Isolement et culture de cellules de la zone néphrogénique du rein d'embryon de souris

L'objectif général de cette procédure est de générer une culture primaire de cellules de la zone néphrogène à partir du rein en développement. Cela est réalisé en disséquant d'abord les reins d'embryons du jour 17,5. L'étape suivante de la procédure consiste à retirer les capsules rénales.

Une digestion enzymatique limitée des organes est ensuite réalisée afin de détacher les cellules du mésenchyme apical et du stroma cortical de la zone néphrogène. La dernière étape de la procédure consiste à ensemencer les cellules sur de la fibronectine et à les cultiver dans un milieu sans sérum. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui démontrent une population cellulaire purifiée de la zone néphrogène par immunomarquage de marqueurs spécifiques.

Bien que cette méthode puisse être utilisée pour étudier la signalisation cellulaire, elle peut également s'appliquer à la compréhension des exigences du substrat pour l'expansion cellulaire. Par exemple, pour les techniques de greffe, la procédure sera démontrée par Derek Adams, technicien dans mon laboratoire, et Aaron Brown, postdoctorant dans mon laboratoire. Après avoir préparé les solutions nécessaires et traité les boîtes de culture selon le protocole écrit, commencez la dissection du rein embryonnaire de souris en sacrifiant la mère à E 17,5.

Conformément aux directives de votre institution, retirez l'utérus et placez-le dans une boîte de Pétri contenant plusieurs millilitres de docos sate, de solution saline tamponnée ou de DPVS avec calcium et magnésium. Sous un microscope stéréo, utilisez une pince de bijoutier pour retirer chaque embryon et une autre paire de pinces pour les décapiter. Une fois que toute la portée a été retirée de l'utérus et décapitée, transférez les embryons dans une boîte de Pétri propre contenant suffisamment de DPBS avec calcium et magnésium pour recouvrir les embryons.

Laisser autant que possible le sang et les débris tissulaires pour chaque embryon, pratiquer une incision circulaire dans la paroi abdominale au niveau des cordon ombilical à l’aide d’une pince. Ensuite, placer l’embryon sur le dos et fixer les épaules à l’aide d’une première pince. À l’aide d’une seconde pince, retirer les organes internes depuis les poumons jusqu’à la vessie.

Les reins seront attachés à l'arrière du massif des organes internes. Ensuite, séparez délicatement les reins du reste des organes. Veillez à maintenir les reins reliés l'un à l'autre.

Ensuite, maintenez le tissu entre les reins avec une pince et saisissez la glande surrénale attachée à la capsule d'un des reins avec l'autre pince. Détachez délicatement la capsule du rein. Veillez à ne pas endommager le rein.

Veillez à retirer toute capsule restante du rein ainsi que l'utérus s'il est encore attaché. Répétez l'opération avec le rein restant. Enfin, coupez une pipette de transfert à un diamètre approprié et transférez délicatement les reins dans un tube en polystyrène de cinq millilitres contenant du HBSS.

Répétez l'isolement rénal pour chaque embryon et regroupez les reins dans un tube, jusqu'à huit reins par tube, dans un environnement stérile. Commencez le processus de digestion enzymatique en éliminant d'abord la solution HBSS du tube de cinq millilitres contenant les reins à l'aide d'une pipette. Veillez à éviter tout contact avec les reins, puis ajoutez immédiatement 1,5 millilitre de collagénase, une solution digestible à base de pancréatine.

Répétez pour chaque tube de reins et fermez les tubes. Ensuite, placez-les sur un agitateur dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Juste avant la fin de l'incubation, ajoutez trois microlitres d'ADN à une concentration d'une unité par microlitre dans un nouveau tube en polystyrène de cinq millilitres pour chaque digestion réalisée.

Après l'incubation, retirez rapidement le digestif de l'incubateur et ajoutez 75 microlitres de FCS en inversant trois fois pour mélanger. Laissez reposer deux minutes à température ambiante. Transférez ensuite 1,4 millilitre de la suspension cellulaire dans un tube en polystyrène de cinq millilitres contenant le mélange d'ADN, puis placez-le sur un agitateur dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après l'incubation, transférez chaque suspension cellulaire dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre et centrifugez à 325 × g pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le surnageant, centrifugez à nouveau les tubes à 325 × g pendant cinq minutes. Resuspendez le culot dans un millilitre de 5 % FBS HBSS en pipetant de haut en bas cinq à six fois.

Fermez chaque tube avant de passer à l'échantillon suivant. Après centrifugation, retirez le SNAT et ajoutez 500 microlitres de KSFM avec additifs à chaque tube une fois que le milieu a été ajouté à tous les tubes. Resuspendez délicatement chaque culot cellulaire en pipetant cinq à six fois de haut en bas avec une micropipette de un millilitre. Rassemblez toutes les suspensions cellulaires dans un nouveau tube en polystyrène de cinq millilitres.

Filtrez maintenant la suspension cellulaire à travers un embout de filtre cellulaire de 40 microns préhumidifié et récupérez le filtrat dans un nouveau tube en polystyrène. Évitez de toucher le filtre avec l'embout de pipette une fois que tout le filtrat a été récupéré. Refiltrez une deuxième fois le filtrat à travers un nouveau filtre cellulaire préhumidifié.

Retirer le filtre et boucher le tube avec un bouchon stérile provenant d'un nouveau tube. Compter les cellules et les ensemencer à une densité de 100 000 à 200 000 cellules par centimètre carré dans du milieu KSM contenant des additifs, en utilisant une plaque de culture codée par fibre. Laisser les cellules de la zone néphrogène se rétablir et s'attacher dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux à quatre heures avant toute stimulation destinée à l'expérimentation.

On voit ici un contraste de phase. Image à 20 x de cellules de la zone néphrogène ensemencées à raison de 200 000 cellules par centimètre carré et cultivées pendant 24 heures. Sur cette image, les cellules de la zone néphrogène ont été marquées avec un anticorps anti-PAX2, spécifique des cellules souches du néphron, en rouge, tandis que les noyaux en bleu ont été contre-marqués au DAPI.

Une vue en contraste de phase d'un groupe de progéniteurs de néphrons est présentée avec un grossissement de 40 x. Afin de démontrer davantage la spécificité, les cellules de la zone néphrogène ont été isolées à partir d'embryons possédant laxy sous le contrôle du promoteur Fox D un, qui est exprimé dans la population de cellules stromales. Au sein de la zone néphrogène du rein en développement, les cellules ont ensuite été marquées au DAPI Titan fi pour les noyaux en bleu, à la phalloïdine pour l'actine F en vert et à l'anticorps anti-bêta-galactosidase en rouge.

Une fois maîtrisée, une culture primaire en monocouche de cellules de la zone néphrogène peut être établie en environ deux heures. Ces cultures facilitent des études rapides et à haut débit des voies de signalisation cellulaire durant le développement des progéniteurs du néphron, étant particulièrement propices aux traitements par transduction virale, par protéines recombinantes ou par petites molécules. Des procédures supplémentaires de tri cellulaire peuvent également être utilisées pour isoler des types cellulaires spécifiques à partir de ces cultures.