Isolement murin îlots pancréatiques

Bonjour, je suis Greg Zott. Je travaille au Centre du diabète de l'UCSF, dans le laboratoire de Bluestone, et aujourd'hui je vais vous montrer le processus d'isolement des îlots pancréatiques de souris. La procédure consiste à injecter une solution de collagénase dans le pancréas d'une souris donneuse C3 H, puis à prélever ce pancréas, à le digérer, à purifier les îlots sur un gradient de Ficoll, et enfin à les sélectionner manuellement en vue de leur transplantation ultérieure sous la capsule rénale d'une souris NOD diabétique, qui servira de receveur.

Avant de commencer cette procédure, nous avons dilué notre solution d'ATE dans un tampon Hanks modifié et ajusté la concentration spécifiquement pour la souche de souris utilisée, la C3 H. Nous avons constaté que la digestion est meilleure avec une solution de collagénase à 0,8 mg par mL, et nous utiliserons cette solution pour l'injection dans le canal biliaire commun afin de distendre le pancréas. La procédure sera réalisée aujourd'hui par Pavo Codre du centre du diabète. Il effectuera l'injection, ouvrira la souris, exposera les intestins, puis injectera la solution dans le canal biliaire commun.

Nous allons vaporiser du l'éthanol sur la souris pour aplatir le pelage, puis nous vérifierons également que la souris a été sacrifiée correctement à l'aide d'une pression sur l'orteil. Pavo va maintenant ouvrir la souris et exposer l'intestin et le pancréas par une incision médiane. Le diaphragme sera également sectionné afin de confirmer que la souris est bien décédée.

Avant de commencer, je tiens à signaler certaines structures importantes. L'estomac se trouve juste ici, avec le pancréas attaché en dessous jusqu'au duodénum et au-dessus. Voici le foie, où nous trouverons la vésicule biliaire et le canal cholédoque, que vous pouvez voir juste ici.

Ensuite, Pavo isolera l'intestin grêle et repérera l'endroit où le canal cholédoque pénètre dans l'intestin grêle. Une fois l'intestin exposé, nous posons des pinces hémostatiques de type moustique de chaque côté du canal cholédoque. Nous avons constaté que cette méthode permet à davantage de collagénases d'atteindre le pancréas, alors que d'autres équipes tentent de placer la pince directement au-dessus du canal cholédoque.

Nous constatons que cette technique permet une meilleure pénétration de l'enzyme dans le pancréas. Il s'agit d'une procédure douce. Vous ne devez pas déchirer l'intestin.

Vous devez laisser les pinces reposer délicatement de chaque côté du canal cholédoque. Nous allons maintenant localiser une vésicule biliaire, et une fois celle-ci exposée, nous l'utiliserons comme repère pour injecter la collagénase dans le canal cholédoque. Powell utilise une aiguille de calibre 30 et une seringue de 5 cm³ contenant 3 mL de solution de collagénase.

Alors qu'il pénètre dans le canal cholédoque, il distend ce canal avec une solution de collagénase, puis progresse le long du canal cholédoque jusqu'à proximité de l'intestin. Pendant sa progression, la solution enzymatique est injectée et pompée dans le pancréas. Maintenant que le pancréas est gonflé avec la solution de collagénase, Powell va retirer les pinces hémostatiques, puis extraire délicatement le pancréas de la souris en le détachant soigneusement de l'intestin.

Il l'enlève de l'estomac. Très bien, puis en utilisant la rate comme poignée, il soulève le pancréas, puis le détache lentement au niveau du canal cholédoque, et c'est terminé. Le pancréas est étalé, puis la rate est retirée ; voici qu'il enlève le tissu mésentérique, ensuite le pancréas est placé dans une solution de collagénase 2 millimolaire, dans un flacon en verre stérilisé, et remis sur de la glace.

Le pancréas isolé que nous avons placé dans les vials en verre sera maintenant mis dans un bain-marie à 37 degrés pendant environ 17 minutes. Nous les avons placés dans un rack conique de 50 ml afin qu'ils ne remontent pas à la surface. Dès le début du bain, le minuteur est lancé et la digestion commence.

Une fois le temps de digestion terminé, les vials sont retirés, puis secoués et désagrégés doucement. Et lorsque le tissu commence à se désagréger, le vial est ensuite placé sur de la glace. Un tamis stérile est placé au-dessus d’un bécher de 400 mil contenant du tampon de lavage.

Le digestif de pancréas est ensuite versé soigneusement sur le tamis dans le tampon de lavage. À des fins de démonstration, la hotte a été éteinte et la vitre de la hotte a été relevée afin que nous puissions voir ce que nous faisons. Une fois que le digestif de pancréas a été versé dans le bécher, les vials sont rincés avec le même tampon de lavage, et le tampon de lavage est placé sur le tamis.

Nous avons une seringue remplie de tampon de lavage. Nous allons l'utiliser pour laver vigoureusement le tissu à travers la passoire. L'idée est de libérer tous les anneaux libres non attachés à la matrice, tout en laissant les membranes et le tissu non digéré sur la passoire.

Et lorsque vous avez terminé le lavage d'un tissu, voici ce que vous observez généralement à la fin de la procédure. Le tissu pancréatique se trouvant au fond du tube sera désormais transféré dans deux tubes coniques de 50 ml, puis le tissu sera lavé, mélangé uniformément, et réparti de manière égale afin d'obtenir un volume de culot identique dans chaque tube. Le bécher est maintenant rincé avec du tampon de lavage supplémentaire.

Les parois sont rincées afin de récupérer tous les tissus qui sont entrés dans le bécher. Ensuite, le contenu est réparti équitablement entre les deux tubes, 50 ml chacun. Les tubes coniques sont alors complétés avec du tampon de lavage.

Le tissu est retourné plusieurs fois, puis placé dans une centrifugeuse. Il s'agit d'une courte centrifugation. On laisse la centrifugeuse atteindre mille tr/min, puis on l'arrête.

Le tissu est à ce stade très sensible, et vous ne devez pas trop le comprimer. Les tubes sont retirés et nous répéterons cette étape de lavage trois fois supplémentaires. C'est la fin du troisième lavage.

Les composants du tube conique de 50 ml sont transférés dans le tube conique de 15 ml et centrifugés à mille tr/min, puis arrêtés. Le surnageant sera éliminé et la première partie de l'appel FI commencera. Nous sommes à l'étape où nous avons notre digest de pancréas sous forme de culot.

Nous allons resuspendre ce tissu afin qu’il soit bien détaché des culots. Nous ajouterons le premier gradient de densité, qui est 1 1 0 8. Nous ajouterons cinq mils à chaque tube.

Le culot est ensuite mélangé soigneusement dans chacun des gradients. Il est important d'obtenir une bonne répartition des tissus dans votre gradient le plus dense. Nous allons maintenant superposer deux millilitres de densité 1 0 9 6.

Nous allons ensuite superposer deux mils de densité 1 0 6 9, puis par-dessus la densité 1 0 3 7. Il est important, lors de la superposition des densités, de ne pas les mélanger. Toutes les couches ont alors été ajoutées dans le tube.

Et vous pouvez voir que ceci est le sommet de 1 1 0 8, le sommet de 9 1 0 9 6, le sommet de 1 0 6 9 et le sommet de 1 0 3 7. Vous pouvez constater que le tissu commence déjà à migrer vers sa densité appropriée, même sans centrifugation. Les gradients fial sont portés à 1800 tr/min pendant 15 minutes, et pensez à maintenir le frein désactivé après avoir retiré les tubes de la centrifugeuse.

On peut observer entre la couche 0 0 9 6 et la couche 0 0 7 une belle bande de tissu d'œillet de Pablo. On retire maintenant la couche 0 3 7 pour éliminer tout débris tissulaire et l'ADN qui aurait pu être libéré lors du traitement. À l’aide d’une pipette Pasteur stérile en plastique, il va prélever la couche d’îlots et les transférer dans un tube conique de 50 ml contenant 25 ml de tampon de lavage.

Vous souhaitez effectuer cette étape rapidement car le fol est toxique pour les œillets. Nous avons effectivement retiré la totalité de la couche 0 6 9 et 0 9 6. Pavo coupe le haut de la pipette en plastique et la rince avec du tampon de lavage.

Les embouts sont ensuite centrifugés comme nous avons centrifugé précédemment. La centrifugation atteint mille tr/min, puis nous l’arrêtons et nous aspirons. Les embouts du surnageant seront lavés trois fois avec le milieu de lavage.

Nous venons donc de terminer le processus d'isolement des paupières : nous sommes passés de la digestion au gradient de fol à la purification des boutons oculaires. Après notre troisième lavage avec le tampon de lavage, nous avons resuspendu les boutons oculaires dans notre milieu RPMI et les avons placés dans une plaque de culture tissulaire. Ces boutons oculaires sont désormais prêts pour des tests in vitro ou des préparations in vivo, comme la greffe de boutons oculaires.