ou moins par boîte.Recueillir les vers en versant délicatement du tampon M nine sur la plaque et en faisant tournoyer doucement pour détacher les vers. S'efforcer de minimiser l'agitation, qui pourrait déloger des bactéries indésirables. Ensuite, incliner la plaque et prélever le mélange tampon-vers à partir du coin.À l'aide d'une pipette P1000, transférez les vers dans un tube conique de 15 millilitres. Veillez à ne pas pipeter les vers contre la paroi si des vers restent sur la plaque.Répétez cette étape une à deux fois. Laissez les vers se déposer au fond du tube par gravité. La centrifugation n'est pas recommandée pour obtenir les meilleurs résultats.Une fois les vers en sédimentation, éliminer le surnageant par aspiration et laver avec au moins trois à quatre millilitres de tampon M9. Travailler rapidement pour éviter la privation. Répéter cette procédure deux fois, pour un total de trois lavages.À ce stade, un groupe de vers peut être mis de côté pour servir de groupe naïf dans les tests de chimiotaxie qui seront démontrés ultérieurement. Pour préconditionner les vers avant l'entraînement, ajouter trois à quatre millilitres de tampon M9 dans le tube et laisser les vers jeûner à température ambiante pendant une heure. Préparer les boîtes de conditionnement en déposant deux microlitres de butane à 10 % dans de l'éthanol à 95 % à l'intérieur des couvercles de boîtes de milieu NGM de 60 millimètres, préalablement ensemencées avec 500 microlitres de E. coli OP50. Retirer le surnageant du tube contenant les vers affamés et utiliser une pipette P1000 pour transférer de 100 à 200 microlitres de vers vers chaque boîte de conditionnement. Incuber les boîtes de conditionnement à température ambiante pendant une heure après le conditionnement.Lavez les vers à partir des boîtes avec environ un millilitre de tampon M neuf et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Répétez les méthodes de lavage doux démontrées précédemment jusqu'à ce que le tampon apparaisse clair. Une fois le lavage effectué, un sous-ensemble de vers peut être prélevé et testé dans le test de chimiotaxie afin de constituer le groupe temps zéro pour l'apprentissage associatif à une fois la concentration maximale, puis préparez des boîtes représentant des points temporels supplémentaires.Transférez 100 à 200 microlitres de vers vers des boîtes de Petri NGM de 60 millimètres ensemencées. Incubez ces boîtes après conditionnement pendant 0,51 ou deux heures à température ambiante. Après chaque point temporel, rincez délicatement les vers des boîtes dans un tube conique de 15 millilitres et répétez une ou deux fois supplémentaires.Avec le tampon M neuf en suivant les mêmes procédures de lavage douces, la mémoire associative à court terme est testée à l’aide du test de chimiotaxie, qui sera démontré ultérieurement. Préparez les boîtes de conditionnement et les vers comme indiqué pour l’entraînement à court terme, mais laissez les vers s’incuber à température ambiante pendant seulement 30 minutes. Après l’incubation, récupérez les vers comme précédemment indiqué.Les transférer vers des plaques NGM de 60 millimètres NON ENSEMENCÉES. Maintenir les vers sur les plaques non ensemencées à température ambiante pendant 30 minutes. Une fois que les vers sont privés de nourriture, les laver avec du tampon M neuf et les remettre dans le tube conique de 15 millilitres. Répéter ces étapes jusqu'à ce qu'un total de sept blocs de conditionnement et six blocs de privation alimentaire aient été réalisés.Lorsque le conditionnement est terminé, lavez les vers des plaques de conditionnement vers un tube conique. Comme indiqué précédemment, une cohorte de vers peut être utilisée pour tester un apprentissage associatif espacé sur sept séances immédiatement après le conditionnement. Transférez la population restante de vers sur des plaques HGM de 100 millimètres ensemencées avec un millilitre d'OP50.Appliquez à nouveau 100 à 200 microlitres de vers par boîte pour vous assurer qu’il y a suffisamment de bactéries pour soutenir la population. Incubez les boîtes après conditionnement à 20 degrés Celsius pendant 1624 ou 40 heures, représentant les points temporels de mémoire associative à long terme, afin de tester la mémoire associative à long terme de l’association connue entre la nourriture et le butan. Lavez délicatement les vers des boîtes dans un tube conique de 15 millilitres, puis rincez-les une à deux fois avec du tampon M neuf après chaque point temporel, et soumettez les vers au test de l’essai de chimotaxie.Pour préparer les plaques de test de chimiotaxie, marquer le fond des plaques NGM de 100 millimètres non couvertes avec des points situés près du bord à trois endroits comme indiqué ici. Déposer un microlitre de NaN₃ à une molaire sur les points d'odeur et les points de contrôle. Effectuer cette étape moins de 15 minutes avant le début du test afin de minimiser la diffusion des agents paralysants.Placez ensuite une microlitre d'éthanol à 95 % et une microlitre de butanone à 10 % sur les emplacements appropriés de la plaque d'essai marquée, directement au-dessus de l'azoture de sodium précédemment déposé. Éliminez autant que possible le tampon M neuf du tube contenant les vers décantés.Utilisez une pipette P20 avec une pointe pré-découpée pour délivrer 15 microlitres de vers en trois intervalles de cinq microlitres chacun à l'origine de la plaque d'essai. Ensuite, torsadez un coin d'un essuie-tout Kim pour le réduire en une petite pointe et utilisez-le pour absorber l'excès de tampon M neuf. Veillez à ne pas percer l'agar.Le retrait du tampon en excès libère les vers sur la plaque d'essai. Si l'on utilise l'imagerie pour compter les vers, une image de l'origine immédiatement après cette libération donnera le nombre total d'animaux par plaque d'essai. Incuber la plaque d'essai de chimiotaxie pendant une heure à température ambiante après l'incubation, puis compter le nombre de vers aux points d'origine, d'éthanol et de butanone, ainsi que le nombre total de vers sur la plaque d'essai.En général, les vers paralysés par l'azoture de sodium se trouveront dans un rayon d'un centimètre autour des points et apparaîtront droits et rigides. Lorsque de nombreux animaux sont empilés les uns contre les autres, les vers peuvent être comptés manuellement ou quantifiés à l'aide de logiciels d'imagerie et d'analyse. Nous préférons cette dernière méthode pour la facilité et la fiabilité des résultats.Une fois les vers aux points d'origine des taches d'éthanol et de butanone quantifiés, calculez l'indice KeyAx comme indiqué ici. L'indice de chimiotaxie typique chez les vers de type sauvage naïfs en réponse à la butanone à 10 % est d'environ 0,2. Un entraînement massé ou espacé augmente généralement l'indice de CHIMIOTAXIE à 0,7-0,8 à l'instant zéro, ce qui donne un indice d'apprentissage d'environ 0,6.La chimiotaxie naïve est très sensible aux conditions adéquates d'élevage des vers. Cette figure illustre la différence marquée de l'indice de chimiotaxie (CI) entre des vers naïfs bien nourris et des vers naïfs privés de nourriture, soulignant ainsi l'importance d'une technique appropriée. La rétention de la mémoire se manifeste par le temps nécessaire pour que l'indice de chimiotaxie revienne aux niveaux naïfs lorsque l'indice d'apprentissage atteint zéro chez des animaux de type sauvage.La mémoire associative à court terme commence à décliner une heure après un entraînement intensif d'environ deux heures et est indépendante du facteur de transcription kreb par comparaison. La mémoire associative à long terme ne commence généralement pas à décliner de manière significative avant 16 heures après un entraînement espacé pouvant durer jusqu'à 40 heures et dépend du gène Creb. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les tests de chimiotaxie peuvent être influencés par la privation de nourriture ou des odeurs excessives dans l'environnement, et que la mémoire des vers peut être perturbée par une agitation physique trop importante.

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