Name: Isolement des ribosomes Traduire Contenant Peptidyl-ARNt pour des analyses fonctionnelles et structurelles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-25T16:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Découvrez une méthode d'isolation de ribosomes contenant des peptidyl-ARNt spécifiques pour analyser leur structure et leur fonction. Cette technique réduit la contamination et permet d'étudier l'expression génique.

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LRC-V. souhaite dédier cet article à la mémoire du Dr Adriel Johnson D., un professeur merveilleux, dont la priorité numéro un était toujours à l&#39;éducation des élèves. Tu nous manques, Adriel. Nous sommes reconnaissants à Jacqueline Moreno pour son aide dans l&#39;exécution des expériences décrites dans cette étude. Cette étude a été soutenue par une subvention accordée à CY de la National Science Foundation, MCB-0615390, et par des fonds de démarrage fourni aux voitures LRC-V. de l&#39;Université d&#39;Alabama à Huntsville.

1. Cellule Préparation Extrait gratuit. <ol><li> Deux grammes d'un Escherichia coli sèche culot bactérien obtenu à partir de la mi-log cultures en phase sont lavés, deux fois, avec un demi litre de tampon A contenant 10 mM Tris-acétate, pH 8,0, acétate de magnésium 14 mM, 60 mM d'acétate de potassium et 50 mg / phenylmethanesulphonylfluoride ml (PMSF) par centrifugation à 5000 xg pendant 5 min à 4 ° C. Après le lavage, le culot bactérien est resuspendu dans 40 ml de tampon A. </li><li> Les cellules bactériennes sont perturbés en utilisant une presse française, en appliquant une pression 6000 psi. Cette pression correspond à 600 unités à l'aide d'un piston d'un pouce. La suspension est perturbé recueilli dans un tube de verre propre (50 ml). </li><li> La suspension est traitée perturbé avec 1 mM dithiotréitol (TNT) et est centrifugé à 30000 xg pendant 30 min. La procédure de centrifugation est répétée, en utilisant le surnageant résultant. Le surnageant final est dispensée (1 ml) dans des microtubes. Enfin, les aliquotes sont congelés en utilisant une glace sèche-éthanol ou de l'azote liquide, et sont stockés à -60 ° C ou -80 ° C. </li></ol> 2. Préparation des extraits cellulaires gratuit appauvri des RF2. <ol><li> 4,5 ml de billes de protéine A sépharose 4B boue sont mélangés avec 5 ml d'un anti-sérum anti-RF2 utilisant une roue tournant à température ambiante, pendant une heure. Le mélange est centrifugé à 2500 xg pour séparer les perles de l'antisérum. Après élimination du surnageant, ces billes contenant des anticorps anti-RF2 (anti-RF2 perles) sont lavés tard par resuspension dans 1 ml de tampon B contenant 35 mM Tris-acétate pH 7,8, 10 mM d'acétate de magnésium, l'acétate d'ammonium 30 mM, 60 mM de glutamate de potassium et de 5 ug / mL d'inhibiteur de la protéinase leupeptine. Les perles anti-RF2 sont ensuite séparés de tampon B par centrifugation en utilisant les mêmes conditions indiquées ci-dessus. La procédure de lavage est répété deux fois. </li><li> Un ml de l'extrait acellulaire est mélangé avec 150 pi d'anti-RF2 perles en utilisant une roue en rotation, à 4 ° C, pendant deux heures. Le mélange est centrifugé à 10000 xg pour séparer l'extrait acellulaire à partir des perles. Le surnageant est enlevé et traité de nouveau avec une autre uL 150 de l'anti-RF2 perles. Cette procédure est répétée une fois de plus avec la solution d'extrait acellulaire résultant. La solution extrait final sans cellule est dispensé (100 pi) dans des microtubes. Les aliquotes sont congelés en utilisant une glace sèche-éthanol ou de l'azote liquide, et sont stockés à -60 ° C ou -80 ° C. </li></ol> 3. Préparation d'une matrice d'ADN. <ol><li> Préparer un 1 mL réaction PCR en mélangeant 600 femtomoles du modèle plasmide contenant les séquences à traduire (Fig 1), avec 0,4 nanomoles de chacun des oligodésoxynucléotides indiqué dans la figure 1, 0,2 micromoles de chaque dNTP et 50 U de Taq- polymérase de l'ADN dans le tampon fourni par Stratagene Co. Effectuer la réaction d'amplification dans les conditions suivantes: 94 ° C pendant 2 min, (94 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 1 min; pour 30 cycles) et 72 ° C pendant 12 min. </li><li> Purifier le PCR-produits en précipitant l'ADN en ajoutant 1 / 10 volume d'acétate de sodium 3 M, pH 5,2, et 2 volumes d'éthanol glacé. Répétez la procédure de précipitation une fois de plus. Resuspendre l'ADN dans 100 ul de diéthyl-pyrocarbonate (DEPC) eau traitée. Typiquement, cette procédure donne 100 ug d'un produit 600 pb d'ADN. </li><li> Vérifier l'intégrité des produits de PCR par électrophorèse sur gels d'agarose. </li></ol> 4. Préparation de l'ARNm marqué à la biotine. <ol><li> Préparer un uL 100 réaction de transcription in vitro dans l'eau traitée au DEPC en mélangeant 5 ug du fragment d'ADN généré par PCR avec 0,5 micromoles de l'ATP, CTP, GTP, 0,3 micromoles de l'UTP, 50 nanomoles de biotine-16-UTP, et 10 pl de mélange de l'enzyme T7 dans le tampon fourni par Promega Co. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 3 heures. Pour quantifier la quantité d'ARNm obtenue, la matrice d'ADN devraient être éliminées en ajoutant sans RNase DNase. Incuber la réaction à 37 ° C pendant 10 min. </li><li> Purifier les produits ARNm en précipitant l'ARN en ajoutant 1 / 10 volume d'acétate de sodium 3 M, pH 5,2, et 2 volumes d'éthanol froid. Répétez la procédure de précipitation une fois de plus. Resuspendre l'ARNm dans 100 ul d'eau traitée au DEPC. Habituellement, cette procédure entre rendements 1-2 mg d'une biotine 600 NT étiqueté produit ARNm. </li><li> Vérifier l'intégrité des produits de la biotine ARNm marqué par électrophorèse sur gels d'agarose. </li></ol> 5. Isolement des ribosomes Traduire Contenant une peptidyl-ARNt. <ol><li> Préparer 500 ul d'un mélange de réaction in vitro de traduction dans l'eau traitée au DEPC en mélangeant 10 à 15 mg de biotine marqué avec 75 nanomoles ARNm de chacune des dix-neuf acides aminés, tous sauf l'acide aminé qui sera remplacé par un acide aminé radioactif , 50 uCi d'un acide aminé radioactif (37MBq), et 20-5 0 ul de RF2 appauvri extrait acellulaire, dans un mélange réactionnel contenant 40 mM tampon Tris-acétate, pH 8,0, 10 mM d'acétate de magnésium, 175 mM d'acétate de potassium, acétate d'ammonium 10 mM, 2 mM de DTT, 2 mM ATP, 0,5 mM GTP, 30 mM phosphoénolpyruvate (PEP), 0,3 pyruvate kinase U / ml (PK), le polyéthylène glycol 8000 3,5%, 1 mM spermidine, 20 ug / ml d'acide folinique, et 250 pg / ml d'ARNt de E. coli. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 10 minutes. L'ordre d'addition des composants de la réaction est très important. L'extrait exempt de cellules doit être mélangé d'abord avec la solution tampon contenant les acides aminés et le mélange final incubé pendant 5 min à température ambiante pour permettre l'activation des ribosomes. Plus tard, l'ARNm marqué à la biotine sont ajoutées. Pour les analyses structurelles utilisant les procédures de modification chimique, l'ajout d'un acide aminé radioactif n'est pas nécessaire. </li><li> Ajouter au mélange réactionnel de traduction - 3 mL de billes paramagnétiques de streptavidine (SMB) en suspension dans le tampon C contenant 35 mM Tris-acétate, pH 8,0, 10 mM d'acétate de magnésium, 175 mM d'acétate de potassium, acétate d'ammonium 10 mM et DTT 1 mM. Incuber la nouvelle suspension à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Séparez les PME à partir du mélange en appliquant un champ magnétique (CM) en utilisant stands séparation magnétique. </li><li> Reprendre le SMB dans le tampon C et séparer les perles à nouveau en utilisant la MF. Répétez cette procédure de lavage deux fois. Resuspendre les perles dans 500 uL de tampon C, stocker la suspension sur la glace, et suivez la procédure suivante immédiatement. </li></ol> 6. Analyse des ribosomes isolé contenant le peptidyl-ARNt. Pour peptidyl-ARNt <ol><li> Mélanger 10 uL de la SMB (en suspension dans le tampon C) avec 10 ul d'un tampon de chargement contenant 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% (v / v) de glycérol, le sulfate de sodium à 4% de dodécyle, 2 mM de DTT et 0,2 mg / ml de bleu de bromophénol. Résoudre les composants attachés aux billes en exécutant les échantillons dans 10% des gels de polyacrylamide Tris-tricine. </li><li> Sécher les gels d'utiliser un aspirateur de gel-cheveux. </li><li> Vérifier l'intégrité et la purification du peptidyl-ARNt en exposant le gel séché à un film radiographique. </li></ol> Pour l'ARN ribosomal <ol start="4"><li> Ajouter 190 uL de 2 mM d'éthylènediaminetétraacétate (EDTA) solution préparée avec de l'eau traitée par DEPC, et 200 ul de phénol équilibré avec de l'eau, à 10 ul d'une suspension de billes. Mélanger la suspension par vortex vigoureux et séparer la phase minérale de la phase organique par centrifugation à 10000 xg pendant 3 min à température ambiante. Recueillir la couche d'eau supérieure dans un microtube de nouvelles. </li><li> Précipiter l'ARN à partir de la couche d'eau en ajoutant 1 / 10 volume d'acétate de sodium 3 M, pH 5,2, 1 pl de 20 mg / mL de la solution de glycogène, et 2 volumes d'éthanol glacé. Resuspendre l'ARN dans 10 ul de DEPC eau traitée. </li><li> Vérifier l'intégrité de l'ARN ribosomal par électrophorèse sur gels d'agarose. Habituellement, 50 pl de suspension de billes de rendements 1 pg d'ARN ribosomal. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: La figure 2 présente les résultats d'une série d'analyses de l'évaluation de la qualité et la fonctionnalité des ribosomes traduisant isolé en utilisant la procédure décrite. L'observation d'une bande unique résolus dans des gels de polyacrylamide indique la présence de polypeptides liés à l'ARNm marqué à la biotine attachée à la SMB (figure 2A). La purification de l'ARN ribosomal utilisant cette procédure établit la présence de ribosomes liés à ces ARNm marqué à la biotine, ainsi (figure 2B). Ajout de la puromycine, un antibiotique qui induit l'activité peptidyl-transférase du ribosome, se traduit par le clivage de la naissante peptidyl-ARNt 1. Ceci est observé comme un changement dans le modèle de migration du polypeptide isolé dans des gels de polyacrylamide (figure 2C). Ensemble, ces données indiquent que les ARNm marqué à la biotine attachée à la SMB contiennent des ribosomes fonctionnels avec peptidyl-ARNt. L'isolement des ribosomes traduisant contenant spécifiques peptidyl-ARNt permet l'étude des effets de la peptidyl-ARNt, les antibiotiques et autres molécules, sur la fonction du ribosome (figure 3A), et sur la structure du ribosome (figure 3B). Dans les exemples présentés ici le sparsomycin antibiotiques et l'acide aminé tryptophane (Trp) inhibent le clivage hydrolytique de la naissante CCNT-ARNt peptidyl-ARNt induite par RF2 dans les ribosomes isolés (figure 3A). L'interaction de sparsomycin ou Trp avec le ribosome induit aussi des changements structurels dans certains nucléotides qui constituent l'ARNr 23S du ribosome traduisant (figure 3B). En résumé, le matériel biologique obtenu en utilisant la procédure décrite ici sont utiles dans l'obtention de compréhension supplémentaire des contacts structuraux impliqués dans l'inhibition de la fonction du ribosome lors de son interaction avec divers facteurs moléculaires. ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Procédure utilisée pour produire et purifier les ribosomes traduisant contenant peptidyl-ARNt. Fragments d'ADN ca. 650 pb de longueur, contenant le gène CCNT et sa région adjacente, montré dans la figure, sont utilisés comme modèles dans la préparation des ARNm contenant la biotine, [(bio) UMP] ARNm. Ces fragments d'ADN sont produites par des procédures de PCR en utilisant les oligodéoxynucléotides indiqué en haut de la figure. Les lettres soulignées marquer l'emplacement du promoteur T7 encodés dans l'amorce nucléotidique. Les caractères gras indiquent la séquence de Shine-Dalgarno qui est utilisé dans la traduction de l'ARNm séquences CCNT. Le promoteur T7 dans le fragment d'ADN est reconnue par l'ARN polymérase T7 qui est utilisé pour transcrire (flèche) de la séquence et la CCNT aval séquence non codante. La transcription est terminée lorsque l'ARN polymerase atteigne l'extrémité 3 'du fragment d'ADN, après les séquences de terminaison rpoBC (rpoBC "t"). La structure en tige-boucle du terminateur rpoBC protège l'ARNm de la 3'-5 'activité présente exoribonucléase dans les extraits cellulaires sans utilisé dans les réactions de traduction in vitro. Les isolés [(bio) UMP] ARNm sont utilisés pour générer impasse, les ribosomes traduisant, par des essais de traduction in vitro. La séquence de la CCNT [(bio) UMP] ARNm est traduit par un ribosome qui cale lors du dernier acide aminé est incorporé, en raison de l'absence du facteur de presse (RF2) du mélange réactionnel. Le ribosome [(bio) UMP] complexes ARNm sont isolés du mélange réactionnel total à l'aide de streptavidine magnétique perles (SMB) qui lient les nucléotides marqués à la biotine incorporée dans l'ARNm. Les PME liés au ribosome-[(bio) UMP] complexes ARNm sont extraits du mélange réactionnel total en utilisant un champ magnétique (CM). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Analyses structurales et fonctionnelles des complexes isolés. A) Dans les réactions de traduction in vitro ont été effectués avec [(bio) UMP] ARNm dans laquelle le codon d'initiation du gène de la CCNT a été remplacé par un codon stop. Les produits finaux ont été isolés en utilisant des billes de streptavidine, comme cela est indiqué dans la figure 1. Produits de réaction et des molécules isolées ont ensuite été analysés par électrophorèse sur gels de polyacrylamide. La CCNT-ARNt et des bandes CCNT peptides sont marqués. B) L'ARN total a été isolé à partir des complexes au point mort en utilisant des procédures d'extraction phénol. Chaque ARN isolé a été résolu par électrophorèse en gels d'agarose. ARN ribosomal (ARNr) sont indiqués. C) des complexes isolés contenant CCNT-ARNt ont été incubées avec (+) ou sans (-) 0,02 mM puromycine (Puro) à température ambiante pendant 10 min. Le peptide CCNT étaient étiquetés en cours de traduction en utilisant [35S]-méthionine (A) ou de [3H]-proline (B). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Analyses structurales et fonctionnelles des ribosomes contenant CCNT-ARNt qui sont liés à l'sparsomycin antibiotiques, ou l'acide aminé tryptophane. A) des complexes isolés contenant CCNT-ARNt ont été incubées avec (+) ou sans (-) sparsomycin (Spar) ou tryptophane (Trp) à température ambiante pendant 5 min. Plus tard, les mélanges ont été mélangés avec RF2 et incubées à 37 ° C pendant 20 min. B) Analyse des changements dans la méthylation de l'ARNr 23S induite par molécules de liaison au sein du ribosome. Complexes isolés ont été pré-incubées avec (+) ou sans (-) 2 mM Trp ou Spar pendant 5 min à 37 ° C. Puis, un agent d'alkylation, le sulfate de diméthyle a été ajouté et le mélange incubé à température ambiante pendant 20 minutes supplémentaires. L'ARN total a été extrait et des dosages d'extension d'amorces ont été effectuées avec un [32P] marquée oligodésoxynucléotide complémentaires aux nucléotides de l'ARNr 23S qui sont espacées de 100 nucléotides en aval du nucléotide modifié. Les produits finaux des essais de vulgarisation ont été résolus par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les nucléotides ARNr 23S affectée par la présence de Trp ou Spar sont indiqués.

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</ol>

Cette procédure d&#39;isolement décrites dans ce rapport est hautement reproductible. Malheureusement, la présence de courts peptidyl-ARNt produite à partir des séquences mêmes ne peuvent pas être traduits facilement évités; tels peptidyl-ARNt peut correspondre à 15-20% du total des matières isolées (figure 2C). Ces contaminants peuvent augmenter la concentration lors des concentrations plus élevées d&#39;ARNm marqué à la biotine ont été utilisées ou lorsque les extraits acellulaires utilisés sont vieux ou ont été ré-utilisé plusieurs fois. Par conséquent, il est très important de contrôler la qualité et la concentration des composants de la traduction in vitro dans les réactions. Alternativement, une grande efficacité commerciale reconstitué extraits acellulaires sont disponibles qui peuvent être utilisés aux mêmes fins (système PUR) 18. En utilisant cette méthode, la biotine-16-UMP est incorporé au hasard le long de l&#39;ARNm cible. Il ya une possibilité que certains ORF contenant tracts uridine peuvent avoir intégré cette nucléotide modifié dans leurs séquences, affectant leur traduction. Variable concentrations relatives des biotin-16-UTP/UTP doivent être testées lors de la synthèse de l&#39;ARNm en vue d&#39;obtenir la traduction la plus efficace. D&#39;autres méthodes de marquage à la biotine peut être utilisé, en ciblant l&#39;extrémité 5 &#39;, l&#39;extrémité la plus stable de l&#39;ARNm. (I) La biotine peut être attaché à l&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;ARNm en utilisant 3&#39;-NH2ATP (3&#39;-amino, 3&#39;-désoxyadénosine triphosphate) et l&#39;ARN ligase T4 19. (Ii) 5&#39;-end marqué à la biotine oligonucléotide peut être attaché à l&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;ARNm en utilisant l&#39;ARN ligase T4 ainsi 20. (Iii) l&#39;extrémité 3 &#39;marqué à la biotine oligodésoxynucléotides qui correspondent à la séquence complémentaire à l&#39;extrémité 5&#39; de l&#39;ARNm peut aussi être utilisé pour isoler les complexes de traduction. Ces oligodésoxynucléotides biotine pourrait être attachée à la SMB avant l&#39;isolement. Plus tard, le SMB attaché à la marqué à la biotine oligodésoxynucléotides pourrait être mélangé avec le mélange de réaction de traduction pour permettre une interaction avec leurs séquences d&#39;ARNm complémentaires. Après isolement, l&#39;hybride ARN-ADN région - et la région d&#39;hybridation entre les oligodésoxynucléotide marqué à la biotine et la séquence d&#39;ARNm - pourrait être dégradée en utilisant la RNAse H, qui sépare les complexes calé à partir des billes de streptavidine. Cette méthode peut permettre à des complexes d&#39;être employée dans de futures analyses structurelles utilisant les méthodes de résolution plus élevée.

<table><tbody><tr><td>Base de Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de magnésium</td><td>Fluka</td><td>63049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamate de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d'ammonium</td><td>Fluka</td><td>09688</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Perles en suspension de sépharose 4B protéine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9424</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la leupeptine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9783</td><td></td></tr><tr><td>Polymérase Taq-DNA</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>Kits de purification T7 Maxiprep</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>SMB</td><td>Promega Corp.</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>Biotine-16-UTP</td><td>Roche Group</td><td>1388908</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7002</td><td></td></tr><tr><td>PK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7768</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylèneglycol 8000</td><td>Fluka</td><td>81268</td><td></td></tr><tr><td>Acide folinique</td><td>Fluka</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Fluka</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>ARNt provenant de &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5816</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluka</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Supports magnétiques pour séparation</td><td>Promega Corp.</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des ribosomes traduire contenant peptidyl-arnt pour des analyses fonctionnelles et structurelles

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Récemment, des études structurales et biochimiques ont détaillé plusieurs des événements moléculaires qui se produisent dans le ribosome pendant l&#39;inhibition de la synthèse protéique par les antibiotiques et lors de la synthèse polypeptidique naissante. Certains de ces antibiotiques et réglementaires polypeptides naissants principalement sous la forme du peptidyl-ARNt, inhibent la formation soit liaison peptidique ou 1-7 terminaison de la traduction. Ces événements peuvent inhibitrices arrêter le mouvement du ribosome, un phénomène appelé «l&#39;arrestation de translation&quot;. Traduction d&#39;arrestation soit induite par un antibiotique ou un polypeptide naissant a été montré pour réguler l&#39;expression de gènes impliqués dans diverses fonctions cellulaires telles que la croissance cellulaire, la résistance aux antibiotiques, la translocation des protéines et 8-13 métabolisme cellulaire. La connaissance de la façon dont les antibiotiques et réglementaires polypeptides naissants altérer la fonction des ribosomes est essentiel si nous voulons comprendre le rôle complet du ribosome dans la traduction, dans chaque organisme. Ici, nous décrivons une méthodologie simple qui peut être utilisé pour purifier, exclusivement, pour l&#39;analyse, ces ribosomes traduisant un ARN messager spécifique et contenant une peptidyl-ARNt spécifiques 14. Cette procédure est basée sur l&#39;isolement sélectif des ribosomes traduisant lié à un ARNm marqué à la biotine. Ces complexes de translation sont séparés de ribosomes d&#39;autres dans le même mélange, en utilisant des billes paramagnétiques de streptavidine (SMB) et un champ magnétique (CM). ARNm marqué à la biotine sont synthétisés par des analyses de transcription du ruissellement à l&#39;aide de fragments de matrices d&#39;ADN généré par PCR qui contiennent des promoteurs T7 transcriptionnelle. T7 RNA polymérase incorpore biotine-16-UMP de biotine-UTP, dans nos conditions dizaine biotine-16-UMP molécules sont incorporées dans un ARNm NT 600 avec une teneur de 25% UMP. Ces marqué à la biotine ARNm sont ensuite isolés et utilisés dans des essais de traduction in vitro réalisée avec 2 facteur de libération (RF2) appauvri extraits acellulaires obtenus à partir de souches d&#39;Escherichia coli de type sauvage ou contenant des ribosomes mutant. Les ribosomes traduisant l&#39;marqué à la biotine sont des séquences d&#39;ARNm a décroché à la région codon d&#39;arrêt, en raison de l&#39;absence de la protéine RF2, qui accomplit normalement terminaison de la traduction. Bloqués contenant les ribosomes nouvellement synthétisées peptidyl-ARNt sont isolés et retirés de la réactions de traduction en utilisant SMB et un MF. Ces perles ne se lient à la biotine contenant des messages. Les isolés, des complexes de translation, peut être utilisé pour analyser les caractéristiques structurelles et fonctionnelles de type sauvage ou mutante composants du ribosome, ou peptidyl-ARNt séquences, ainsi que la détermination de l&#39;interaction du ribosome avec des antibiotiques ou d&#39;autres facteurs moléculaires 1,14-16. Pour examiner la fonction de ces complexes isolés ribosome, peptidyl-transférase dosages peuvent être effectués en présence de l&#39;antibiotique puromycine 1. Pour étudier les changements structurels dans les complexes de translation, des procédures bien établies peuvent être utilisées, telles que i) à la réticulation des acides aminés spécifiques 14 et / ou ii) la protection des dosages d&#39;alkylation 1,14,17.

Un obstacle majeur à des analyses biochimiques des ribosomes contenant naissante peptidyl-ARNt a été la présence de ribosomes d&#39;autres dans les mêmes échantillons, les ribosomes pas impliqué dans la traduction de la séquence d&#39;ARNm spécifiques en cours d&#39;analyse. Nous avons développé une méthodologie simple pour purifier, en exclusivité, les ribosomes contenant la naissante peptidyl-ARNt d&#39;intérêt.

Isolement des ribosomes Traduire Contenant Peptidyl-ARNt pour des analyses fonctionnelles et structurelles

Récemment, des études structurales et biochimiques ont détaillé nombre d'événements moléculaires qui se produisent dans le ribosome lors de l'inhibition de la synthèse protéique...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'analyser la structure et la fonction de ribosomes purs contenant un ARNt peptidique unique. Cela est réalisé en effectuant des tests de traduction in vitro à l'aide d'extraits acellulaires dépourvus de facteurs de relâchement et d'ARNm marqués par la biotine, afin de générer des complexes ribosomaux bloqués portant un ARNt peptidique liés aux ARNm marqués par la biotine. Dans une deuxième étape, des billes paramagnétiques liées à la streptavidine sont mélangées aux tests de traduction in vitro afin de permettre leur interaction avec les molécules de biotine situées dans l'ARNm.Ensuite, les billes sont extraites à l’aide de champs magnétiques qui retirent du mélange réactionnel total les complexes ribosomaux peptidyl-tRNA arrêtés, liés aux ARNm. Puis, les complexes ribosomaux peptidyl-tRNA purifiés peuvent être mis en présence de facteurs de traduction tels que le facteur de relâchement, des antibiotiques inhibiteurs ou des agents chimiques modificateurs, afin d’analyser leur fonction. Des résultats concernant l’inhibition et la structure du ribosome sont obtenus, montrant l’inhibition de l’hydrolyse des peptidyl-tRNA et sa corrélation avec des modifications structurales des ribosomes, basée sur des tests d’activité de la peptidyl transférase ou de terminaison de la traduction utilisant des gels SDS ou Tris Racine page, ainsi que des tests de protection contre la modification utilisant des gels urée page.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la centrifugation différentielle, est que les échantillons isolés contiennent majoritairement des ribosomes porteurs d'une seule population d'ARNt peptidylés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'expression génique, telles que la nature des polypeptides naissants, ou encore comment les antibiotiques affectent la fonction ribosomale en modulant le processus de traduction. Pour commencer cette procédure, obtenir deux grammes de culot bactérien d'*E. coli* sec provenant de cultures en phase logarithmique.Lavez le culot en le resuspendant dans un litre de tampon, suivi d'une centrifugation à 5 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir effectué deux lavages, resuspendez le culot bactérien obtenu dans 40 millilitres de tampon et lysez les cellules bactériennes à l'aide d'une presse française en appliquant une pression de 6 000 PSI. Cette pression correspond à 600 unités en utilisant un piston de un pouce.Recueillir la suspension rompue dans un tube en verre propre de 50 millilitres. Traiter la suspension rompue avec du triol DIO ou du DTT à une concentration de un millimolaire, puis centrifuger l'échantillon à 30 000 ×g pendant 30 minutes. Éliminer le surnageant obtenu et répéter la procédure de centrifugation.Conserver le surnageant obtenu à partir de la deuxième centrifugation, distribuer le surnageant final dans des microtubes. Enfin, congeler rapidement les aliquotes à l'aide d'un mélange d'éthanol et de glace sèche ou d'azote liquide, puis stocker les échantillons à moins 60 ou moins 80 degrés Celsius.Commencez la préparation d'extraits dépourvus de cellules et appauvris en RF deux en mélangeant 4,5 millilitres de billes en suspension de sphéro B quatre protéine A avec cinq millilitres d'un antisérum anti RF deux. Incubez le mélange en rotation sur une roue tournante à température ambiante pendant une heure. Centrifugez le mélange à 2 500 ×g pour séparer les billes de l'antisérum.Jetez le surnageant. Les billes contiennent désormais les deux anticorps anti RF et seront appelées billes anti RF. Lavez les billes en les resuspendant dans un millilitre de tampon B.Ensuite, centrifuger les billes comme précédemment pour séparer les billes anti RF deux du tampon B. Répéter cette procédure de lavage deux fois. Après lavage des billes, mélanger un millilitre d'extrait acellulaire avec 150 microlitres de billes anti RF deux et incuber sur une roue rotative à quatre degrés Celsius pendant deux heures après l'incubation. Centrifuger le mélange à 10 000 G pour séparer l'extrait acellulaire des billes.Éliminer le surnageant et le traiter à nouveau avec 150 microlitres d'anticorps anti RF deux liés à des billes, puis répéter l'incubation et la récupération une fois de plus. Distribuer la solution finale dépourvue de RF deux, exempte de cellules, dans des microtubes à raison de 100 microlitres par tube. Congeler les aliquotes à l'aide d'un mélange de dioxyde de carbone solide et d'éthanol ou d'azote liquide, puis stocker à moins 60 ou moins 80 degrés Celsius.Préparez la réaction de PCR en combinant le modèle plasmidique contenant les séquences à traduire, les oligonucléotides déssoxy, les DTP, l'ADN polymérase et le tampon de stratégie PCR. Une fois l'échantillon de PCR préparé, effectuez la réaction d'amplification et précipitez l'ADN afin de purifier les produits de PCR en ajoutant un dixième de volume d'acétate de sodium trois molaire à pH 5,2 et deux volumes d'éthanol glacé. Après avoir répété la procédure de précipitation une fois de plus, nous suspendons l'ADN obtenu dans 100 microlitres d'eau traitée au dathyl percarbonate ou à l'eau traitée au dsy.Vérifiez l'intégrité des produits de PCR par électrophorèse sur gels d'agarose. Typiquement, cette procédure donne 100 microgrammes d'un produit d'ADN de 600 paires de bases. Préparez une réaction de transcription in vitro de 100 microlitres dans de l'eau traitée depthy en mélangeant cinq microgrammes du fragment d'ADN généré par PCR avec des ribonucléotides marqués à l'UTP biotine et le mélange enzymatique T7.Incuber le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Pour quantifier la quantité d'ARNm obtenue, éliminer le modèle d'ADN en ajoutant de l'ADNase sans ARN. Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.Pour purifier les produits d'ARNm, précipiter l'ARN deux fois en ajoutant un dixième de volume d'acétate de sodium 3 M à pH 5,2 et deux volumes d'éthanol froid, puis resuspendre l'ARNm précipité dans 100 microlitres d'eau traitée au DPCI. Vérifier l'intégrité des produits d'ARNm marqués à la biotine par électrophorèse sur des gels AROS. Généralement, cette procédure permet d'obtenir entre un et deux milligrammes d'un produit d'ARNm marqué à la biotine de 600 nucléotides pour commencer l'isolement des ribosomes en cours de traduction contenant un ARNt peptidique. Un mélange de réaction de traduction in vitro de 500 microlitres est préparé dans de l'eau traitée au DEY.Préparez d'abord le mélange réactionnel tamponné décrit dans le protocole écrit associé, puis ajoutez 75 M de chacun des acides aminés, à l'exception de celui qui sera remplacé par un acide aminé radioactif. Ensuite, ajoutez 20 à 50 microlitres de l'extrait cellulaire libre de cellules RF deux appauvri à la solution tampon contenant les acides aminés. Incubez le mélange pendant cinq minutes à température ambiante pour permettre l'activation des ribosomes.Une fois les ribosomes activés, ajoutez 10 à 15 microgrammes d'ARNm marqués à la biotine à l'échantillon. Incubez le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.Dans l'intervalle, préparez trois millilitres de billes paramagnétiques streptavidine ou SMB dans le tampon C. Après l'incubation, ajoutez la suspension de SMP au mélange réactionnel de traduction. Incubez la nouvelle suspension à température ambiante pendant 10 minutes. Séparez les SMB du mélange en appliquant un champ magnétique à l’aide de supports de séparation magnétique. Resus.Suspendez la SMB dans le tampon C et séparez à nouveau les billes à l’aide du support magnétique. Après avoir répété cette procédure de lavage deux fois, resuspendez les billes dans 500 microlitres de tampon C. Conservez la suspension sur de la glace et effectuez la procédure suivante immédiatement. Pour visualiser le peptidyl ARNt, mélangez 10 microlitres de la SMB suspendue dans le tampon C avec 10 microlitres de tampon de charge, puis séparez les composants liés aux billes en faisant migrer les échantillons sur des gels de polyacrylamide à 10 % en Tris-tric.Séchez les gels à l'aide d'un séchoir à gel sous vide. Ensuite, vérifiez l'intégrité et la purification de l'ARNt du peptide en exposant le gel séché à un film radiographique. Pour analyser l'ARN ribosomial, mélangez 190 microlitres d'une solution d'EDTA deux millimolaire préparée avec de l'eau traitée au DPCI, 200 microlitres de phénol équilibré avec de l'eau et 10 microlitres d'une suspension de billes.Mélanger la suspension obtenue par vortexage énergique. Séparer la phase organique de la phase inorganique par centrifugation à 10 000 Gs pendant trois minutes. À température ambiante, prélever la couche aqueuse supérieure dans un nouveau tube microcentrifuge, précipiter l'ARN à partir de la couche aqueuse en ajoutant un dixième de volume d'acétate de sodium 3 M, pH 5,21, un microlitre de solution de glycogène à 20 milligrammes par millilitre et deux volumes d'éthanol glacé. Résuspendre l'ARN précipité dans 10 microlitres d'eau traitée au DPCI.Vérifiez l'intégrité des ARN ribosomaux par électrophorèse sur gels niros. Habituellement, 50 microlitres de suspension de bactéries produisent un microgramme d'ARN ribosomal. Ici, les résultats d'une série d'analyses évaluant la qualité et la fonctionnalité des ribosomes traduisant isolés sont présentés.L'observation d'une bande unique résolue sur des gels de polyacrylamide indique la présence de polypeptides liés aux ARNm marqués à la biotine fixés sur le SMB. La purification des ARN ribosomaux. Cette procédure permet également de confirmer la présence de ribosomes liés à ces ARNm marqués à la biotine.L'ajout de la puromycine, un antibiotique qui induit l'activité peptidyltransférase du ribosome, entraîne le clivage des ARNt peptidiques naissants. Ce phénomène se manifeste par un décalage du profil de migration du polypeptide isolé sur des gels de polyacrylamide. L'ensemble de ces données indique que les ARNm marqués à la biotine fixés au SMB contiennent des ribosomes fonctionnels associés à des ARNt peptidiques.L'isolement de ribosomes en cours de traduction contenant des ARNt peptidiques spécifiques permet l'étude des effets des antibiotiques ciblant les ARNt peptidiques ainsi que d'autres molécules sur la fonction et la structure des ribosomes. Dans les exemples présentés ici, l'antibiotique s parsamyn et l'acide aminé tryptophane inhibent le clivage hydrolytique de l'ARNt peptidique TNAC naissant par le facteur de relâchement RF deux dans les ribosomes isolés.L'interaction du tryptophane ou de la sparsomycine avec le ribosome induit également des changements structuraux dans certains nucléotides constituant l'ARN 23 S du ribosome en cours de traduction. Une fois maîtrisée, la partie principale de cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est correctement effectuée en suivant ces procédures. D'autres méthodes, comme la cryomicroscopie électronique, permettent des analyses structurales supplémentaires et peuvent être utilisées pour répondre à des questions complémentaires sur la structure du ribosome contenant un ARN peptidique unique.

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