Name: Dissection dun oeil de la souris pour un mont entiers de lépithélium pigmentaire rétinien (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: Apprenez la dissection de l'œil de souris pour obtenir un montage entier de l'épithélium pigmentaire rétinien. Cette technique permet d'étudier le développement rétinien et les maladies oculaires chez Mus musculus.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national des sciences de la santé environnementale [K22ES012264 d&#39;AJRB] et une American Cancer Society InstitutionalResearch Grant [ACS-GRI-00-173-04] pilotes projectaward [à AJRB]. Nous remercions également les membres du laboratoire de l&#39;évêque pour la lecture critique du manuscrit et des commentaires sur la vidéo et Adam Brown, en particulier, pour l&#39;exemple de quoi ne pas faire. Nous remercions le Dr Donald McEwen, de l&#39;Institut Greehey enfants recherche sur le cancer pour nous avoir permis l&#39;utilisation de son champ de dissection / vidéo de la caméra set-up pour le tournage de la vidéo de dissection. Nous remercions Daron Brown à Corte Instruments pour l&#39;affûtage et la réparation de nos outils de microdissection.

1. Enlever les tissus étrangères de l'extérieur de l'œil <ol><li> Verser PBS 1X dans le couvercle d'une boîte de 35mm. Le niveau doit être juste en dessous de la lèvre du couvercle. </li><li> En utilisant des pinces droites, des yeux de transfert (s) du tube de stockage pour le plat de 35mm. Les yeux sont immergés dans du PBS pour deux raisons: 1. Les tissus étrangers seront "flotter" loin de l'œil ainsi vous pouvez voir et de les retirer facilement, et 2. Pendant la dissection, l'œil va naturellement de maintenir sa forme sphérique tout en suspension, vous permettant de travailler avec cette forme plutôt que contre elle. </li><li> L'utilisation des deux paires de pinces à angle (45 ° et 15 °), retirer délicatement le muscle et le tissu conjonctif bien que possible, en tirant le tissu contre le grain (c'est à dire vers la cornée). Certains tissus conjonctifs restera. Un effort devrait être fait pour presser le globe oculaire aussi peu que possible. </li><li> Echangez votre pince à 15 ° pour ciseaux printemps. Tout en tenant l'œil stable avec 45 pinces °, utiliser les ciseaux pour couper le printemps musculaires restantes et des tissus conjonctifs, ainsi que le nerf optique. * Astuce: Utilisez le bord extérieur de la paire de ciseaux pour pousser le tissu contre le grain (vers le fossé cornéo-scléral) et puis découper. Continuez jusqu'à ce que tous les tissus étrangers a été retiré de l'œil. </li></ol> 2. Retirez la cornée et le cristallin <ol><li> Avec la cornée vers le haut, utilisez la pince pour pincer ° 45 jusqu'à un petit pli dans le centre de la cornée. </li><li> En utilisant les ciseaux à ressort, faire une petite incision à la base du lambeau. Lâchez le rabat. </li><li> Tenir les yeux encore avec votre pince, insérez la lame inférieure de ciseaux dans et perpendiculaire à l'incision et faire une coupe vers le fossé cornéo-scléral. Essayez de garder votre lame inférieure sous l'iris afin que les deux de la cornée et l'iris sont coupés. Ne pas couper tout le chemin à la fracture cornéo-scléral. Gardez les ciseaux insérés dans les yeux. </li><li> En utilisant votre pince ° 45, soigneusement tourner de l'œil afin que vos ciseaux sont parallèles à la fracture cornéo-scléral et de faire une petite coupure. Lentement tourner le · Oeil 360, faisant de petites incisions sur tout le pourtour. Encore une fois, essayer de garder la lame inférieure des ciseaux à ressort sous l'iris afin que les deux l'iris et la cornée sont coupés. Soulevez l'iris et la cornée loin du reste de l'œil et les jeter. </li><li> Inclinez l'œil sur son côté et appuyez doucement sur la moitié postérieure de l'œil, ce qui oblige le cristallin à. Jeter de la lentille. L'intérieur de l'œilleton restante est bordée par la rétine neurale, ce qui devrait look lisse et opaque. </li></ol> 3. Trimestre de l'œilleton résultant, résultant en un 4 - "pétales", fleur-comme la structure <ol><li> L'œil doit être positionné de telle sorte que l'ouverture de l'œilleton est perpendiculaire à votre corps. Utilisez votre pince ° 45 à la régulière et la position de l'œilleton. </li><li> Tenir vos ciseaux à ressort en face de vous afin qu'ils soient perpendiculaires à votre corps, insérer la lame inférieure des ciseaux à ressort dans le bord supérieur de la coupe à yeux ouverts. En utilisant votre pince à 45 °, aligner soigneusement la tasse oeil de sorte qu'un seul, coupe droite peut être faite de la fracture cornéo-scléral vers la tête du nerf optique. Toutes les coupes doivent être perpendiculaires à la fracture cornéo-scléral et sauf indication contraire, doit aller au plus près à la tête du nerf optique que possible sans couper dedans. </li><li> Tournez l'œilleton de 180 °, en maintenant sa perpendicularité avec votre corps. Utiliser une technique à l'étape 3.2 pour faire une coupe perpendiculaire secondes. </li><li> Tournez l'œilleton et répéter la technique décrite au paragraphe 3.2 de faire deux coupes plus. Les quatre coupes devraient être aussi proche de 90 ° que possible. Gardez à l'esprit que l'œil n'est pas parfaitement sphérique il y aura donc une certaine variabilité. </li></ol> 4. Couper chacun des quatre «pétales» de moitié, résultant en une à huit pétales de fleur-comme la structure <ol><li> Transfert l'œilleton quartiers de l'antenne de 35mm sur une lame propre. Avec l'œilleton vers le haut, scoop dessous avec les 45 pince °. Soigneusement le sortir du liquide et le placer sur une lame propre. </li><li> L'utilisation des deux paires de pinces à angle, ouvrir doucement sur l'oeil, avec la rétine neurale vers le haut. NE PAS RETIRER LA RÉTINE NEURONES-il aide l'œil maintenir certaines de sa forme sphérique de sorte que vous ne travaillez pas contre elle. Elle protège également l'EPR d'être accidentellement endommagés dans les procédures suivantes. </li><li> Tournez le glisser jusqu'à l'un des pétales est perpendiculaire à votre corps. </li><li> Utilisez votre pince à 15 °, délicatement attraper au coin de la pétale. Le coin du pétale doit être cornée, rétine neurale pas ou RPE. Soulevez délicatement sur le coin, lui permettant de conserver sa courbure. </li><li> Insérez la lame en bas de votre paire de ciseaux à ressort entre les pétales et la diapositive. Alignez vos ciseaux de telle sorte qu'une seule, droite, coupe perpendiculaire peut être faite de la fracture cornéo-scléral vers la tête du nerf optique. Coupez le plus près de la tête du nerf optique que withou possiblest de coupe dedans. Lâchez le pétale, lui permettant de se coucher sur la diapositive. </li><li> Tournez la lame à 90 °, de sorte que le pétale suivant est perpendiculaire à votre corps. Répétez l'étape 4.5. </li><li> Répétez les étapes 4,5 et 4,6 fois plus. La structure résultante devrait ressembler à une fleur à huit pétales. </li></ol> 5. Retirez la rétine neurale <ol><li> Pipeter 100 à 200 ul de PBS 1X sur le spécimen. Cela permettra d'éviter la rétine neurale de coller comme vous le retirer de l'EPR. </li><li> Typiquement la rétine neurale est lâchement attaché à l'EPR. Toutefois, il ne prendra la pratique et l'habileté de ne supprimer que la rétine neurale et non l'EPR. Saisir délicatement un pétale de la rétine neuronale avec une paire de pince à angle tout en stabilisant (maintenant) le reste de l'œil avec l'autre paire de pince coudée. Tirez sur la rétine neurale loin du reste de l'œil. Continuez cette procédure jusqu'à ce que la rétine entière de neurones a été supprimée. * Astuce: coller le bout de votre pince à 15 ° dans la tête du nerf optique d'ancrer l'œil. Ensuite, utilisez la pince à 45 ° pour balayer sous la rétine neuronale et l'enlever et de loin. Il est généralement préférable de soulever la rétine neurale de la tête du nerf optique vers le fossé cornéo-scléral. Soyez sûr de détacher les restes lâche de l'iris. L'iris est assez collante et peut par ailleurs se coincer à l'EPR. </li><li> Rincer l'éprouvette avec du PBS 1X. Pipeter 100 à 200 ul de PBS 1X dans l'échantillon et le sucer sauvegarder. Jeter le PBS. Répéter au besoin pour enlever la poussière et les débris. </li></ol> 6. Mont-vous spécimen (s) sur une lame <ol><li> Pipeter 80 à 90 uL de glycérol 90% sur une nouvelle diapositive dans une forme rectangulaire. Utilisez le côté de la pointe de la pipette pour faire une même frottis rectangulaire de glycérol. (Ceci est la procédure à suivre pour le montage de deux EPR sur une diapositive.) </li><li> Insérez le bras inférieur de 15 ° sous une pince le spécimen. Soulevez doucement le spécimen de la lame de dissection. </li><li> Abaissez doucement le spécimen dans la glycérine. Doucement bouger la pince que vous les sortez de sous le spécimen. </li><li> Répétez les étapes 6.1 à 6.3 pour l'autre spécimen. </li><li> Tourner la lame de sorte que le côté le plus long est perpendiculaire à votre corps. Tenez votre couvercle en verre à un angle de 45 ° à la diapositive de sorte qu'il est de toucher la lame. Déplacez-le vers le frottis de glycérol jusqu'à ce qu'ils touchent. Maintenir le contact entre le couvercle en verre et faire glisser, déplacer lentement le couvercle en verre loin de la diffamation, vers le bord de la diapositive. Alignez les côtés de la lame et le couvercle en verre afin qu'elles soient parallèles. Tenez les coins de la vitre couvercle entre le pouce et l'index. </li><li> Ramassez la pince 15 ° dans l'autre main. Berceau de la partie supérieure (gratuit) bord du verre de couverture dans le creux du bras. Très lentement, baissez le couvercle en verre. Lorsqu'un contact est établi entre le couvercle en verre et le glycérol, s'arrêter et attendre pour le glycérol pour migrer. Répétez cette descente et attendre les monts RPE entiers sont entièrement couverts. Ceci, pour éviter le glycérol très visqueux de la capture de bulles d'air. NE PAS pousser sur la lamelle - le glycérol sera squeeze out de dessous, ce qui rend l'adhérence très faible. </li><li> Avec vernis à ongles transparent, peinture sur le périmètre où le couvercle en verre et faites glisser rencontrer. </li><li> Placer la lame sur le dessus d'un rack vide à sec. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: Le résultat de cette procédure doit être une structure qui ressemble à une fleur et devrait être assez symétrique. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Whole EPR de montage d'une souris de type sauvage C67Bl/6J. RPE du noir ou des animaux agouti doit être de couleur brun foncé et doit avoir une surface lisse. Il est normal de constater des ondulations dans la topographie des pétales. La pigmentation sur tout spécimen donnent peut-être quelque peu variable, en raison de la densité variable de la pigmentation des deux EPR et la choroïde sous-jacente. Les flèches blanches point à hypopigmentées «canaux» - ce qui est normal et est dû à la vascularisation sous-jacente de l'œil. Flèche bleue à des dommages physiques à la fois à l'EPR et la choroïde sous-jacente. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Whole EPR de montage d'une souris diluer. Spécimens récoltés à partir d'animaux peut diluer la couleur va du presque transparent au café au lait et tout spécimen ci est comme avoir une variabilité au sein, avait indiqué dans les cercles noirs ici. En général, les RPE récoltés à partir des animaux plus jeunes sont plus légers et ceux récoltés provenant d'animaux âgés sont plus sombres. Les flèches noires indiquent certains de la vascularisation sous-jacente, qui apparaît hypopigmentées. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Phalloïdine coloration peut être utilisée pour détecter des dommages physiques à l'EPR. Coloration phalloïdine expose clairement les membranes cellulaires, montrant la forme hexagonale de l'épithélium. (A) Exemple d'une souris noire. (B) Exemple d'une souris diluer. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Un EPR mal disséqué d'une souris diluer. (A) Les parenthèses indiquent les marges de la cornée qui sont trop larges, ce qui peut provoquer le flambement et / ou de pliage. Dans le cercle noir que vous pouvez voir des quantités excessives de tissu étranger qui n'ont pas été retirés de l'arrière de l'œil. Ils sont particulièrement évidentes car l'échantillon est d'un animal diluer. Le pétale en bas à gauche est partiellement repliée. (B) Ce support a toute l'apparence d'un moulinet. Les flèches noires indiquent certaines des réductions qui ont été faites. Beaucoup de coupures de la fracture cornéo-scléral vers la tête du nerf optique ne sont pas en conformité avec le diamètre. (C) Les flèches noires indiquent la manière dont les coupes devraient avoir été faites, en ligne avec le diamètre et la perpendiculaire à la tangente.

<ol><li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzo%28a%29pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%22%5BJournal%5D)">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li>
<li>Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li>
<li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li>
<li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li>
<li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-%2C+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li>
<li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li>
<li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+and+the+RPE%3A+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li>
</ol>

L&#39;EPR est le site de l&#39;essai p de l&#39;ONU, un essai in vivo d&#39;homologie dirigée réparation. Le dosage de l&#39;ONU p a été utilisé pour étudier les effets des dommages d&#39;ADN différentes 1,2 et de signalisation des dommages de l&#39;ADN et les gènes de réparation 3,4,5 sur la fréquence d&#39;homologie dirigée réparation. Ce test est très sensible, en détectant une seule cellule événements sur l&#39;EPR 1. Il peut aussi dét...

<table><tbody><tr><td>pinces droites</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-4903</td><td>embout : 0,08 x 0,04 mm matériau : INOX</td></tr><tr><td>pinces à 45&amp;#x00B0;</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5005</td><td>embout : 0,05 x 0,01 mm matériau : INOX</td></tr><tr><td>pinces à 15&amp;#x00B0; orientées vers le &quot;haut&quot;</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045A</td><td>embout : 0,1 x 0,06 mm matériau : INOX</td></tr><tr><td>ciseaux à ressort</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5604</td><td>largeur de l'embout combiné 0,3 mm, longueur du tranchant 3 mm, matériau : acier inoxydable</td></tr><tr><td>microscope stéréoscopique binoculaire</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Discovery V.8</td><td>utiliser une source de lumière réfléchie</td></tr><tr><td>phalloïdine</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546</td></tr></tbody></table>

dissection d&#39;un oeil de la souris pour un mont entiers de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

L&#39;épithélium pigmentaire rétinien (EPR) se trouve à l&#39;arrière de l&#39;œil chez les mammifères, juste sous la rétine neurale, qui contient les photorécepteurs (cônes et bâtonnets). L&#39;EPR est une monocouche de cellules cubiques pigmentaires et associés étroitement avec la rétine neurale juste au dessus. Cette association fait l&#39;EPR de grand intérêt pour les chercheurs qui étudient les maladies rétiniennes. L&#39;EPR est aussi le site d&#39;un essai in vivo d&#39;homologie dirigée réparation de l&#39;ADN, le test p ONU. L&#39;oeil de la souris est particulièrement difficile de disséquer en raison de sa petite taille (environ 3,5 mm de diamètre) et sa forme sphérique. Cet article montre en détail une procédure pour la dissection de l&#39;œil entraînant une monture ensemble de l&#39;EPR. Dans cette procédure, nous montrons comment travailler avec, plutôt que contre, la structure sphérique de l&#39;œil. En bref, le tissu conjonctif, des muscles et du nerf optique sont retirés du fond de l&#39;œil. Ensuite, la cornée et le cristallin sont supprimés. Ensuite, coupures stratégiques sont prises qui aboutissent à un aplatissement significatif du tissu restant. Enfin, la rétine neurale est délicatement soulevé, révélant une RPE intacte, ce qui est encore attaché à la choroïde sous-jacente et la sclère. Ce support entière peut être utilisé pour effectuer le test p ONU ou de l&#39;évaluation immunohistochimie ou immunofluorescence du tissu EPR.

Une démonstration formelle de la dissection d&#39;un oeil de la souris, résultant en une monture ensemble de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien.

Dissection d&#39;un oeil de la souris pour un mont entiers de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien

L'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) se situe à l'arrière de l'œil des mammifères, juste sous la rétine neurale, laquelle contient les photorécepteurs (bâtonnets et ...

Je m'appelle Allison Clavon. Je suis assistante de recherche pour le Dr. Alex Bishop à l'Institut de recherche sur le cancer pédiatrique Gree au centre des sciences de la santé de l'UT à San Antonio, au Texas. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment disséquer l'œil d'un rongeur afin d'obtenir une préparation complète de l'épithélium pigmentaire rétinien.Ce tissu présente un intérêt pour l'étude du développement et des maladies de la rétine et constitue également le site d'un test de réparation de l'ADN dirigée par homologie in vivo. Commençons donc. Voici un œil prêt à être disséqué.Tout d'abord, examinons les structures anatomiques que vous utiliserez comme repères tout au long de la procédure. Ce sont les yeux d'un animal dilué. Voici le nerf optique à l'arrière de l'œil opposé.C'est la cornée. L'iris apparaît à travers la cornée. La zone blanchâtre à l'arrière de l'œil est la sclérotique.Par conséquent, cette région est appelée la limite cornéo-sclérale. La première étape de la dissection consiste à retirer les tissus superflus tels que le tissu conjonctif musculaire et le nerf optique. Ensuite, il faut enlever la cornée en effectuant une incision circulaire.À ce stade, le cristallin peut être extrait, ce qui donne une cupule oculaire creuse. Ensuite, quatre incisions sont réalisées à partir de la limite cornéo-sclérale en direction de la tête du nerf optique. La structure obtenue ressemble à une fleur à quatre pétales.Chacun de ces quatre pétales est ensuite coupé en son milieu, ce qui donne une structure ressemblant à une fleur à huit pétales. À ce stade, des plis peuvent apparaître sur le I en raison de sa nature sphérique. Pour contrer ce phénomène et obtenir un montage de trou plus plat, vous pouvez effectuer huit coupes plus courtes traversant légèrement les plis.Vous aurez besoin de plusieurs matériaux à portée de main sur votre poste de travail, notamment une pipette de 100 ou 200 p et des embouts correspondants, une lame de plat X-P-B-S-A de 35 millimètres avec verre de couverture, de la glycérine à 90 % et du vernis à ongles transparent pour la préparation des lames, un support pour sécher les lames, une boîte de lingettes Kim et un contenant de déchets pour éliminer les déchets. En plus de ces matériaux courants, vous aurez également besoin d’un ensemble d’outils spécialisés pour la microdissection, notamment des pinces droites, des pinces angulées à 45 degrés utilisées pour maintenir, tourner et manipuler généralement l’œil tout au long de la dissection. Ces pinces à 15 degrés ont une inclinaison vers le haut et sont également utilisées pour la manipulation et la manutention de l’œil.Enfin, vous aurez besoin d'une paire de ciseaux à ressort. Il est très important d'utiliser des ciseaux à ressort plutôt que des ciseaux de style traditionnel. Pour cette dissection, avant de commencer, assurez-vous que la hauteur de votre chaise est réglée de manière à ce que, lorsque vous êtes assis bien droit, vos yeux soient au niveau des oculaires.Se voûter au microscope provoque des douleurs aux épaules et au dos et nuit à la qualité de vos dissections. Pour commencer, versez un XPBS dans le couvercle de la boîte de 35 millimètres. Ensuite, transférez les yeux que vous prévoyez de disséquer dans la boîte.Ceci est un œil provenant d'une souris sauvage de type C57 noire. Vous pouvez le voir très petit, d'environ trois millimètres et demi de diamètre. L'opacité de la sclère lui confère une teinte bleuâtre.La première étape de la dissection consiste à retirer tous les tissus superflus situés autour de l'œil, tels que le tissu conjonctif musculaire et le nerf optique. Ici, j'ai les pinces à 45 degrés dans la main gauche et les pinces à 15 degrés dans la main droite. Vous pouvez utiliser une paire de pinces pour stabiliser l'œil tout en tirant sur les tissus avec l'autre. Lorsqu'un gros morceau de tissu se détache, essuyez soigneusement votre pince sur un essuie-tout Kim. Veillez simplement à ne pas écraser ni percer l’œil. L'un des avantages de cette dissection en suspension est que vous pouvez facilement voir le tissu conjonctif s'éloigner de l’œil.Éventuellement, vous atteindrez un stade où vous ne pourrez plus retirer de tissu à l’aide de la pince. Remplacez votre pince à angle de 15 degrés par des ciseaux à ressort. Utilisez les ciseaux à ressort pour sectionner le nerf optique.Utilisez le bord extérieur de la lame pour pousser le tissu vers l'avant, en direction de la limite entre la cornée et la sclérotique. Ensuite, taillez et essuyez délicatement vos ciseaux sur un essuie-tout. Observons cela à nouveau.Poussez le tissu vers l’avant, en direction de la limite cornéo-sclérale, à l’aide du bord extérieur de vos ciseaux lorsque le tissu est relevé. Taillez, puis continuez à pousser les fragments de tissu vers l’avant à l’aide du bord contondant de vos ciseaux, avant de les couper, jusqu’à ce que tout tissu accessoire soit éliminé. Il y a généralement deux bandes de tissu résistant sur l’œil.Le premier est fixé à la limite entre la cornée et la sclérotique, et le second est montré en cours de découpe. Celui-ci se situe à environ mi-chemin entre la limite cornéo-sclérale et la tête du nerf optique. L'étape suivante de la dissection consiste à retirer la cornée et le cristallin.Utilisez votre pince à 45 degrés pour soulever un lambeau environ au milieu de la cornée. Ensuite, utilisez vos ciseaux à ressort pour pratiquer une petite incision à la base du lambeau. Insérez la lame inférieure de vos ciseaux dans l'incision, sous l'iris.Effectuez une incision en direction, mais sans pénétrer dans, la limite cornéo-sclérale. Ensuite, faites lentement pivoter l’œil de 360 degrés, en réalisant de petites incisions tout autour. Essayez de maintenir les ciseaux sous l’iris, en coupant simultanément la cornée et l’iris.Il faut beaucoup de pratique pour le faire aussi facilement que je le montre ici. Une fois la cornée retirée, tournez l’œil sur le côté et appuyez doucement sur l’extérieur de l’œil pour faire sortir le cristallin. La structure restante aura ensuite une forme de coupe.L’œil doit être divisé en quartiers. Pour ce faire, placez l’œil sur le côté et insérez la lame inférieure de vos ciseaux à ressort. Effectuez une incision longitudinale en direction, mais sans atteindre complètement, la tête du nerf optique.Pour ce faire, gardez les bras le long du corps et les ciseaux devant vous, approximativement perpendiculaires à votre corps et à la coupe oculaire. Effectuez votre deuxième incision directement en face de la première. Prenez le temps d’ajuster correctement l’alignement afin d’obtenir une coupe régulière.Effectuer plusieurs coupes peut provoquer des irrégularités, mais si elles sont bien alignées, elles ne sont pas visibles. Remarquez comment je parviens à travailler avec cette forme sphérique de l'œil plutôt que contre elle, car l'œil conserve sa forme normale. Une fois suspendu dans le PBS, le reste de la dissection s'effectuera sur une lame. Saisissez délicatement l'œil avec la pince angulée à 45 degrés et soulevez-le hors du PBS.Placer l'œil sur une nouvelle lame. À l'aide des deux paires de pinces angulaires, déplier soigneusement l'œil. Remarquer qu'il existe une petite marge de cornée et d'iris autour du pourtour de l'œil, utile pour la manipulation.Ensuite, vous devez couper chacun des quatre pétales en deux. Faites pivoter l'œil de manière à ce qu'un des pétales soit perpendiculaire à votre corps. Saisissez le coin du pétale avec une pince angulée à 15 degrés.Soulevez légèrement, puis effectuez une incision partant de la limite entre la cornée et la sclérotique en direction de la tête du nerf optique. Ces incisions doivent être perpendiculaires à une tangente. Une tangente est une droite perpendiculaire au diamètre.Par conséquent, vos incisions doivent être alignées avec le diamètre de l'œil. Faites maintenant pivoter la lame afin que le prochain pétale soit perpendiculaire à votre corps et répétez l'opération. Saisissez le coin du pétale.Soulevez légèrement et coupez. Répétez jusqu'à ce que chacun des quatre grands pédales soit coupé en deux. La substance blanchâtre est la rétine nerveuse, qui recouvre directement l'épithélium pigmentaire de la rétine (RPE).La rétine nerveuse peut protéger l'épithélium pigmentaire rétinien, donc laissez-la intacte jusqu'à ce que toutes vos incisions soient terminées. Remarquez que les pédales sont légèrement incurvées. Ne vous opposez pas à cette courbure.Prenez votre temps pour bien aligner afin de réaliser une incision unique précise. Étant donné que l’œil est rond, il a tendance à fléchir ; pour éviter ce fléchissement, vous pouvez effectuer huit petites incisions.Un sur chaque pédale. Utilisez la même stratégie de base que lors du tour précédent de quatre découpes. Soulevez le coin de la pédale et découpez, mais dans ce cas, ne coupez que jusqu'à environ la moitié de la longueur de la pédale.Une fois toutes vos incisions effectuées, vous pouvez retirer la rétine nerveuse. Ici, j'ajoute quelques gouttes de PBS 1X à l'échantillon. Vous ne devez pas laisser votre épithélium pigmentaire rétinien sécher.La rétine nerveuse ne devrait être que faiblement associée à l'épithélium pigmentaire rétinien sous-jacent. On peut observer qu'elle se détache assez facilement. Toutefois, elle reste généralement attachée au niveau de la limite cornéo-sclérale, qui, à l'intérieur de l'œil, correspond à une crête irrégulière appelée corps ciliaire.Vous pouvez insérer la pointe de votre pince à 15 degrés dans la tête du nerf optique pour ancrer l'échantillon tout en détachant la rétine nerveuse. Le corps ciliaire marque la limite de l'épithélium pigmentaire de la rétine (RPE), le tissu fortement pigmenté qui s'est détaché. Voici l'iris, pas l'épithélium pigmentaire de la rétine.Je recommande de retirer autant que possible l'iris, car il est très collant et peut se replier et adhérer à l'épithélium pigmentaire rétinien si la rétine neuronale est friable ou si des résidus restent attachés à l'épithélium pigmentaire rétinien. Deux causes sont probablement à l'origine du problème. Soit les yeux n'ont pas été fixés correctement, par exemple pendant une durée trop longue ou trop courte, soit ils ont été conservés trop longtemps avant la dissection.La pédale que je m'apprête à découvrir ici n'a pas encore de raccourci. Vous pouvez voir comment la pédale se situe à environ un tiers du bord de l'ORE. C'est pourquoi les huit raccourcis sont recommandés.Une fois que toute la rétine nerveuse a été éliminée, utilisez une pipette pour rincer plusieurs fois l’épithélium pigmentaire de la rétine (RPE) avec 100 à 200 microlitres de PBS jusqu’à ce que toutes les poussières et débris soient retirés. Déposez à la pipette 80 à 90 microlitres de glycérol à 90 % sur une lame propre en forme rectangulaire. Remarque : ce volume de glycérol est optimal pour un coverslip de 22 sur 50 millimètres et doit être ajusté en conséquence.Pour d'autres tailles de lamelle, utilisez la pointe de votre pipette pour étaler le glycérol. Veillez à ne pas introduire de bulles d'air dans le glycérol. Si vous obtenez une bulle, déplacez-la vers le bord où elle éclatera.Faites glisser la branche inférieure de votre pince à 15 degrés sous l’ORE et soulevez-la délicatement, puis abaissez lentement l’ORE dans le glycérol. L’ORE flottera à la surface du glycérol et pourrait se recourber ou se tordre légèrement. Utilisez votre pince pour redresser l’ORE et faire glisser le glycérol sur sa surface.Si des bulles d'air se forment, déplacez-les vers le bord où elles éclateront, en tenant le couvre-objet à environ 45 degrés. Posez-le sur le bord du glycérol.Ensuite, déplacez-la vers le bord de la lame. Tenez le bas du couvre-objet entre votre pouce et votre index et soutenez le bord opposé avec une pince à 15 degrés. Abaissez très lentement le couvre-objet vers la lame dès qu'un contact est établi.Avec l’ORE, arrêtez de descendre, permettez au glycérol de migrer et continuez à abaisser lentement votre lame. Si vous abaissez la lame trop rapidement, des bulles d’air seront piégées dans votre préparation à cet endroit. J’abaisserai lentement la lame lorsqu’elle touchera l’ORE et je permettrai au glycérol de migrer.Vous pouvez observer que lorsque je lâche rapidement la lame, des bulles d'air sont incorporées. Utilisez une quantité généreuse de vernis à ongles transparent pour fixer le bord de la lame. Appliquez-le tout autour du pourtour de la lame sur la préparation.Ceci est un épithélium pigmentaire rétinien typique provenant d'une souris noire C57. Il est normal d'observer la vascularisation sous-jacente, comme indiqué ici. Il est également normal de constater certaines variations de pigmentation, telles que des zones apparaissant moins pigmentées.Cependant, des zones claires comme celle-ci sont probablement dues à des lésions physiques de l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) et de la choroïde sous-jacente. Étant donné que la choroïde de l'œil est également pigmentée, il est possible que des dommages affectant un RPE noir passent inaperçus si la choroïde reste intacte.Il s'agit d'un RPE typique provenant d'une souris diluée. Comme indiqué, vous pourrez observer la vascularisation et noter quelques variations de pigmentation, telles que des zones plus foncées et des zones plus claires. Toutefois, il est presque impossible de détecter des lésions sur un RPE dilué.Ces petites taches sont-elles dues à des lésions ou s'agit-il d'une variation normale de la pigmentation ? Je suggère un examen au lampadaire et une coloration pour répondre à cette question. Cela vous donnera une idée si vous manipulez l'objet trop brutalement.La coloration délimite clairement les membranes cellulaires, rendant les zones endommagées évidentes, mais en réalité, l’épithélium pigmentaire rétinien est assez résistant, et si vous manipulez l’œil par la cornée, il est peu probable que vous causiez des dommages. Voici une préparation en montage complet présentant de nombreux problèmes, dont le moindre, indiqué ici, est une marge de cornée trop large, pouvant entraîner des plis et des ondulations du matériau sinueux. On observe ici un tissu excédentaire important qui reste à l’arrière de l’œil.Ce pédale est partiellement replié, et ici vous pouvez voir que l'épithélium pigmentaire rétinien a été partiellement déchiré. Un autre problème est que cet œil présente un aspect de roue à aubes. Ici, j'ai indiqué les angles des incisions.Cependant, c'est ainsi qu'ils auraient dû être. N'oubliez pas que vos incisions doivent être perpendiculaires à la tangente et alignées sur le diamètre. Je viens de montrer comment disséquer un œil de souris pour une préparation complète du pigment rétinien.Épithélium, la chose la plus importante est de maintenir une bonne posture, mais essayez de rester détendu. J'espère que cette vidéo vous a été utile et je vous souhaite bonne chance dans vos futurs expériences.

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