Isolement des ribosomes Traduire Contenant Peptidyl-ARNt pour des analyses fonctionnelles et structurelles

L'objectif général de l'expérience suivante est d'analyser la structure et la fonction de ribosomes purs contenant un ARNt peptidique unique. Cela est réalisé en effectuant des tests de traduction in vitro à l'aide d'extraits acellulaires dépourvus de facteurs de relâchement et d'ARNm marqués par la biotine, afin de générer des complexes ribosomaux bloqués portant un ARNt peptidique liés aux ARNm marqués par la biotine. Dans une deuxième étape, des billes paramagnétiques liées à la streptavidine sont mélangées aux tests de traduction in vitro afin de permettre leur interaction avec les molécules de biotine situées dans l'ARNm.

Ensuite, les billes sont extraites à l’aide de champs magnétiques qui retirent du mélange réactionnel total les complexes ribosomaux peptidyl-tRNA arrêtés, liés aux ARNm. Puis, les complexes ribosomaux peptidyl-tRNA purifiés peuvent être mis en présence de facteurs de traduction tels que le facteur de relâchement, des antibiotiques inhibiteurs ou des agents chimiques modificateurs, afin d’analyser leur fonction. Des résultats concernant l’inhibition et la structure du ribosome sont obtenus, montrant l’inhibition de l’hydrolyse des peptidyl-tRNA et sa corrélation avec des modifications structurales des ribosomes, basée sur des tests d’activité de la peptidyl transférase ou de terminaison de la traduction utilisant des gels SDS ou Tris Racine page, ainsi que des tests de protection contre la modification utilisant des gels urée page.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la centrifugation différentielle, est que les échantillons isolés contiennent majoritairement des ribosomes porteurs d'une seule population d'ARNt peptidylés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'expression génique, telles que la nature des polypeptides naissants, ou encore comment les antibiotiques affectent la fonction ribosomale en modulant le processus de traduction. Pour commencer cette procédure, obtenir deux grammes de culot bactérien d'*E. coli* sec provenant de cultures en phase logarithmique.

Lavez le culot en le resuspendant dans un litre de tampon, suivi d'une centrifugation à 5 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir effectué deux lavages, resuspendez le culot bactérien obtenu dans 40 millilitres de tampon et lysez les cellules bactériennes à l'aide d'une presse française en appliquant une pression de 6 000 PSI. Cette pression correspond à 600 unités en utilisant un piston de un pouce.

Recueillir la suspension rompue dans un tube en verre propre de 50 millilitres. Traiter la suspension rompue avec du triol DIO ou du DTT à une concentration de un millimolaire, puis centrifuger l'échantillon à 30 000 ×g pendant 30 minutes. Éliminer le surnageant obtenu et répéter la procédure de centrifugation.

Conserver le surnageant obtenu à partir de la deuxième centrifugation, distribuer le surnageant final dans des microtubes. Enfin, congeler rapidement les aliquotes à l'aide d'un mélange d'éthanol et de glace sèche ou d'azote liquide, puis stocker les échantillons à moins 60 ou moins 80 degrés Celsius.

Commencez la préparation d'extraits dépourvus de cellules et appauvris en RF deux en mélangeant 4,5 millilitres de billes en suspension de sphéro B quatre protéine A avec cinq millilitres d'un antisérum anti RF deux. Incubez le mélange en rotation sur une roue tournante à température ambiante pendant une heure. Centrifugez le mélange à 2 500 ×g pour séparer les billes de l'antisérum.

Jetez le surnageant. Les billes contiennent désormais les deux anticorps anti RF et seront appelées billes anti RF. Lavez les billes en les resuspendant dans un millilitre de tampon B.

Ensuite, centrifuger les billes comme précédemment pour séparer les billes anti RF deux du tampon B. Répéter cette procédure de lavage deux fois. Après lavage des billes, mélanger un millilitre d'extrait acellulaire avec 150 microlitres de billes anti RF deux et incuber sur une roue rotative à quatre degrés Celsius pendant deux heures après l'incubation. Centrifuger le mélange à 10 000 G pour séparer l'extrait acellulaire des billes.

Éliminer le surnageant et le traiter à nouveau avec 150 microlitres d'anticorps anti RF deux liés à des billes, puis répéter l'incubation et la récupération une fois de plus. Distribuer la solution finale dépourvue de RF deux, exempte de cellules, dans des microtubes à raison de 100 microlitres par tube. Congeler les aliquotes à l'aide d'un mélange de dioxyde de carbone solide et d'éthanol ou d'azote liquide, puis stocker à moins 60 ou moins 80 degrés Celsius.

Préparez la réaction de PCR en combinant le modèle plasmidique contenant les séquences à traduire, les oligonucléotides déssoxy, les DTP, l'ADN polymérase et le tampon de stratégie PCR. Une fois l'échantillon de PCR préparé, effectuez la réaction d'amplification et précipitez l'ADN afin de purifier les produits de PCR en ajoutant un dixième de volume d'acétate de sodium trois molaire à pH 5,2 et deux volumes d'éthanol glacé. Après avoir répété la procédure de précipitation une fois de plus, nous suspendons l'ADN obtenu dans 100 microlitres d'eau traitée au dathyl percarbonate ou à l'eau traitée au dsy.

Vérifiez l'intégrité des produits de PCR par électrophorèse sur gels d'agarose. Typiquement, cette procédure donne 100 microgrammes d'un produit d'ADN de 600 paires de bases. Préparez une réaction de transcription in vitro de 100 microlitres dans de l'eau traitée depthy en mélangeant cinq microgrammes du fragment d'ADN généré par PCR avec des ribonucléotides marqués à l'UTP biotine et le mélange enzymatique T7.

Incuber le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Pour quantifier la quantité d'ARNm obtenue, éliminer le modèle d'ADN en ajoutant de l'ADNase sans ARN. Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Pour purifier les produits d'ARNm, précipiter l'ARN deux fois en ajoutant un dixième de volume d'acétate de sodium 3 M à pH 5,2 et deux volumes d'éthanol froid, puis resuspendre l'ARNm précipité dans 100 microlitres d'eau traitée au DPCI. Vérifier l'intégrité des produits d'ARNm marqués à la biotine par électrophorèse sur des gels AROS. Généralement, cette procédure permet d'obtenir entre un et deux milligrammes d'un produit d'ARNm marqué à la biotine de 600 nucléotides pour commencer l'isolement des ribosomes en cours de traduction contenant un ARNt peptidique. Un mélange de réaction de traduction in vitro de 500 microlitres est préparé dans de l'eau traitée au DEY.

Préparez d'abord le mélange réactionnel tamponné décrit dans le protocole écrit associé, puis ajoutez 75 M de chacun des acides aminés, à l'exception de celui qui sera remplacé par un acide aminé radioactif. Ensuite, ajoutez 20 à 50 microlitres de l'extrait cellulaire libre de cellules RF deux appauvri à la solution tampon contenant les acides aminés. Incubez le mélange pendant cinq minutes à température ambiante pour permettre l'activation des ribosomes.

Une fois les ribosomes activés, ajoutez 10 à 15 microgrammes d'ARNm marqués à la biotine à l'échantillon. Incubez le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Dans l'intervalle, préparez trois millilitres de billes paramagnétiques streptavidine ou SMB dans le tampon C. Après l'incubation, ajoutez la suspension de SMP au mélange réactionnel de traduction. Incubez la nouvelle suspension à température ambiante pendant 10 minutes. Séparez les SMB du mélange en appliquant un champ magnétique à l’aide de supports de séparation magnétique. Resus.

Suspendez la SMB dans le tampon C et séparez à nouveau les billes à l’aide du support magnétique. Après avoir répété cette procédure de lavage deux fois, resuspendez les billes dans 500 microlitres de tampon C. Conservez la suspension sur de la glace et effectuez la procédure suivante immédiatement. Pour visualiser le peptidyl ARNt, mélangez 10 microlitres de la SMB suspendue dans le tampon C avec 10 microlitres de tampon de charge, puis séparez les composants liés aux billes en faisant migrer les échantillons sur des gels de polyacrylamide à 10 % en Tris-tric.

Séchez les gels à l'aide d'un séchoir à gel sous vide. Ensuite, vérifiez l'intégrité et la purification de l'ARNt du peptide en exposant le gel séché à un film radiographique. Pour analyser l'ARN ribosomial, mélangez 190 microlitres d'une solution d'EDTA deux millimolaire préparée avec de l'eau traitée au DPCI, 200 microlitres de phénol équilibré avec de l'eau et 10 microlitres d'une suspension de billes.

Mélanger la suspension obtenue par vortexage énergique. Séparer la phase organique de la phase inorganique par centrifugation à 10 000 Gs pendant trois minutes. À température ambiante, prélever la couche aqueuse supérieure dans un nouveau tube microcentrifuge, précipiter l'ARN à partir de la couche aqueuse en ajoutant un dixième de volume d'acétate de sodium 3 M, pH 5,21, un microlitre de solution de glycogène à 20 milligrammes par millilitre et deux volumes d'éthanol glacé. Résuspendre l'ARN précipité dans 10 microlitres d'eau traitée au DPCI.

Vérifiez l'intégrité des ARN ribosomaux par électrophorèse sur gels niros. Habituellement, 50 microlitres de suspension de bactéries produisent un microgramme d'ARN ribosomal. Ici, les résultats d'une série d'analyses évaluant la qualité et la fonctionnalité des ribosomes traduisant isolés sont présentés.

L'observation d'une bande unique résolue sur des gels de polyacrylamide indique la présence de polypeptides liés aux ARNm marqués à la biotine fixés sur le SMB. La purification des ARN ribosomaux. Cette procédure permet également de confirmer la présence de ribosomes liés à ces ARNm marqués à la biotine.

L'ajout de la puromycine, un antibiotique qui induit l'activité peptidyltransférase du ribosome, entraîne le clivage des ARNt peptidiques naissants. Ce phénomène se manifeste par un décalage du profil de migration du polypeptide isolé sur des gels de polyacrylamide. L'ensemble de ces données indique que les ARNm marqués à la biotine fixés au SMB contiennent des ribosomes fonctionnels associés à des ARNt peptidiques.

L'isolement de ribosomes en cours de traduction contenant des ARNt peptidiques spécifiques permet l'étude des effets des antibiotiques ciblant les ARNt peptidiques ainsi que d'autres molécules sur la fonction et la structure des ribosomes. Dans les exemples présentés ici, l'antibiotique s parsamyn et l'acide aminé tryptophane inhibent le clivage hydrolytique de l'ARNt peptidique TNAC naissant par le facteur de relâchement RF deux dans les ribosomes isolés.

L'interaction du tryptophane ou de la sparsomycine avec le ribosome induit également des changements structuraux dans certains nucléotides constituant l'ARN 23 S du ribosome en cours de traduction. Une fois maîtrisée, la partie principale de cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est correctement effectuée en suivant ces procédures. D'autres méthodes, comme la cryomicroscopie électronique, permettent des analyses structurales supplémentaires et peuvent être utilisées pour répondre à des questions complémentaires sur la structure du ribosome contenant un ARN peptidique unique.