Name: Modification ES / OP9 co-culture protocole prévoit caractérisation améliorée de Progeny hématopoïétiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Découvrez la différenciation des cellules souches embryonnaires murines en lignées hématopoïétiques via co-culture avec cellules stromales OP9 mStrawberry. Cette méthode permet l'évaluation complète de toute la progéniture dérivée des ES.

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Nous remercions U. Ganapati pour la création et l&#39;expérimentation du mStrawberry OP9 lignée cellulaire. De plus, nous remercions H. Shafifor son aide à la co-culture. HP est soutenue par une bourse de l&#39;Institut National Heart, Lung, and Blood (F31HL087714) (HP). Le contenu de ce travail est la seule responsabilité de l&#39;auteur et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Institut National Heart, Lung, and Blood ou les National Institutes of Health (NIH). Le débit UCLA cytométrie Core Facility est soutenu par le NIH (CA-16 042 et AI-28697), le Jonsson Cancer Center, de l&#39;UCLA AIDS Institute et de l&#39;UCLA School of Medicine.

1. Préparation des cellules ES <ol><li> Les cellules ES culture selon le protocole standard pour votre lignée cellulaire donnée. Assurez-vous de préparer des cellules ES assez pour plaque sur les cellules OP9 mStrawberry pour la Journée 0 (cellules ES seront plaquées à 1x10 ^ 3 cellules par cm 2 au jour 0) </li></ol> 2. Préparation des cellules OP9 <ol><li> Avant croissante mStrawberry OP9 cellules, préparer le milieu de croissance OP9 OP-9 milieu de culture cellulaire <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Stock </td><td> Conc final. </td><td> Volume (ml) </td></tr><tr><td> AMEM </td><td></td><td></td><td> 39,5 </td></tr><tr><td> FBS (OP-9 testés) </td><td> 100% </td><td> 20% </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> 100X (200mm) </td><td> 2mM </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50mL </td></tr></tbody></table> Conserver à 4 ° C et utiliser dans une semaine de préparation </li><li> Afin de maintenir mStrawberry OP9 cellules, les médias doivent être changés tous les 2 jours et les cellules doivent être repiquées avant d'atteindre les cellules de confluence (subculture à 70-90% de confluence). cultures de cellules OP9 mStrawberry sont jamais grandi au delà de 90% de confluence comme cela se traduira dans leur différenciation en adipocytes. Voir Figure 3. <ol class="lalpha"><li> Repiquer les cellules par des cellules à laver avec du PBS 2X (ou 1x avec PBS 1x + 0,1% à la trypsine-EDTA) </li><li> Ajouter préchauffé 0,1% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 5 minutes (ou jusqu'à ce que les cellules se détacher) </li><li> Lorsque les cellules se sont détachées, ajouter moyennes OP-9 de la croissance. Transfert des cellules dans un tube de 50 ml conique. </li><li> Pellet cellules à 300 xg pendant 5 minutes à température ambiante. Rejeter le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans l'eau douce mStrawberry OP9 milieux de croissance </li><li> Cellules de la plaque à une densité minimale de 10 4 cellules / cm 2 </li><li> Cultivez mStrawberry OP9 cellules à confluence commençant 3 jours avant le jour nécessaire pour les cellules ES co-culture (jours 0, 5, ou Jour8 / 9 de l'expérience) </li></ol></li></ol> 3. ES / mStrawberry OP9 co-culture <ol><li> Préparez le support de différenciation co-culture <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Stock </td><td> Finale </td><td> Volume (ml) </td></tr><tr><td> AMEM </td><td></td><td></td><td> 39,5 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 100% </td><td> 20% </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> 200 mM </td><td> 2mM </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50mL </td></tr></tbody></table></li><li> mStrawberry OP9 cellules (Jour -3) <ol class="lalpha"><li> TOUJOURS Subculture OP9 cellules -3 jours, alors que vous avez couches confluentes de cellules OP9 mStrawberry pour 0 Jour de la co-culture. Voir la figure 4b. Plaque mStrawberry OP9 cellules à 1x10 4 / cm 2 pour confluence au jour 0. Soyez sûr de sous-culture des cellules supplémentaires pour Jour 5 et Jour 8 / 9 pour la poursuite de la co-culture. </li></ol></li><li class="jove_content"> ES / mStrawberry OP9 co-culture Set-Up (jour 0) <ol class="lalpha"><li class="jove_content"> Laver les cellules ES 2x avec du PBS </li><li> Trypsiniser cellules ES avec préchauffé 0,25% de trypsine-EDTA, incuber pendant 5min à 37 ° C </li><li> Ajouter le média de différenciation co-culture de cellules </li><li> Pellet cellules ES à 400xg, 5-7min, RT. Rejeter le surnageant </li><li> Resuspendre les cellules dans les médias de différenciation co-culture </li><li> Retirez le support du mStrawberry OP9 cellules </li><li> Ajouter le média de différenciation co-culture à mStrawberry flacons OP9 </li><li> Plaque 1x10 cellules ES 3 / cm 2 à flacon de mStrawberry OP9 cellules. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 avec l'humidité. </li></ol></li><li> mStrawberry OP9 cellules (Jour 2) <ol class="lalpha"><li> OP9 mStrawberry Subculture de sorte que vous avez des couches confluentes de cellules pour mStrawberry OP9 Jour 5 de la co-culture. Plaque mStrawberry OP9 cellules à 1x10 4 / cm 2 pour confluence au Jour 5 (comme dans l'étape 3.2). Soyez sûr de sous-culture des cellules supplémentaires pour la Journée 8 / 9, si nécessaire (comme dans l'étape 2.2). </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 co-culture (Jour 3) <ol class="lalpha"><li> Retirez délicatement moyennes à partir de co-culture avec des produits frais et de remplacer milieu de différenciation co-culture </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 co-culture (Jour 5) <ol class="lalpha"><li> Se laver soigneusement les co-cultures 2x avec du PBS </li><li> Trypsiniser cellules avec préchauffé 0,25% de trypsine-EDTA </li><li> Laver les cellules hors flacon avec les médias de différenciation co-culture </li><li> Cellules Pellet au 400xg, 7min, RT. Rejeter le surnageant </li><li>Ajouter le média de différenciation co-culture de cellules. Utiliser une aiguille de calibre 21 bluntended pour resuspendre les cellules et d'assurer la suspension seule cellule </li><li> Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Devrait avoir 100 à 150 fois plus en nombre de cellules ES du jour 0. </li><li> Réensemencez 6.48x10 4 / cm 2 - 7.76x10 4 / cm 2 de co-culture de cellules sur une nouvelle couche de confluence, les cellules OP9 mStrawberry </li><li> Jour 5 ESSAIS-restant co-culture des cellules peuvent être utilisées pour l'analyse de cytométrie en flux, cytopreps (30K cellules), des dosages à puce, etc </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 co-culture (Jour 8 / 9 et la Journée 12) <ol class="lalpha"><li> Retirez le support de différenciation du ballon et sauver. Lavez monocouche 1x avec du PBS pour éliminer les cellules hématopoïétiques en suspension. Ne jetez pas sur les cellules hématopoïétiques. </li><li> Trypsiniser cellules adhérentes avec préchauffé 0,25% de trypsine-EDTA </li><li> Laver les cellules hors flacon avec les médias de différenciation ES et ajouter à cellules hématopoïétiques trouve en suspension = </li><li> Cellules Pellet au 400xg, 7min, RT. Rejeter le surnageant </li><li> Ajouter une différenciation co-culture des médias ou du PBS aux cellules. Utiliser une aiguille de calibre 21 bluntended pour resuspendre les cellules et d'assurer pour les cellules de cellule unique Comte de suspension à l'aide d'un hémocytomètre. </li><li> Co-culture peut être poursuivi pendant 14 jours afin d'évaluer plus mature progéniteurs hématopoïétiques par des re-semis de co-culture de cellules sur une nouvelle couche de confluence, les cellules OP9 mStrawberry au Jour 8 ou 9 puis à nouveau le jour 12. Réensemencez nombre de cellules optimisé basé sur la récupération des cellules nécessaires pour le jour de dosage. </li></ol></li><li> Évaluation des ES dérivées descendance (Jour 1-14). ES dérivées de la descendance peut être évaluée sur n'importe quel jour de la co-culture par un écoulement tri mStrawberry cellules négatives (ES dérivées de descendance). <ol class="lalpha"><li> Retirez le support de différenciation du ballon et sauver. Lavez monocouche 1x avec du PBS pour éliminer les cellules hématopoïétiques en suspension. Ne jetez pas sur les cellules hématopoïétiques. </li><li> Trypsiniser cellules adhérentes avec préchauffé 0,25% de trypsine-EDTA </li><li> Laver les cellules hors flacon avec les médias de différenciation co-culture et l'ajouter aux cellules hématopoïétiques trouve en suspension </li><li> Cellules Pellet au 400xg, 7min, RT. Rejeter le surnageant </li><li> Resuspendre les cellules avec 21 aiguille de calibre bluntended et compter </li><li> Descendances ES dérivées (mStrawberry cellules négatives) peuvent être triés du flux positifs mStrawberry OP9 cellules. Descendances ES dérivées peuvent alors être caractérisé par une analyse de cytométrie en flux, cytopreps, des dosages à puce, etc </li></ol></li></ol> 4. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. ES / mStrawberry OP9 co-culture du système. Notre laboratoire utilise une étude in vitro de cellules ES de co-culture du système au modèle de développement hématopoïétique. Dans ce système de co-culture, les cellules ES de différencier, dans hémangioblastes au Jour 5, lorsqu'il est placé sur une couche confluente de cellules mStrawberry OP9. Comme le produit de co-culture, précurseurs hématopoïétiques sont présents au Jour 8, tandis terminale différenciée lignées hématopoïétiques apparaissent au jour 14. Les flèches indiquent jours de différenciation lors du repiquage ES dérivées de la descendance sur de nouvelles couches confluentes de cellules dans mStrawberry OP9 nécessaire. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Une bonne différenciation des cellules ES. Les cellules ES sont ensemencées sur une couche confluente de mStrawberry OP9 au jour 0. ES dérivées de la descendance commence à devenir visible au jour 3 de la différenciation, avec l'ES-dérivée progéniture ressemble à un amas de cellules avec une frontière définie ou début pour former un motif verticille. Hémangioblastes, qui sont le précurseur commun mésodermiques pour les lignées endothéliales et hématopoïétiques, doit apparaître comme entassés verticilles de cellules au Jour 5. Pour la co-culture de plus longues périodes de cinq jours, ES dérivées de la descendance doit apparaître comme des amas de cellules hématopoïétiques. Deux à quatre pôles unicellulaires, au Jour 6 / 7, doit apparaître et se développer en des amas de cellules plus grandes par jour 8 / 9 de la co-culture. Descendances ES Autres dérivés sont également trouvés étroitement liée à la couche de cellules stromales adhérentes. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Échec de différenciation des cellules ES. Les résultats de cette co-culture reflètent mauvaise différenciation des cellules ES. Notez comment la descendance ES dérivées n'apparaissent pas dans un schéma verticille au Jour 5. L'absence de cellules dans un modèle verticille indique la formation hémangioblaste incorrecte. Si hémangioblaste ne se développe pas correctement, puis a continué de co-culture se traduira dans la différenciation hématopoïétique lignée rabougris. Co-cultures avec la formation hémangioblaste incorrecte doit être jeté. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. cultures cellulaires mStrawberry OP9. (A) mStrawberry OP9 cellules sont repiquées à70-90% de confluence. (B) Pour une différenciation appropriée, les cellules ES et ES dérivées descendance sont placés sur une couche excessivement confluent de mStrawberry OP9 cellules. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Représentant ES / mStrawberry profil OP9 flux de co-culture. Toute la descendance ES dérivées de cellules négatives sont mStrawberry et peuvent être triées à partir du flux de OP9 mStrawberry cellules. mStrawberry porte de cellule négative a été déterminée en utilisant un ES/OP9 traditionnelle de co-culture.

<ol><li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+mammalian+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of mammalian hematopoiesis.</a> Exp Hematol. 31, 1160-1160 (2003).</li>
<li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+patterning+of+the+mouse+embryo%3A+implications+for+hematopoietic+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation.</a> Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).</li>
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<li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies%3A+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).</li>
<li>Ganapati, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+notch+signaling+in+normal+and+neoplastic+hematopoiesis%3A+global+gene+expression+profiling+in+response+to+activated+notch+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression.</a> Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).</li>
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</ol>

Une différenciation adéquate des cellules ES sur couche confluente de cellules OP9 mStrawberry résultats dans la production de FLK1 hémangioblastes + au jour 5 de la co-culture. Hémangioblastes doit apparaître comme entassés verticilles de cellules, comme observé dans la figure 1. Pour le reste de la co-culture, visible ES dérivées de la descendance doit apparaître comme des amas de cellules hématopoïétiques (figure 1). Au Jour6 / 7 de deux à quatre groupes de cellules doit apparaître et se développer en des amas de cellules plus grandes (deux adhérentes et en suspension) par jour 8 / 9 de la co-culture. Descendances ES Autres dérivés sont également trouvés étroitement liés dans la couche de cellules stromales adhérentes. Bien que ne figurant pas dans le protocole, il est essentiel de pré-test du FBS utilisée dans le milieu de croissance ES, le OP9 mStrawberry milieux de croissance et de l&#39;OP9 ES / mStrawberry médias différenciation. Correctement testé le sérum doit assurer une bonne croissance des cellules mStrawberry OP9, ainsi que la différenciation correcte des cellules ES en co-culture jusqu&#39;au 5ème jour de la différenciation. Comme alternative ou en complément de mStrawberry OP9 cellules, les cellules OP9 peut être irradié, à 8000 rads, avant de semer à confluence (7.8x10 4 cellules / cm 2). L&#39;irradiation des cellules OP9 permet l&#39;élimination des étapes répétées replating, ainsi que, permet d&#39;éliminer presque complète des anciens, contaminant OP9 cellules à partir d&#39;essais en aval. OP9 cellules ont été conçues pour exprimer la protéine de transduction par mStrawberry OP9 cellules avec 3ug/mL d&#39;un vecteur lentiviral mStrawberry exprimer sous le contrôle d&#39;un promoteur CMV (CMV pRRLsin-vecteur, vecteur de l&#39;UCLA de base). Standard ES/OP9 co-culture protocoles impliquent la mise en place des cellules ES sur une couche confluente OP9 cellules, ainsi que, une étape replating jour 5, afin de réduire ancienne, contaminant OP9 cellules de passage cellulaire. En outre, seuls les cellules hématopoïétiques trouve en suspension sont éliminées pour l&#39;évaluation des ES dérivées de la descendance. Cependant, à la fois avec une étape replating et la récolte des cellules en suspension que l&#39;on manque potentiellement un nombre substantiel de l&#39;élaboration ES dérivées de cellules hématopoïétiques. Cette question devient importante pour répondre lorsque vous essayez de caractériser les défauts hématopoïétiques associés aux lignes ES KO. Afin de contourner ce problème notre laboratoire a utilisé une modification de co-culture, à travers l&#39;utilisation de mStrawberry exprimant OP9 cellules. Ceci assure que toute la descendance ES sont transférés à la poursuite de co-culture au jour 5, et pour la récolte de toute la descendance ES dérivées pour les dosages en aval. Cette modification prévoit une outils utiles dans l&#39;évaluation et la caractérisation des descendances hématopoïétiques provenant à la fois humaines et des lignées ES de souris. Cette OP9 ES-mStrawberry récapitule modèle de co-culture des différentes étapes primitives et l&#39;hématopoïèse définitive. En étudiant les premières étapes du développement hématopoïétique, de nombreuses personnes utilisent le BL-CFC (Blast-comme des cellules formant colonie) de dosage, qui évaluent le développement de l&#39;hémangioblaste des cellules ES. Alors que le test BL-CFC est un outil utile lors des enquêtes début de développement hématopoïétique, le mStrawberry-ES systèmes de co-culture des expositions d&#39;utilité augmenter car elle permet de l&#39;évaluation de l&#39;hémangioblaste, ainsi que, plus adulte lignées hématopoïétiques. Des travaux antérieurs utilisant OP9/ES traditionnelle et des protocoles de différenciation EB a montré que des facteurs supplémentaires peut être nécessaire, comme la surexpression de HOXB4, afin d&#39;en tirer à long terme repeupler les cellules souches hématopoïétiques in vitro. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour évaluer si mStrawberry négatif, triés ES dérivées de populations contiennent vraie cellules souches hématopoïétiques.

OP-9 Cellule Composants Maintenance Medium Stock <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Société </td><td> Nombre de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> AMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Omega scientifique </td><td> FB01 </td><td> Pré-testés </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Cellgro </td><td> 25 à 005-CI </td><td> 200nm </td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table> ES/OP-9 cellulaire Composants Différenciation moyen Stock <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Société </td><td> Nombre de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> AMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td> Pré-testés </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Cellgro </td><td> 25 à 005-CI </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td> PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +) </td><td> Cellgro </td><td> 21 à 031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table>

modification es / op9 co-culture protocole prévoit caractérisation améliorée de progeny hématopoïétiques

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

La différenciation in vitro des cellules ES vers un destin de cellules hématopoïétiques est utile lorsque l&#39;on étudie les populations de cellules qui sont difficiles d&#39;accès in vivo et pour caractériser les premiers gènes impliqués dans l&#39;hématopoïèse, sans avoir à traiter avec lethalities embryonnaire. La co-culture ES/OP9 système a été initialement conçu pour produire une descendance hématopoïétiques, sans la production au cours des macrophages, comme la ligne OP9 cellules stromales est dérivé de la calvaria de souris mutantes qui manquent ostéopétrose fonctionnelle M-CSF. In vitro, la co-culture ES/OP9 système peut être utilisé afin de récapituler le développement précoce hématopoïétiques. Lorsqu&#39;elle est cultivée sur cellules stromales OP9, les cellules ES se différencient en Flk-1 + hémangioblastes, les progéniteurs hématopoïétiques, et enfin mature, en phase terminale lignées différenciées. La norme ES/OP9 protocole de co-culture implique le placement de cellules ES sur une couche confluente de cellules OP9, ainsi que, périodiquement étapes replating afin d&#39;enlever les vieux, contaminant OP9 cellules. Par ailleurs, les protocoles actuels consistent à évaluer uniquement les cellules hématopoïétiques trouve en suspension et ne sont pas optimisés pour l&#39;évaluation des ES dérivées progéniture à chaque jour de la différenciation. Cependant, avec des étapes replating et la récolte des cellules en suspension que l&#39;on manque potentiellement une grande partie des ES dérivées de la descendance et le développement de cellules hématopoïétiques. Cette question devient importante pour répondre lorsque vous essayez de caractériser les défauts hématopoïétiques associés aux lignes ES KO. Nous décrivons ici une modification ES / mStrawberry OP9 co-culture, qui permet l&#39;élimination des cellules contaminantes OP9 à partir d&#39;essais en aval. Cette méthode permet à l&#39;évaluation complète de tous les descendants ES dérivées à tous les jours de co-culture, résultant en un modèle de différenciation hématopoïétique, qui concernent plus directement le modèle correspond à la différenciation hématopoïétique observées au sein de l&#39;embryon.

mStrawberry OP9 cellules de permettre une évaluation complète de tous les descendants issus de ES-co-culture.

Modification ES / OP9 co-culture protocole prévoit caractérisation améliorée de Progeny hématopoïétiques

La différenciation in vitro de cellules ES vers un destin cellulaire hématopoïétique est utile pour l'étude de populations cellulaires difficiles d'accès in vivo...

L'objectif général de l'expérience suivante est de différencier des cellules souches embryonnaires murines en diverses lignées hématopoïétiques primitives et définitives. Afin de caractériser tous les descendants des cellules ES, la différenciation des cellules hématopoïétiques murines est réalisée en plaçant les cellules ES sur une couche confluente de cellules stromales OP9 marquées au M strawberry fluorescent. Chaque jour de différenciation ou de co-culture représente les différentes étapes du développement hématopoïétique au moment approprié de la récolte.Les cellules progénitrices issues de la différenciation des cellules ES peuvent être séparées de la lignée cellulaire stromale M strawberry OP nine par tri cellulaire. Ce protocole de différenciation des cellules ES recrée l'hématopoïèse primitive et définitive telle qu'observée in vivo et peut être utilisé pour caractériser les défauts hématopoïétiques associés aux lignées de cellules ES invalidées, sans recourir à l'utilisation d'embryons. Bonjour, bienvenue dans le laboratoire de la Dre Judith Gassen au Johnson Comprehensive Cancer Center de l'UCLA.Je m'appelle Alicia Poz. Le principal avantage de la technique que je vais vous montrer aujourd'hui par rapport aux méthodes de co-culture ESO existantes réside dans le fait que cette procédure permet le passage de toutes les cellules du jour cinq et du jour huit, ainsi que la séparation complète de tous les progéniteurs dérivés des ES. Les cellules de stroma M fraise OP9 sont cultivées dans un milieu de culture cellulaire OP9, qui doit être renouvelé tous les deux jours.Les cellules OP nine doivent être repiquées trois jours avant d'être nécessaires pour la co-culture. Il est important de noter que, pendant l'entretien, les cellules OP nine ne doivent jamais être maintenues à une densité supérieure à 90 % de confluence. Commencez par laver les cellules deux fois avec du PBS, puis ajoutez de la trypsine 0,1 % EDTA PRÉCHAUFFÉE pendant cinq minutes, une fois que les cellules se sont détachées. AJOUTEZ le milieu de culture des cellules OP nine et transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres.Centrifuger les cellules en culot dans un tube à 300 ×g pendant cinq minutes à température ambiante, puis jeter le surnageant et resuspendre les cellules dans un milieu de culture cellulaire M fraîchement préparé. Plaquer les cellules sur une plaque OP9 recouverte de cellules à une densité minimale de 10⁴ cellules par cm² le jour du début de l'expérience de co-culture. Les cellules OP9, qui ont été repiquées il y a trois jours, doivent être confluentes. Les cellules ES doivent être cultivées selon le protocole standard applicable à votre lignée cellulaire spécifique.Lavez les cellules ES deux fois avec du PBS contenant de la trypsine à 0,25 % et du EDTA, puis incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez le milieu de différenciation en co-culture aux cellules ES et transférez-les dans des tubes coniques de 15 millilitres. Faites centrifuger les cellules ES à 400 ×g pendant cinq à sept minutes à température ambiante.Après avoir retiré le surnageant, resuspendre les cellules ES dans le milieu de différenciation en co-culture. Utiliser une aiguille de calibre 21 à extrémité émoussée pour obtenir une suspension monocellulaire. Compter les cellules à l'aide de bleu de trypan et d'un hémo-cytomètre.Récupérez maintenant le flacon de M fraise. OP neuf cellules issues de l'incubateur. Retirez le milieu des cellules OP neuf et ajoutez du milieu de différenciation en co-culture au flacon ou à la plaque.Une fois 10 à la puissance trois cellules ES par centimètre carré pour chaque flacon de cellules M strawberry OP nine, incuber les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone avec humidité. C'est le jour zéro et la co-culture doit avoir cet aspect. Trois jours après le début de la co-culture ES M strawberry OP nine.On observe principalement de grands agrégats plats de progéniture dérivée des cellules ES, présentant des limites bien définies, et certains tourbillons de cellules commencent à se former. Retirer soigneusement le milieu de la co-culture et le remplacer par un milieu de différenciation frais cinq jours après le début de la co-culture. Une différenciation adéquate des cellules ES sur une couche confluente de cellules M strawberry OP9 devrait aboutir à la formation d'hémanoblastes, qui apparaissent comme des amas empilés de cellules.L'aspect le plus critique de cette procédure consiste à s'assurer d'obtenir une différenciation adéquate au jour cinq de la co-culture. À ce stade, vous pouvez observer les colonies d'érythroblastes non seulement au microscope, mais aussi à l'œil nu. Lavez soigneusement la co-culture deux fois avec du PBS et détachez les cellules avec de la trypsine-EDTA 0,25 % sur de la glace, puis rincez les cellules du flacon avec le milieu de différenciation ES et transférez-les dans un tube. Faites centrifuger les cellules à 400 ×g pendant sept minutes à température ambiante.Après la centrifugation, retirez le surnageant et ajoutez un nouveau milieu. Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 21 à extrémité émoussée pour resuspendre les cellules et vous assurer d'une suspension monocellulaire, puis comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Le nombre de cellules souches embryonnaires devrait avoir augmenté de 100 à 150 fois par rapport au jour zéro. Repiquez les cellules en co-culture sur une nouvelle couche de cellules OP9 confluentes M strawberry au jour huit ou neuf, puis comptez à nouveau les cellules au jour 12. Retirez le milieu contenant les cellules hématopoïétiques et mettez-le de côté.Lavez la monocouche une fois avec du PBS afin d'éliminer les cellules hématopoïétiques en suspension. Récupérez-les, puis ajoutez de la trypsine-EDTA 0,25 % au flacon après l'adhérence des cellules. Détachez les cellules du flacon à l'aide du milieu de différenciation ES et ajoutez-les aux cellules hématopoïétiques présentes en suspension. Effectuez une centrifugation à 400 ×g pendant sept minutes à température ambiante. Enfin, resuspendez les cellules à l’aide d’une aiguille de calibre 21 à extrémité émoussée et comptez-les. Les cellules sont désormais prêtes à être repiquées ou utilisées dans des tests en aval.Le système de co-culture ES M strawberry OP nine peut être utilisé pour modéliser le développement hématopoïétique décrit. Voici un aperçu du déroulement temporel de la co-culture, indiquant les jours où les progéniteurs ES différenciés doivent être transférés vers de nouvelles cellules M strawberry OP nine. Une différenciation adéquate des cellules ES sur une couche confluente de cellules M strawberry OP nine entraînera la production de flick one positif.Les hémangio-blastes au jour cinq de la co-culture : les ostéoblastes Heman sont le précurseur mésodermique commun aux lignées endothéliale et hématopoïétique et doivent apparaître comme des amas empilés de cellules, comme illustré sur cette image. Au fur et à mesure que la co-culture progresse, des agrégats de deux à quatre cellules devraient apparaître au jour six ou sept et former des agrégats cellulaires plus importants. Au jour huit ou neuf, les précurseurs hématopoïétiques sont présents dès le jour six, tandis que les lignées hématopoïétiques différenciées terminales apparaissent au jour 14.En revanche, une co-culture avec une différenciation ESL inadéquate entraînera la production de progéniteurs dérivés des ES qui n'auront pas un aspect en motif de « world » au jour cinq. L'absence de cellules présentant un motif de « world » indique une formation inappropriée des blastes GIO. Une co-culture avec une formation inadéquate des eblastes aboutira finalement à une différenciation restreinte des lignées hématopoïétiques et doit être écartée selon ce protocole modifié de co-culture ES OP9.Les progénies dérivées des cellules ES sont négatives pour le marqueur strawberry et peuvent être triées en flux à partir des cellules M positives pour le marqueur strawberry. Observer les cellules OP9 à n'importe quel jour de co-culture pour évaluation. Les résultats d'une expérience représentative sont présentés ici.Les protocoles de co-culture des cellules souches embryonnaires publiés précédemment se concentraient uniquement sur le passage et l'évaluation des cellules flottantes non adhérentes. Dans ce protocole modifié, toutes les cellules dérivées des cellules souches, tant adhérentes que non adhérentes, sont passagées et peuvent être évaluées. Cela conduit à un rendement accru de cellules hématopoïétiques, permet l'identification de populations cellulaires rares et assure une caractérisation complète de tous les descendants des cellules souches, tant hématopoïétiques que non hématopoïétiques.

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