Multiple-Mouse Imaging neuroanatomiques par résonance magnétique

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir un phénotypage à haut débit avec des souris vivantes ou fixées en utilisant une imagerie par résonance magnétique (IRM) cérébrale multiparamétrique chez la souris. Cela est réalisé en anesthésiant d'abord chaque souris. Ensuite, pour l'exploration in vivo, placer chaque souris sur un traîneau de taille adaptée avant de la monter sur un dispositif de chargement et de la positionner dans l'ouverture du magnét.

Ou, pour l'imagerie ex vivo, effectuez une perfusion transcardiaque, isolez la structure du crâne et placez-la dans des tubes d'imagerie, que vous insérez ensuite dans un réseau de bobines solénoïdales à 16 canaux positionné dans l'alésage de l'aimant. En fin de compte, des volumes tridimensionnels d'imagerie par résonance magnétique peuvent être obtenus, fournissant des images cérébrales de haute qualité, adaptées au phénotypage, ainsi que des structures majeures et mineures du cerveau de la souris. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'histologie, est qu'elle préserve l'anatomie générale des spécimens encore contenus dans leurs crânes, permettant une couverture complète du cerveau et une analyse tridimensionnelle.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines biomédicaux, comme la relation entre les gènes et les distinctions anatomiques qui représentent les phénotypes dans le modèle murin de maladie. En général, les personnes novices dans cette technique trouveront complexes la conception de systèmes personnalisés de chargement des souris et de bobinages radiofréquence nécessaires à l'imagerie cérébrale à haut débit. La partie la plus difficile consiste, avant de commencer ce protocole, à obtenir l'approbation de toutes les procédures de manipulation en masse auprès du comité de soins aux animaux de votre établissement, du comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux, ou d'une instance équivalente, ainsi que la réalisation préalable de procédures telles que l'identification et la pesée.

Les enregistrements des animaux doivent être effectués sous une hotte de sécurité biologique. Ensuite, transférez les animaux dans un récipient en plastique autoclavable pour le transport vers la chambre d'induction IRM. Anesthésiez les animaux à scanner dans la chambre d'induction préchauffée à l'aide de 4 % de fluorure d'isoflurane (ISO) et de quatre litres par minute d'oxygène.

Les animaux sont complètement anesthésiés une fois qu'ils ne réagissent plus à une pincée de la patte. Le poil de la poitrine peut être retiré à l'aide d'un dépilatoire, comme Nair, si nécessaire, afin d'assurer un meilleur contact avec les dispositifs d'électrocardiogramme et de surveillance de la température intégrés au traîneau personnalisé. Appliquez également une solution ophtalmique, comme les larmes artificielles PMM, sur les yeux pour éviter qu'ils ne s'assèchent, et administrez environ 0,3 millilitre de sérum physiologique par injection sous-cutanée.

Pour hydrater les animaux. Placez maintenant les souris sur des luges individuelles équipées de sondes intégrées d'électrocardiogramme, de respiration et de température. Veillez à positionner correctement les membres antérieurs et postérieurs dans les encoches prévues sur les luges.

Lorsqu'une surveillance ECG est requise, veillez à ce que les régions dépourvues de poils sur le dessous de la souris soient alignées avec les sondes ECG, immobilisez chaque animal à l'aide d'une sangle pour la tête et d'une sangle pour le museau, puis faites glisser chaque traîneau dans un tube conique de 50 millilitres ouvert aux deux extrémités. Jusqu'à sept souris vivantes peuvent être préparées pour l'analyse lors d'une même séance d'imagerie. Ensuite, fixez les tubes coniques sur le plateau de chargement.

Veillez à raccorder toutes les lignes de surveillance physiologique une fois tous les animaux chargés. Réglez le niveau d'isoflurane dans l'ouverture du magnétomètre sur 2 % et le niveau d'oxygène sur huit litres par minute. Transportez maintenant le dispositif de chargement vers le magnétomètre et positionnez-le sur le système de rails.

Utilisez le système de rails pour coupler le dispositif de chargement avec la ruche à souris, conçue pour positionner uniformément les souris dans chaque bobine radiofréquence placée au centre de l'ouverture de l'aimant. Lorsque le dispositif est entièrement inséré dans l'aimant, les tubes de centrifugation s'encastrent dans le système de distribution d'anesthésique situé à l'intérieur des bobines RF, comme illustré ici ; un mélange de fluorure d'ISOFlurane et d'oxygène est fourni depuis la ruche à souris jusqu'au spécimen par un tube situé le long de l'axe de chaque bobine individuelle. Ce mélange gazeux anesthésique circule dans les tubes en passant devant les souris et est ensuite capté par une unité de prélèvement active fixée à l'arrière du dispositif de chargement.

En fonction des paramètres physiologiques des animaux, tels que la respiration et la température, les niveaux d'isoflurane (isof) et de fluor doivent être réglés entre 0,9 et 2 %. Effectuez maintenant une numérisation des animaux à l'aide d'une séquence écho rapide avec balayage. La durée de chaque acquisition tridimensionnelle est d'environ trois heures, avec une résolution d'image résultante de 125 micromètres. Veillez à surveiller en continu les relevés d'ECG, la respiration et la température de chaque animal pendant toute la durée de la numérisation.

Les animaux doivent également être maintenus au chaud pendant la session d'analyse à l'aide d'un flux d'air réchauffé. Une fois l'analyse terminée, retirez le plateau de chargement de l'aimant et placez-le dans une chambre d'induction chauffée remplie d'oxygène à 100 %. Déchargez les animaux des tubes et transférez-les dans des récipients en plastique hermétiques pour leur transport vers une hotte de sécurité biologique.

Enfin, placer les animaux dans une cage chaude sans courants d'air et les laisser se remettre de l'anesthésie pour l'imagerie animale ex vivo. Tout d'abord, anesthésier complètement les animaux par une injection intrapéritonéale d'un mélange de kétamine et de xylazine. Avant de commencer la perfusion, évaluer le niveau chirurgical d'anesthésie par une pincée du orteil ou de la patte.

Ouvrez la cavité thoracique et insérez une aiguille ou un ensemble d'infusion à ailettes de sécurité dans le ventricule gauche du cœur. Ensuite, coupez l'oreillette droite pour commencer la perfusion transcardiaque. Effectuez d'abord un lavage avec 30 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate à température ambiante, 1 x, mélangée avec une microlitre par millilitre d'héparine et deux millimolaire de pro hands, en utilisant un débit d'environ 100 millilitres par heure.

Cela devrait prendre environ 20 minutes. Ensuite, effectuez une fixation par perfusion avec 30 millilitres de paraformaldéhyde à 4 % à température ambiante, mélangé à deux millimolaires de pro hands, à raison de 100 millilitres par heure. Décapitez maintenant l'animal et retirez la peau, la mâchoire inférieure, les oreilles et l'extrémité nasale cartilagineuse.

Ensuite, placer la structure crânienne restante dans du paraformaldéhyde à 4 % mélangé avec deux millimolaires de pro hands et laisser toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, transférer l'échantillon dans une solution de tampon salin phosphate à 1 x, mélangée avec 0,02 % d'azoture de sodium et deux millimolaires de pro hands pour la conservation. Un balayage par IRM tridimensionnel haute résolution à sept Tesla doit être effectué au moins quatre jours, mais pas plus de deux mois et demi.

Après la perfusion, placer les cerveaux à imager dans un réseau de bobines solénoïdales à 16 canaux et insérer celui-ci dans le scanner. Scanner ensuite les échantillons à l’aide d’une séquence d’écho de spin rapide.

Cette durée de balayage est d'environ 12 heures, et les images finales auront une résolution isotrope de 32 micromètres. Une fois le balayage terminé, retirez les spécimens de la bobine d'imagerie et placez chaque crâne dans une solution de formol à 10 % avec deux millimoles par litre de pro hands pour une conservation représentative in vivo. Plusieurs images cérébrales de souris provenant d'un seul balayage de trois heures sont présentées ici.

Cette figure montre trois axes de vue pour chacune des sept souris scannées. Affichés. Voici une image représentative du cerveau ex vivo à une résolution isotrope de 32 microns. Et ici, nous pouvons voir une reconstruction 3D d'un volume d'image ex vivo une fois maîtrisée.

Cette technique in vivo peut être réalisée en trois à quatre heures si elle est effectuée correctement. Cette technique peut être utilisée par des chercheurs dans de nombreux domaines biomédicaux pour étudier des maladies telles que le lupus, la maladie de Huntington et la maladie d'Alzheimer chez la souris. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir des images cérébrales de haute qualité par IRM, tant sur des sujets vivants que fixés.

Merci d'avoir regardé.