Dissection d'un oeil de la souris pour un mont entiers de l'épithélium pigmentaire rétinien

Je m'appelle Allison Clavon. Je suis assistante de recherche pour le Dr. Alex Bishop à l'Institut de recherche sur le cancer pédiatrique Gree au centre des sciences de la santé de l'UT à San Antonio, au Texas. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment disséquer l'œil d'un rongeur afin d'obtenir une préparation complète de l'épithélium pigmentaire rétinien.

Ce tissu présente un intérêt pour l'étude du développement et des maladies de la rétine et constitue également le site d'un test de réparation de l'ADN dirigée par homologie in vivo. Commençons donc. Voici un œil prêt à être disséqué.

Tout d'abord, examinons les structures anatomiques que vous utiliserez comme repères tout au long de la procédure. Ce sont les yeux d'un animal dilué. Voici le nerf optique à l'arrière de l'œil opposé.

C'est la cornée. L'iris apparaît à travers la cornée. La zone blanchâtre à l'arrière de l'œil est la sclérotique.

Par conséquent, cette région est appelée la limite cornéo-sclérale. La première étape de la dissection consiste à retirer les tissus superflus tels que le tissu conjonctif musculaire et le nerf optique. Ensuite, il faut enlever la cornée en effectuant une incision circulaire.

À ce stade, le cristallin peut être extrait, ce qui donne une cupule oculaire creuse. Ensuite, quatre incisions sont réalisées à partir de la limite cornéo-sclérale en direction de la tête du nerf optique. La structure obtenue ressemble à une fleur à quatre pétales.

Chacun de ces quatre pétales est ensuite coupé en son milieu, ce qui donne une structure ressemblant à une fleur à huit pétales. À ce stade, des plis peuvent apparaître sur le I en raison de sa nature sphérique. Pour contrer ce phénomène et obtenir un montage de trou plus plat, vous pouvez effectuer huit coupes plus courtes traversant légèrement les plis.

Vous aurez besoin de plusieurs matériaux à portée de main sur votre poste de travail, notamment une pipette de 100 ou 200 p et des embouts correspondants, une lame de plat X-P-B-S-A de 35 millimètres avec verre de couverture, de la glycérine à 90 % et du vernis à ongles transparent pour la préparation des lames, un support pour sécher les lames, une boîte de lingettes Kim et un contenant de déchets pour éliminer les déchets. En plus de ces matériaux courants, vous aurez également besoin d’un ensemble d’outils spécialisés pour la microdissection, notamment des pinces droites, des pinces angulées à 45 degrés utilisées pour maintenir, tourner et manipuler généralement l’œil tout au long de la dissection. Ces pinces à 15 degrés ont une inclinaison vers le haut et sont également utilisées pour la manipulation et la manutention de l’œil.

Enfin, vous aurez besoin d'une paire de ciseaux à ressort. Il est très important d'utiliser des ciseaux à ressort plutôt que des ciseaux de style traditionnel. Pour cette dissection, avant de commencer, assurez-vous que la hauteur de votre chaise est réglée de manière à ce que, lorsque vous êtes assis bien droit, vos yeux soient au niveau des oculaires.

Se voûter au microscope provoque des douleurs aux épaules et au dos et nuit à la qualité de vos dissections. Pour commencer, versez un XPBS dans le couvercle de la boîte de 35 millimètres. Ensuite, transférez les yeux que vous prévoyez de disséquer dans la boîte.

Ceci est un œil provenant d'une souris sauvage de type C57 noire. Vous pouvez le voir très petit, d'environ trois millimètres et demi de diamètre. L'opacité de la sclère lui confère une teinte bleuâtre.

La première étape de la dissection consiste à retirer tous les tissus superflus situés autour de l'œil, tels que le tissu conjonctif musculaire et le nerf optique. Ici, j'ai les pinces à 45 degrés dans la main gauche et les pinces à 15 degrés dans la main droite. Vous pouvez utiliser une paire de pinces pour stabiliser l'œil tout en tirant sur les tissus avec l'autre.

Lorsqu'un gros morceau de tissu se détache, essuyez soigneusement votre pince sur un essuie-tout Kim. Veillez simplement à ne pas écraser ni percer l’œil. L'un des avantages de cette dissection en suspension est que vous pouvez facilement voir le tissu conjonctif s'éloigner de l’œil.

Éventuellement, vous atteindrez un stade où vous ne pourrez plus retirer de tissu à l’aide de la pince. Remplacez votre pince à angle de 15 degrés par des ciseaux à ressort. Utilisez les ciseaux à ressort pour sectionner le nerf optique.

Utilisez le bord extérieur de la lame pour pousser le tissu vers l'avant, en direction de la limite entre la cornée et la sclérotique. Ensuite, taillez et essuyez délicatement vos ciseaux sur un essuie-tout. Observons cela à nouveau.

Poussez le tissu vers l’avant, en direction de la limite cornéo-sclérale, à l’aide du bord extérieur de vos ciseaux lorsque le tissu est relevé. Taillez, puis continuez à pousser les fragments de tissu vers l’avant à l’aide du bord contondant de vos ciseaux, avant de les couper, jusqu’à ce que tout tissu accessoire soit éliminé. Il y a généralement deux bandes de tissu résistant sur l’œil.

Le premier est fixé à la limite entre la cornée et la sclérotique, et le second est montré en cours de découpe. Celui-ci se situe à environ mi-chemin entre la limite cornéo-sclérale et la tête du nerf optique. L'étape suivante de la dissection consiste à retirer la cornée et le cristallin.

Utilisez votre pince à 45 degrés pour soulever un lambeau environ au milieu de la cornée. Ensuite, utilisez vos ciseaux à ressort pour pratiquer une petite incision à la base du lambeau. Insérez la lame inférieure de vos ciseaux dans l'incision, sous l'iris.

Effectuez une incision en direction, mais sans pénétrer dans, la limite cornéo-sclérale. Ensuite, faites lentement pivoter l’œil de 360 degrés, en réalisant de petites incisions tout autour. Essayez de maintenir les ciseaux sous l’iris, en coupant simultanément la cornée et l’iris.

Il faut beaucoup de pratique pour le faire aussi facilement que je le montre ici. Une fois la cornée retirée, tournez l’œil sur le côté et appuyez doucement sur l’extérieur de l’œil pour faire sortir le cristallin. La structure restante aura ensuite une forme de coupe.

L’œil doit être divisé en quartiers. Pour ce faire, placez l’œil sur le côté et insérez la lame inférieure de vos ciseaux à ressort. Effectuez une incision longitudinale en direction, mais sans atteindre complètement, la tête du nerf optique.

Pour ce faire, gardez les bras le long du corps et les ciseaux devant vous, approximativement perpendiculaires à votre corps et à la coupe oculaire. Effectuez votre deuxième incision directement en face de la première. Prenez le temps d’ajuster correctement l’alignement afin d’obtenir une coupe régulière.

Effectuer plusieurs coupes peut provoquer des irrégularités, mais si elles sont bien alignées, elles ne sont pas visibles. Remarquez comment je parviens à travailler avec cette forme sphérique de l'œil plutôt que contre elle, car l'œil conserve sa forme normale. Une fois suspendu dans le PBS, le reste de la dissection s'effectuera sur une lame. Saisissez délicatement l'œil avec la pince angulée à 45 degrés et soulevez-le hors du PBS.

Placer l'œil sur une nouvelle lame. À l'aide des deux paires de pinces angulaires, déplier soigneusement l'œil. Remarquer qu'il existe une petite marge de cornée et d'iris autour du pourtour de l'œil, utile pour la manipulation.

Ensuite, vous devez couper chacun des quatre pétales en deux. Faites pivoter l'œil de manière à ce qu'un des pétales soit perpendiculaire à votre corps. Saisissez le coin du pétale avec une pince angulée à 15 degrés.

Soulevez légèrement, puis effectuez une incision partant de la limite entre la cornée et la sclérotique en direction de la tête du nerf optique. Ces incisions doivent être perpendiculaires à une tangente. Une tangente est une droite perpendiculaire au diamètre.

Par conséquent, vos incisions doivent être alignées avec le diamètre de l'œil. Faites maintenant pivoter la lame afin que le prochain pétale soit perpendiculaire à votre corps et répétez l'opération. Saisissez le coin du pétale.

Soulevez légèrement et coupez. Répétez jusqu'à ce que chacun des quatre grands pédales soit coupé en deux. La substance blanchâtre est la rétine nerveuse, qui recouvre directement l'épithélium pigmentaire de la rétine (RPE).

La rétine nerveuse peut protéger l'épithélium pigmentaire rétinien, donc laissez-la intacte jusqu'à ce que toutes vos incisions soient terminées. Remarquez que les pédales sont légèrement incurvées. Ne vous opposez pas à cette courbure.

Prenez votre temps pour bien aligner afin de réaliser une incision unique précise. Étant donné que l’œil est rond, il a tendance à fléchir ; pour éviter ce fléchissement, vous pouvez effectuer huit petites incisions.

Un sur chaque pédale. Utilisez la même stratégie de base que lors du tour précédent de quatre découpes. Soulevez le coin de la pédale et découpez, mais dans ce cas, ne coupez que jusqu'à environ la moitié de la longueur de la pédale.

Une fois toutes vos incisions effectuées, vous pouvez retirer la rétine nerveuse. Ici, j'ajoute quelques gouttes de PBS 1X à l'échantillon. Vous ne devez pas laisser votre épithélium pigmentaire rétinien sécher.

La rétine nerveuse ne devrait être que faiblement associée à l'épithélium pigmentaire rétinien sous-jacent. On peut observer qu'elle se détache assez facilement. Toutefois, elle reste généralement attachée au niveau de la limite cornéo-sclérale, qui, à l'intérieur de l'œil, correspond à une crête irrégulière appelée corps ciliaire.

Vous pouvez insérer la pointe de votre pince à 15 degrés dans la tête du nerf optique pour ancrer l'échantillon tout en détachant la rétine nerveuse. Le corps ciliaire marque la limite de l'épithélium pigmentaire de la rétine (RPE), le tissu fortement pigmenté qui s'est détaché. Voici l'iris, pas l'épithélium pigmentaire de la rétine.

Je recommande de retirer autant que possible l'iris, car il est très collant et peut se replier et adhérer à l'épithélium pigmentaire rétinien si la rétine neuronale est friable ou si des résidus restent attachés à l'épithélium pigmentaire rétinien. Deux causes sont probablement à l'origine du problème. Soit les yeux n'ont pas été fixés correctement, par exemple pendant une durée trop longue ou trop courte, soit ils ont été conservés trop longtemps avant la dissection.

La pédale que je m'apprête à découvrir ici n'a pas encore de raccourci. Vous pouvez voir comment la pédale se situe à environ un tiers du bord de l'ORE. C'est pourquoi les huit raccourcis sont recommandés.

Une fois que toute la rétine nerveuse a été éliminée, utilisez une pipette pour rincer plusieurs fois l’épithélium pigmentaire de la rétine (RPE) avec 100 à 200 microlitres de PBS jusqu’à ce que toutes les poussières et débris soient retirés. Déposez à la pipette 80 à 90 microlitres de glycérol à 90 % sur une lame propre en forme rectangulaire. Remarque : ce volume de glycérol est optimal pour un coverslip de 22 sur 50 millimètres et doit être ajusté en conséquence.

Pour d'autres tailles de lamelle, utilisez la pointe de votre pipette pour étaler le glycérol. Veillez à ne pas introduire de bulles d'air dans le glycérol. Si vous obtenez une bulle, déplacez-la vers le bord où elle éclatera.

Faites glisser la branche inférieure de votre pince à 15 degrés sous l’ORE et soulevez-la délicatement, puis abaissez lentement l’ORE dans le glycérol. L’ORE flottera à la surface du glycérol et pourrait se recourber ou se tordre légèrement. Utilisez votre pince pour redresser l’ORE et faire glisser le glycérol sur sa surface.

Si des bulles d'air se forment, déplacez-les vers le bord où elles éclateront, en tenant le couvre-objet à environ 45 degrés. Posez-le sur le bord du glycérol.

Ensuite, déplacez-la vers le bord de la lame. Tenez le bas du couvre-objet entre votre pouce et votre index et soutenez le bord opposé avec une pince à 15 degrés. Abaissez très lentement le couvre-objet vers la lame dès qu'un contact est établi.

Avec l’ORE, arrêtez de descendre, permettez au glycérol de migrer et continuez à abaisser lentement votre lame. Si vous abaissez la lame trop rapidement, des bulles d’air seront piégées dans votre préparation à cet endroit. J’abaisserai lentement la lame lorsqu’elle touchera l’ORE et je permettrai au glycérol de migrer.

Vous pouvez observer que lorsque je lâche rapidement la lame, des bulles d'air sont incorporées. Utilisez une quantité généreuse de vernis à ongles transparent pour fixer le bord de la lame. Appliquez-le tout autour du pourtour de la lame sur la préparation.

Ceci est un épithélium pigmentaire rétinien typique provenant d'une souris noire C57. Il est normal d'observer la vascularisation sous-jacente, comme indiqué ici. Il est également normal de constater certaines variations de pigmentation, telles que des zones apparaissant moins pigmentées.

Cependant, des zones claires comme celle-ci sont probablement dues à des lésions physiques de l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) et de la choroïde sous-jacente. Étant donné que la choroïde de l'œil est également pigmentée, il est possible que des dommages affectant un RPE noir passent inaperçus si la choroïde reste intacte.

Il s'agit d'un RPE typique provenant d'une souris diluée. Comme indiqué, vous pourrez observer la vascularisation et noter quelques variations de pigmentation, telles que des zones plus foncées et des zones plus claires. Toutefois, il est presque impossible de détecter des lésions sur un RPE dilué.

Ces petites taches sont-elles dues à des lésions ou s'agit-il d'une variation normale de la pigmentation ? Je suggère un examen au lampadaire et une coloration pour répondre à cette question. Cela vous donnera une idée si vous manipulez l'objet trop brutalement.

La coloration délimite clairement les membranes cellulaires, rendant les zones endommagées évidentes, mais en réalité, l’épithélium pigmentaire rétinien est assez résistant, et si vous manipulez l’œil par la cornée, il est peu probable que vous causiez des dommages. Voici une préparation en montage complet présentant de nombreux problèmes, dont le moindre, indiqué ici, est une marge de cornée trop large, pouvant entraîner des plis et des ondulations du matériau sinueux. On observe ici un tissu excédentaire important qui reste à l’arrière de l’œil.

Ce pédale est partiellement replié, et ici vous pouvez voir que l'épithélium pigmentaire rétinien a été partiellement déchiré. Un autre problème est que cet œil présente un aspect de roue à aubes. Ici, j'ai indiqué les angles des incisions.

Cependant, c'est ainsi qu'ils auraient dû être. N'oubliez pas que vos incisions doivent être perpendiculaires à la tangente et alignées sur le diamètre. Je viens de montrer comment disséquer un œil de souris pour une préparation complète du pigment rétinien.

Épithélium, la chose la plus importante est de maintenir une bonne posture, mais essayez de rester détendu. J'espère que cette vidéo vous a été utile et je vous souhaite bonne chance dans vos futurs expériences.