Modification ES / OP9 co-culture protocole prévoit caractérisation améliorée de Progeny hématopoïétiques

L'objectif général de l'expérience suivante est de différencier des cellules souches embryonnaires murines en diverses lignées hématopoïétiques primitives et définitives. Afin de caractériser tous les descendants des cellules ES, la différenciation des cellules hématopoïétiques murines est réalisée en plaçant les cellules ES sur une couche confluente de cellules stromales OP9 marquées au M strawberry fluorescent. Chaque jour de différenciation ou de co-culture représente les différentes étapes du développement hématopoïétique au moment approprié de la récolte.

Les cellules progénitrices issues de la différenciation des cellules ES peuvent être séparées de la lignée cellulaire stromale M strawberry OP nine par tri cellulaire. Ce protocole de différenciation des cellules ES recrée l'hématopoïèse primitive et définitive telle qu'observée in vivo et peut être utilisé pour caractériser les défauts hématopoïétiques associés aux lignées de cellules ES invalidées, sans recourir à l'utilisation d'embryons. Bonjour, bienvenue dans le laboratoire de la Dre Judith Gassen au Johnson Comprehensive Cancer Center de l'UCLA.

Je m'appelle Alicia Poz. Le principal avantage de la technique que je vais vous montrer aujourd'hui par rapport aux méthodes de co-culture ESO existantes réside dans le fait que cette procédure permet le passage de toutes les cellules du jour cinq et du jour huit, ainsi que la séparation complète de tous les progéniteurs dérivés des ES. Les cellules de stroma M fraise OP9 sont cultivées dans un milieu de culture cellulaire OP9, qui doit être renouvelé tous les deux jours.

Les cellules OP nine doivent être repiquées trois jours avant d'être nécessaires pour la co-culture. Il est important de noter que, pendant l'entretien, les cellules OP nine ne doivent jamais être maintenues à une densité supérieure à 90 % de confluence. Commencez par laver les cellules deux fois avec du PBS, puis ajoutez de la trypsine 0,1 % EDTA PRÉCHAUFFÉE pendant cinq minutes, une fois que les cellules se sont détachées. AJOUTEZ le milieu de culture des cellules OP nine et transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres.

Centrifuger les cellules en culot dans un tube à 300 ×g pendant cinq minutes à température ambiante, puis jeter le surnageant et resuspendre les cellules dans un milieu de culture cellulaire M fraîchement préparé. Plaquer les cellules sur une plaque OP9 recouverte de cellules à une densité minimale de 10⁴ cellules par cm² le jour du début de l'expérience de co-culture. Les cellules OP9, qui ont été repiquées il y a trois jours, doivent être confluentes. Les cellules ES doivent être cultivées selon le protocole standard applicable à votre lignée cellulaire spécifique.

Lavez les cellules ES deux fois avec du PBS contenant de la trypsine à 0,25 % et du EDTA, puis incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez le milieu de différenciation en co-culture aux cellules ES et transférez-les dans des tubes coniques de 15 millilitres. Faites centrifuger les cellules ES à 400 ×g pendant cinq à sept minutes à température ambiante.

Après avoir retiré le surnageant, resuspendre les cellules ES dans le milieu de différenciation en co-culture. Utiliser une aiguille de calibre 21 à extrémité émoussée pour obtenir une suspension monocellulaire. Compter les cellules à l'aide de bleu de trypan et d'un hémo-cytomètre.

Récupérez maintenant le flacon de M fraise. OP neuf cellules issues de l'incubateur. Retirez le milieu des cellules OP neuf et ajoutez du milieu de différenciation en co-culture au flacon ou à la plaque.

Une fois 10 à la puissance trois cellules ES par centimètre carré pour chaque flacon de cellules M strawberry OP nine, incuber les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone avec humidité. C'est le jour zéro et la co-culture doit avoir cet aspect. Trois jours après le début de la co-culture ES M strawberry OP nine.

On observe principalement de grands agrégats plats de progéniture dérivée des cellules ES, présentant des limites bien définies, et certains tourbillons de cellules commencent à se former. Retirer soigneusement le milieu de la co-culture et le remplacer par un milieu de différenciation frais cinq jours après le début de la co-culture. Une différenciation adéquate des cellules ES sur une couche confluente de cellules M strawberry OP9 devrait aboutir à la formation d'hémanoblastes, qui apparaissent comme des amas empilés de cellules.

L'aspect le plus critique de cette procédure consiste à s'assurer d'obtenir une différenciation adéquate au jour cinq de la co-culture. À ce stade, vous pouvez observer les colonies d'érythroblastes non seulement au microscope, mais aussi à l'œil nu. Lavez soigneusement la co-culture deux fois avec du PBS et détachez les cellules avec de la trypsine-EDTA 0,25 % sur de la glace, puis rincez les cellules du flacon avec le milieu de différenciation ES et transférez-les dans un tube. Faites centrifuger les cellules à 400 ×g pendant sept minutes à température ambiante.

Après la centrifugation, retirez le surnageant et ajoutez un nouveau milieu. Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 21 à extrémité émoussée pour resuspendre les cellules et vous assurer d'une suspension monocellulaire, puis comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Le nombre de cellules souches embryonnaires devrait avoir augmenté de 100 à 150 fois par rapport au jour zéro. Repiquez les cellules en co-culture sur une nouvelle couche de cellules OP9 confluentes M strawberry au jour huit ou neuf, puis comptez à nouveau les cellules au jour 12. Retirez le milieu contenant les cellules hématopoïétiques et mettez-le de côté.

Lavez la monocouche une fois avec du PBS afin d'éliminer les cellules hématopoïétiques en suspension. Récupérez-les, puis ajoutez de la trypsine-EDTA 0,25 % au flacon après l'adhérence des cellules. Détachez les cellules du flacon à l'aide du milieu de différenciation ES et ajoutez-les aux cellules hématopoïétiques présentes en suspension. Effectuez une centrifugation à 400 ×g pendant sept minutes à température ambiante. Enfin, resuspendez les cellules à l’aide d’une aiguille de calibre 21 à extrémité émoussée et comptez-les. Les cellules sont désormais prêtes à être repiquées ou utilisées dans des tests en aval.

Le système de co-culture ES M strawberry OP nine peut être utilisé pour modéliser le développement hématopoïétique décrit. Voici un aperçu du déroulement temporel de la co-culture, indiquant les jours où les progéniteurs ES différenciés doivent être transférés vers de nouvelles cellules M strawberry OP nine. Une différenciation adéquate des cellules ES sur une couche confluente de cellules M strawberry OP nine entraînera la production de flick one positif.

Les hémangio-blastes au jour cinq de la co-culture : les ostéoblastes Heman sont le précurseur mésodermique commun aux lignées endothéliale et hématopoïétique et doivent apparaître comme des amas empilés de cellules, comme illustré sur cette image. Au fur et à mesure que la co-culture progresse, des agrégats de deux à quatre cellules devraient apparaître au jour six ou sept et former des agrégats cellulaires plus importants. Au jour huit ou neuf, les précurseurs hématopoïétiques sont présents dès le jour six, tandis que les lignées hématopoïétiques différenciées terminales apparaissent au jour 14.

En revanche, une co-culture avec une différenciation ESL inadéquate entraînera la production de progéniteurs dérivés des ES qui n'auront pas un aspect en motif de « world » au jour cinq. L'absence de cellules présentant un motif de « world » indique une formation inappropriée des blastes GIO. Une co-culture avec une formation inadéquate des eblastes aboutira finalement à une différenciation restreinte des lignées hématopoïétiques et doit être écartée selon ce protocole modifié de co-culture ES OP9.

Les progénies dérivées des cellules ES sont négatives pour le marqueur strawberry et peuvent être triées en flux à partir des cellules M positives pour le marqueur strawberry. Observer les cellules OP9 à n'importe quel jour de co-culture pour évaluation. Les résultats d'une expérience représentative sont présentés ici.

Les protocoles de co-culture des cellules souches embryonnaires publiés précédemment se concentraient uniquement sur le passage et l'évaluation des cellules flottantes non adhérentes. Dans ce protocole modifié, toutes les cellules dérivées des cellules souches, tant adhérentes que non adhérentes, sont passagées et peuvent être évaluées. Cela conduit à un rendement accru de cellules hématopoïétiques, permet l'identification de populations cellulaires rares et assure une caractérisation complète de tous les descendants des cellules souches, tant hématopoïétiques que non hématopoïétiques.