Isolement murin îlots pancréatiques

Bonjour, je m’appelle Greg Zott. Je travaille au Centre du diabète de l’UCSF dans le laboratoire Bluestone, et aujourd’hui, je vais vous montrer le processus d’isolement des œillets de souris. La procédure implique l’injection d’une solution de collagénase dans le pancréas d’une souris donneuse C3 H, où nous retirerons ensuite ce pancréas, le digérerons, purifierons les œillets sur un gradient fial, puis les sélectionnerons à la main pour une transplantation finale dans la capsule rénale d’une souris NOD diabétique, qui sera notre receveuse.

Avant de commencer cette procédure, nous avons dilué notre solution d’ATE dans un tampon Hanks modifié et nous avons ajusté la concentration spécifique à la souche de souris que nous utilisons, le C3 H. Nous avons constaté que les digestions sont meilleures à une solution de collagénase de 0,8 mg par mil, et nous l’utiliserons pour injecter dans le canal cholédoque pour distendre le pancréas. Exécution. La procédure d’aujourd’hui sera Pavo codre du centre de diabète. Il va injecter, ouvrir la souris, exposer les intestins, puis injecter dans le canal cholédoque.

Nous vaporiserons la souris avec de l’éthanol pour garder les poils détachés, puis nous vérifierons également que la souris a été correctement sacrifiée avec une pincée d’orteil. Pavo va maintenant ouvrir la souris et exposer l’intestin et le pancréas avec une incision médiane. Le diaphragme sera également coupé pour vérifier que la souris sera sacrifiée.

Avant de commencer, j’aimerais souligner certaines des structures importantes. L’estomac se trouve juste ici, avec le pancréas attaché en dessous, dans le duodénum et au-dessus. C’est le foie où se trouvent la vésicule biliaire et le canal cholédoque, que vous pouvez voir ici.

Donc, ce que Pavo fera ensuite, c’est qu’il isolera l’intestin grêle, trouvera où le canal cholédoque pénètre dans l’intestin grêle. Une fois l’intestin exposé, nous clampons de chaque côté du canal cholédoque avec des pinces anti-moustiques. Nous constatons que cela permet à plus de collagénats de pénétrer dans le pancréas tandis que d’autres groupes essaient de diriger la pince sur le dessus du canal cholédoque.

Nous constatons qu’il s’agit d’une meilleure technique pour permettre à l’enzyme de pénétrer dans le pancréas. Il s’agit d’une procédure douce. Vous ne voulez pas déchirer l’intestin.

Vous voulez permettre aux pinces de reposer doucement de chaque côté du canal cholédoque. Maintenant, nous allons trouver une vésicule biliaire, et une fois que la vésicule biliaire est exposée, nous l’utiliserons comme guide pour injecter la collagénase dans le canal cholédoque. Powell’s utilise une aiguille de calibre 30 avec une seringue de cinq cc contenant trois moulins de solution de collagénase.

Lorsqu’il entre dans le canal cholédoque, il distension ce canal avec une solution de collagénase, puis il descend dans le canal cholédoque jusqu’à ce qu’il atteigne près de l’intestin. Et pendant qu’il descend, les solutions enzymatiques pompées dans le injecté dans le pancréas. Maintenant que le pancréas est gonflé avec une solution de collagénase, Powell va retirer les hémostatiques, puis retirer le pancréas de la souris en l’arrachant soigneusement de l’intestin.

Il le retire de l’estomac. D’accord, puis en utilisant la rate comme poignée, il soulève le pancréas, puis le coupe lentement dans le canal cholédoque, et c’est tout. Le pancréas est disposé, puis la rate est retirée, et là, il enlève le tissu méso-entérique, puis le pancréas est placé dans une solution de collagénase à deux moulins et un flacon en verre stérilisé et il est remis sur de la glace.

Le pancréas isolé que nous mettons dans les flacons en verre sera maintenant placé dans un bain-marie à 37 degrés pendant environ 17 minutes. Nous les avons placés dans un support conique de 50 mil pour qu’ils ne flottent pas. Une fois pendant le bain, la minuterie démarre et la digestion commence.

Une fois le temps de digestion terminé, les flacons sont retirés, puis ils sont secoués et perturbés doucement. Et une fois que le tissu commence à se désagréger, le flacon est ensuite placé sur de la glace. Un tamis stérile est placé sur un bécher de 400 mil qui contient un tampon de lavage.

La digestion du pancréas est ensuite soigneusement versée sur l’écran dans le tampon de lavage. À des fins de démonstration, le capot a été éteint et la vitre du capot a été soulevée pour que nous puissions voir ce que nous faisons. Une fois que la digestion du pancréas est versée dans le bécher, les flacons sont rincés avec le même tampon de lavage et le tampon de lavage placé sur l’écran.

Nous avons une seringue remplie de tampon de lavage. Nous l’utiliserons pour laver avec force le mouchoir à travers l’écran. L’idée est de libérer tous les œillets lâches qui ne sont pas attachés à la matrice, mais en laissant les membranes et les tissus non digérés sur l’écran.

Et lorsque vous avez fini de laver un mouchoir, c’est ce que vous voyez généralement à la fin de la procédure. Le tissu pancréatique qui se trouve au fond du tube sera maintenant transféré en deux cônes de 50 mil, et le tissu sera lavé, le tissu sera mélangé uniformément, puis réparti uniformément afin que nous ayons un volume de granules égal dans chaque tube. Le bécher est maintenant rincé avec plus de tampon de lavage.

Les côtés sont rincés afin que vous récupériez tous les tissus qui sont entrés dans le bécher. Ensuite, il est réparti également entre chacun des deux, tous deux de 50 mil. Les cônes sont ensuite complétés par un tampon de lavage.

Le tissu est inversé plusieurs fois, puis placé dans une centrifugeuse. Il s’agit d’un tour rapide. La centrifugeuse est laissée atteindre un millier de tr/min, puis elle est éteinte.

Le tissu à ce moment est très S Les œillets sont très sensibles et vous ne voulez pas trop les compacter. Les tubes sont retirés et nous ferons cette étape de lavage trois fois de plus. C’est la fin du troisième lavage.

Les composants du tube conique de 50 mil sont transférés dans le tube conique de 15 mil et la centrifugeuse pendant mille RP M, puis arrêtés. Le supernat sera supprimé et la première partie de l’appel FI sera lancée. Nous sommes à l’étape où nous avons notre granulé di pancréas digest.

Nous allons remettre ce tissu en suspension pour qu’il soit bien lâche pour les granulés. Nous allons ajouter le premier gradient de densité, qui est 1 1 0 8. Nous ajouterons cinq mils à chaque tube.

Le granulé est ensuite soigneusement mélangé dans chacun des dégradés. Il est important que vous obteniez une bonne répartition des tissus dans votre pente la plus forte. Maintenant, nous allons superposer deux mils de densité 1 0 9 6.

Nous allons ensuite superposer deux mils de densité 1 0 6 9, puis au-dessus de cette densité 1 0 3 7. C’est important, lorsque vous superposez les densités, que vous ne mélangez pas. Ensuite, toutes les couches ont été ajoutées au tube.

Et vous pouvez voir qu’il s’agit du sommet de 1 1 0 8, du sommet de 9 1 0 9 6, du sommet de 1 0 6 9 et du sommet de 1 0 3 7. Et vous pouvez voir que le tissu commence déjà à se déplacer à sa bonne densité, même sans fusion des centri. Les gradients fiaux sont mis à vitesse maximale à 1800 tr/min pendant 15 minutes, et n’oubliez pas de garder le frein desserré une fois les tubes retirés de la centrifugeuse.

Vous pouvez voir entre la couche 0 0 9 6 et 0 0 7, il y a une belle bande de tissu d’œillet de Pablo. Maintenant, en retirant la couche 0, 3, 7 pour éliminer tous les débris de tissus et l’ADN qui auraient pu être libérés pendant le traitement. À l’aide d’une pipette de pâturage en plastique stérile, il va maintenant retirer la couche d’îlots et les transférer dans un cône de 50 mils contenant 25 mils de tampon de lavage.

Vous voulez faire cette étape rapidement car le fol est toxique pour les œillets. En fait, nous avons supprimé toute la couche 0 6 9 et 0 9 6. Pavo coupe le haut de la pipette de pâturage en plastique et la rince avec un tampon de lavage.

Les œillets sont ensuite centrifuges comme nous centrifugeons auparavant. La centrifugeuse est portée à mille tr/min, puis nous l’arrêtons et nous aspirons. Les œillets surnageants seront lavés trois fois avec un produit de lavage.

Nous venons donc de terminer le processus d’isolation des paupières que nous avons fait passer de la digestion au gradient de fol jusqu’aux œillets purifiés après notre troisième lavage avec un tampon de lavage, nous avons remis les œillets en suspension dans notre milieu RPMI et nous l’avons joué dans une plaque de culture tissulaire. Ces œillets sont maintenant prêts pour des tests in vitro ou des préparations in vivo comme la greffe d’œillets.