Name: Isolement murin îlots pancréatiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 20 s
Description: Découvrez l'isolation d'îlots pancréatiques murins par injection de collagénase et gradient de Ficoll pour transplantation chez des souris diabétiques NOD. Cette méthode permet d'étudier le diabète et d'améliorer les traitements par greffe d'îlots.

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Préparation de la collagénase <ol><li> Peser la collagénase dans une mémoire tampon de 50 ml et ajouter l&#39;isolement coniques pour rendre la concentration finale, comme indiqué dans le tableau ci-dessous. Dissoudre la collagénase par vortex. (12 + 2 souris souris extra = 14 souris x 5 ml / souris = 70 ml de solution de collagénase total) (70 ml x 0,5 mg / ml ou 0,3 mg / ml = 35 mg ou 21 mg de collagénase P total) <table style="BORDER-RIGHT: #ddd 1px solid; BORDER-TOP: #ddd 1px solid; BORDER-LEFT: #ddd 1px solid; BORDER-BOTTOM: #ddd 1px solid; TEXT-ALIGN: left" border="0" width="80%"><tbody><tr><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Souche </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Âge </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Collagénase P (mg / ml) </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Temps (min) </th></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H, Balb / C, B6 </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12 semaines </td><td style="font-size: 12px"> 0.8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H, Balb / C, B6 </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12 semaines </td><td style="font-size: 12px"> 0.5 </td><td style="font-size: 12px"> 13 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD, NI NON </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12 semaines </td><td style="font-size: 12px"> 0.8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD, NI NON </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12 semaines </td><td style="font-size: 12px"> 0.5 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr></tbody></table> </li><li> Distribuer 2 ml de solution de collagénase dans chaque flacon de verre et le placer sur la glace. Charge à chaque seringue de 5 ml avec 3 ml d&#39;aiguille 30g collagénase ajouter et placer dans la glace (préparer au capot). </li></ol> Distension <ol><li> Juste avant la dissection, le sacrifice des animaux par dislocation cervicale. Vaporiser l&#39;ensemble du corps avec 70% d&#39;EtOH, ce qui rend complètement mouillée. Faire un V-Insision à partir de la zone génitale. Tourner la souris de manière à la queue est face à vous. </li><li> Enlever l&#39;intestin vers le côté gauche de la souris ouverte. Cela permettra d&#39;exposer le pancréas et le canal cholédoque. </li><li> Placez une pince hémostatique de chaque côté de l&#39;intestin grêle, où la voie biliaire draine, en laissant une petite poche pour solution de collagénase pour entrer dans l&#39;intestin. </li><li> Gonflez le pancréas grâce à la voie biliaire avec une aiguille 30G et seringue de 5 ml contenant 3 ml de solution de collagénase froid, à partir de la vésicule biliaire. </li><li> Retirez le pancréas du corps et de le placer dans une fiole contenant siliconé 2 ml de solution de collagénase. Cette étape doit être fait rapidement et le plus proprement possible, en minimisant la collecte de tissus adipeux et conjonctifs. </li><li> Placer le flacon sur la glace et répétez l&#39;étape 3 avec la souris suivante. </li></ol> La digestion <ol><li> Sceau chaque flacon et le placer dans un 37 ° C au bain-marie. Incuber pendant 13-17 minutes (le temps varie selon la souche et âge de l&#39;animal). </li><li> Après le temps s&#39;est écoulé, agiter vigoureusement le flacon. Le pancréas doit s&#39;écrouler. </li><li> Verser chaque digérer dans une passoire évier stériles dans une grande stériles 1000 bécher et avec force la pipette hors de l&#39;écran avec un tampon de lavage. Répartir le digère en tubes de 50 ml Coniques (3 pancreata/50 ml tube: si n = 12, utilisez suffisamment de tampon de lavage pour rendre le volume final de 200 ml et le distribuer aux tubes 4x50 ml). La dilution doit être fait rapidement et sur ​​la glace pour éviter la digestion îlot indésirables. </li><li> Isoler: Début de la centrifugeuse. Quand il atteint 1300 rpm, il s&#39;éteint. </li><li> Aspirer le surnageant en laissant environ 5 mL. Soyez très prudent de ne pas aspirer le culot. </li><li> Resuspendre le culot en tapant vigoureusement avec votre main, puis ajouter 50 ml de tampon de lavage. </li><li> Isoler: Début de la centrifugeuse. Quand il atteint 1300 rpm, il s&#39;éteint. </li><li> Reprendre le culot et laver avec 5 ml de tampon de lavage. </li><li> Transfert les 5 ml à 15 ml conique et spin bas, comme ci-dessus. </li><li> Aspirer le surnageant aussi complètement que possible. (Tampon restant pourrait causer le changement de la densité du Ficoll.) </li></ol> Ficoll Effectuer rapidement. Exposition à long terme de Ficoll est TOXIQUE pour les îlots. <ol><li> Assurez-pastille est complètement rompu avant d&#39;ajouter ficoll (tissu ininterrompue est difficile de remettre en suspension dans Ficoll). </li><li> Reprendre le culot dans 7 ml de Ficoll, densité 1,108, au vortex vigoureusement. </li><li> Couche sur le dessus de chaque densité de Ficoll 2ml de chacune des densités restent dans cet ordre: 1.096, 1.069, puis 1.037. </li><li> Spin pendant 15 minutes à 1800 rpm à 4 degrés, avec une pause OFF! </li><li> Choisissez îlots de la deuxième couche en utilisant spoid (stérile ppipette Lastic). Transférer toutes les collections à un coniques de 50 ml contenant environ 25 ml de tampon froid. </li><li> Lavez, comme ci-dessus, trois fois avec le tampon de lavage (répétant l&#39;étape 12-15). </li><li> Ilots Remettre en suspension dans 20 ml de RPMI-1640 (contenant 10% de FCS et de la pénicilline et la streptomycine, HEPES, MEM-NEAA) et mélanger doucement. Retirer 100 ul d&#39;échantillon pour le dénombrement. </li><li> Transférer 100 ul à 35 mm Grille-plaque contenant 1 ml de médias et une dithizone ml. </li><li> Incuber îlots restants dans RPMI 1640, dans un 37 ° C, 7% de CO 2 incubateur, dans 160 plaques mm avec un total de 30 ml de milieu / plaque. <img src="/files/ftp_upload/old/255_2008_8_24_3/255_Figure-01.png" alt="Figure 1" width="220" height="194" /></li></ol>

isolement murin îlots pancréatiques

Murine Pancreatic Islet Isolation

Isolement murin îlots pancréatiques

Bonjour, je suis Greg Zott. Je travaille au Centre du diabète de l'UCSF, dans le laboratoire de Bluestone, et aujourd'hui je vais vous montrer le processus d'isolement des îlots pancréatiques de souris. La procédure consiste à injecter une solution de collagénase dans le pancréas d'une souris donneuse C3 H, puis à prélever ce pancréas, à le digérer, à purifier les îlots sur un gradient de Ficoll, et enfin à les sélectionner manuellement en vue de leur transplantation ultérieure sous la capsule rénale d'une souris NOD diabétique, qui servira de receveur.Avant de commencer cette procédure, nous avons dilué notre solution d'ATE dans un tampon Hanks modifié et ajusté la concentration spécifiquement pour la souche de souris utilisée, la C3 H. Nous avons constaté que la digestion est meilleure avec une solution de collagénase à 0,8 mg par mL, et nous utiliserons cette solution pour l'injection dans le canal biliaire commun afin de distendre le pancréas. La procédure sera réalisée aujourd'hui par Pavo Codre du centre du diabète. Il effectuera l'injection, ouvrira la souris, exposera les intestins, puis injectera la solution dans le canal biliaire commun.Nous allons vaporiser du l'éthanol

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Atteindre de haute qualité et la quantité appropriée d'îlots humains est l'une des conditions préalables importantes pour la transplantation d'îlots de succès. Dans cette vidéo, nous décrire étape par étape les procédures pour l'isolement des îlots pancréatiques humains (partie I: la digestion et la collecte des tissus pancréatiques) en utilisant une méthode modifiée automatisés.

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie I: La digestion et la perception des tissus pancréatiques

Atteindre de haute qualité et la quantité appropriée d'îlots humains est l'une des conditions préalables importantes pour la transplantation d'îlots de succès. Dans cette vidéo, nous décrire étape par étape les procédures pour l'isolement des îlots pancréatiques humains (partie II: la purification et la culture d'îlots humains) en utilisant une méthode modifiée automatisés.

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie II: Purification et culture d&#39;îlots humains

Une description détaillée de la souris îlot isolement est décrit en utilisant la technique de la ponction du pancréas in situ canalaire et la perfusion d'une combinaison de collagénase purifiée et la protéase neutre.

Souris îlot de Langerhans isolement à l&#39;aide d&#39;une combinaison de la collagénase purifiée et protéase neutre

Les îlots pancréatiques, également appelés îlots de Langerhans, sont un amas de cellules endocrines qui produisent des hormones pour la régulation du glucose et d’autres fonctions biologiques importantes. Ce protocole explique une méthode pour isoler les îlots pancréatiques en perfusant d’abord la collagénase via l’ampoule de Vater pour digérer le tissu pancréatique exocrine et une centrifugation simplifiée par gradient de densité pour purifier les îlots des souris.

Isolement des îlots pancréatiques par perfusion de collagénase : une méthode enzymatique pour isoler les cellules des îlots pancréatiques

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des îlots à partir du modèle murin de diabète de type 2, Leprdb et les détails d’un test sur cellules vivantes pour la mesure de la sécrétion d’insuline à partir d’îlots intacts qui utilise la microscopie à 2 photons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

défis critiques pour le domaine de la recherche sur le diabète sont de comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la réplication β-cellules d'îlots et de développer des méthodes pour stimuler la régénération β-cellulaire. Ici une méthode de criblage à haut contenu pour identifier et évaluer l'activité de réplication favorisant β-cellulaire de petites molécules est présenté.

Un haut contenu<em&gt; In vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-cellulaire Plateforme de découverte de la réplication

Nous décrivons ici un protocole pour isoler les îlots intacts de souris néonatales. Pancreata ont été partiellement digéré avec de la collagénase, suivi d'un lavage et cueillette à la main. 20 - 80 amas d'îlots peuvent être obtenus par le pancréas de souris nouveau-nés, qui sont appropriés pour de nombreuses études d'îlots.

Isolation efficace des îlots fonctionnels de néonatales Pancréas souris

Ce protocole d'isolement d'îlots a décrit une nouvelle voie d'injection de collagène pour digérer le tissu d'exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s'agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L'isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.

Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules des îlots pancréatiques souris pour contrôler les inductions de ROS par les xénobiotiques afin d’identifier les potentiels chimiques xénobiotiques diabétogène.

Un îlots pancréatiques Murine Cell-based Screening for diabétogène Environmental Chemicals

Ici, nous présentons un protocole pour la formation image et la quantification de la dynamique du calcium dans les populations cellulaires hétérogènes, telles que les cellules des isfètes pancréatiques. Les reporters fluorescents sont livrés dans la couche périphérique des cellules dans l'înet, qui est alors immobilisé et image, et l'analyse par cellule de la dynamique de l'intensité de fluorescence est effectuée.

Imagerie de la dynamique du calcium dans les sous-populations de cellules d'islet pancréatique de souris

Cette étude a développé une méthode simplifiée pour extraire efficacement les îlots primaires fonctionnels et les cellules acinaires du pancréas de la souris, offrant un outil précieux pour étudier la communication intercellulaire dans la pathogenèse du diabète induit par la pancréatite aiguë.

Une méthode simple et rapide pour l’isolement simultané des îlots primaires et des cellules acinares pancréatiques primaires à partir de souris

Découvrez l'isolation d'îlots pancréatiques murins par injection de collagénase et gradient de Ficoll pour transplantation chez des souris diabétiques NOD. Cette méthode permet d'étudier le diabète et d'améliorer les traitements par greffe d'îlots.

Isolement murin îlots pancréatiques

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