Name: Cultures organotypiques cérébelleuse: Défis apoptotiques et détection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Découvrez la culture organotypique cérébelleuse pour étudier l'apoptose induite par le ligand fast chez les souris sauvages et mutantes. Cette méthode permet d'analyser la viabilité cellulaire et les réponses des populations cérébelleuses.

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Cette étude a été financée en partie par la Fondation IPSEN. IMV est professeur American Cancer Society of Molecular Biology, et titulaire de la Chaire Irwin et Joan Jacobs en sciences de vie exemplaire. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du NIH, Leducq Foundation, Fondation Mériaux, Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation, et le HN et Frances C. Berger Foundation. Le PAS est financé par McKnight Fonds de dotation pour les neurosciences et le National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022). Les auteurs tiennent à remercier Mark Schmitt. Art graphique a été conçue par Jamie T. Simon. Parrainage a été aimablement fourni par Invitrogen.

1. Cultures organotypiques cérébelleuse: <ol><li> Pour réussir à produire des cultures organotypiques cérébelleuse utiliser des souris entre P0-P3 ou P8-P12. Pour notre expérience, nous avons utilisé des souris de la gamme P8-P12 parce que ce stade de développement était plus approprié pour notre étude. </li><li> Préparer la dissection et le milieu de culture: <ol><li> La dissection du cerveau et de préparation de tranches sont réalisées dans artificielle de sodium liquide céphalo-bas (ACSF) contenant du chlorure de calcium 1 mM, 10 mM D-glucose, 4mm chlorure de potassium, chlorure de magnésium 5 mM, du bicarbonate de sodium 26mm, 246mm de saccharose et le phénol solution rouge (1:1000) , pH 7,3. Pour stériliser la solution, elle filtre à travers un filtre 0,22 um et stocker à 4 ° C. </li><li> Tranches du cervelet sont cultivées dans 75% minimum Essential Medium Eagle (MEM), 25% de sérum de cheval inactivé à la chaleur, HEPES 25 mM, 1 mM de glutamine, 5mg / ml de glucose, la pénicilline (100 U / ml) et streptomycine (100 UI / ml). Filtrer le support à travers un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C pour un maximum de deux semaines. </li></ol></li><li> Disséquer cerveau dans glacée ACSF moyennes préalablement à barboter avec carbogène (95% d'oxygène et de dioxyde de carbone de 5%) Notez que la saturation avec Carbogen va changer le pH de la solution de sorte qu'il passera du rouge à l'orange. La dissection doit être effectuée dans le minimum de temps possible en faisant attention à ne pas endommager la structure du cerveau. </li><li> Trancher le cerveau dans des coupes sagittales de 400 um en utilisant un vibratome. <ol><li> Faites une coupe sagittale avec une lame de rasoir dans un hémisphère, en essayant de couper aussi peu que possible du cervelet, ce qui donnera une surface plane pour le tranchage. Le cortex est utilisé uniquement pour le soutien pour faire le découpage plus facile, mais puisque le temps est une question importante qu'il est plus commode de couper la moitié rostrale du cortex avec une lame de rasoir. </li><li> Utilisez cyanoacrylate (superglue) pour fixer la position du cerveau sur la plaque de métal vibratome. Il est important de refroidir la plaque sur la glace avant d'ajouter la colle et à le répandre ainsi l'aide de l'extrémité du tube pour former une couche de colle mince. Si il ya un excès de superglue, il va se détacher de la plaque quand il entre en contact avec l'ACSF et l'échantillon sera perdu. </li><li> Une fois que le cerveau est attaché à la plaque vibratome, ajouter suffisamment de supports ACSF pour couvrir le cerveau et mettre de la glace en dessous de la plaque pour le garder froid. </li><li> Couper les tranches 400 um et de les transférer à une pipette Pasteur en plastique (couper la pointe de l'élargir et d'éviter d'endommager les tranches) pour une plaque de 6 puits de culture cellulaire contenant ACSF sur la glace. </li><li> Séparez le cervelet du reste du cerveau avec l'aide de deux seringues à insuline (seringues avec petit diamètre de 28 aiguilles de calibre) sous la loupe binoculaire. Certaines tranches aura Superglue fixés sur les bords: c'est le moment d'essayer de l'enlever car il peut affecter la viabilité de la tranche. Il est important de le faire avec soin, sans endommager la structure du cervelet. </li></ol></li><li> Transférer les tranches de cervelet de plaques de 6 puits contenant 30mm inserts plaque de culture avec 0,4 um pores. Ajouter 1 mL de milieu de culture par puits, qui a été pré-conditionnée par incubation pendant au moins 2 heures à 37 ° C et 5% de CO 2 (dans la incubateur de culture cellulaire). Placer les inserts sur le dessus du support en vous assurant qu'il n'ya pas de bulles d'air piégées en dessous et puis placer les tranches de cervelet (1-3 par plaquette) sur le dessus des inserts en s'assurant qu'ils sont en pleine extension et qu'aucun liquide n'est en les couvrant. Aspirer l'excès des médias, si nécessaire. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 change le milieu de culture tous les 2 ou 3 jours. Il est préférable de ne remplacer qu'une partie du milieu (par exemple ½ volume) à la fois, puisque milieu utilisé contient des facteurs trophiques tranche de dérivés qui sont importantes pour la survie cellulaire. </li></ol> 2. Traitement de Fas et de coloration des tranches du cervelet: <ol><li> Pour l'expérience du challenge apoptotiques, nous les tranches première culture pendant 5 jours médiatique en pleine mutation, le jour in vitro de 3 (DIV3). Sur DIV5 cultures sont traitées avec 0,5 pg / ml d'anticorps de l'Jo2 Fas agoniste en l'ajoutant directement aux médias dans le but d'avoir un fond propre de la mort cellulaire depuis les changements de médias peuvent induire une certaine mortalité dans les cultures. La moitié des puits ne sont pas traitées comme témoins. </li><li> Après 24 heures retirer le support sous le inserts par aspiration. Pour fixer les tranches, ajouter 1 ml de glace froide PFA 4% en dessous et 1 ml dessus de l'insert. Incuber 10 minutes à température ambiante. </li><li> Après 10 minutes retirer le PFA et laver rapidement avec du PBS froid. </li><li> Ensuite enlevez le PBS et ajouter 1 ml et en dessous de 1 mL au-dessus de l'insert de 20% du méthanol glacé dans le PBS et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Laver à nouveau avec du PBS et ajouter 1 mL dessous et 1 ml dessus de l'insert de 0,5% de Triton-X-100 dans du PBS pour la perméabilisation. Incuber pendant un minimum de 12 heures à 4 ° C. </li><li> Après perméabilisation, bloc avec 20% de BSA dans du PBS pour un minimum de4 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. A ce stade, les tranches peuvent être conservés dans une solution de blocage d'au moins 3 jours à 4 ° C. </li><li> Afin de colorer les tranches soigneusement découpé le morceau de la membrane d'insérer attaché à la tranche du cervelet et le transférer à des plaques 24 puits contenant du PBS. </li><li> L'immunomarquage est réalisé de manière séquentielle, d'abord avec le réactif TUNEL pendant une heure et ensuite avec l'anticorps Calbidin nuit. <ol><li> Aspirer le PBS et ajouter 250 uL hors réactif TUNEL dans chaque puits de s'assurer qu'il couvre toute la surface de la tranche. Incuber à 37 ° C pendant une heure dans l'obscurité. </li><li> Après une heure retirer le mélange TUNEL et laver avec du PBS à trois reprises pendant 10 minutes. </li><li> Après le dernier lavage, retirez le PBS et ajouter 250 ul d'une dilution de 1 / 1000 de l'anticorps calbindine dans du PBS et incuber une nuit à 4 ° C dans l'obscurité. </li><li> Retirer la solution d'anticorps primaire et laver avec du PBS à trois reprises pendant 10 minutes. </li><li> Ajouter 250 ul d'anticorps secondaire dilué au 1 / 500 en PBS et laisser incuber pendant au moins trois heures à température ambiante dans l'obscurité. Le kit de TUNEL, nous avons utilisé est étiqueté avec TMR rouge, donc notre anticorps secondaire pour calbindine est conjugué à Alexa-488. </li><li> Laver trois fois pendant 10 minutes avec du PBS et monter les tranches sur une lame de microscope en verre en utilisant un média de montage qui contient DAPI. </li><li> Les tranches d'image avec un microscope confocal en utilisant les 488 nm longueur d'onde d'excitation et 561 nm pour calbindine et TUNEL respectivement. </li></ol></li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Le principal défi de ce protocole est d'être capable de générer des cultures saines tranche de cervelet, surtout depuis que notre lecture finale sera la mort cellulaire. Une saine culture apparaît comme l'un où la couche de cellules du corps est translucide et vous permet de voir la structure en feuillets du cervelet sous le microscope (figure 1). Après quelques jours dans la culture des tranches de commencer à cellules minces et non-neuronales peuvent être observés migrer loin de la marge de la tranche. Les cellules rondes sombre (la plupart des macrophages probable) qui couvrent les tranches après quelques jours de culture, finira par diminuer en nombre après 10-14 jours in vitro (figure 2) 5. La preuve ultime de la viabilité des tranches est de coloration pour les différents marqueurs cellulaires, telles que calbindine pour les cellules de Purkinje. La figure 3 montre une image au microscope confocal à représentatifs de la couche de cellules de Purkinje avec plusieurs noyaux TUNEL positif. Il est important de considérer que même si certaines tranches reçu un stimulus apoptotique, elles étaient seulement exposés pendant 24 heures. Cela a permis de suffisamment de temps pour observer la fragmentation de l'ADN dans les cellules de mourir avec la coloration TUNEL, mais une couche de cellules de Purkinje défini était encore présent. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Healthy tranche de cervelet au DIV2. Cette image montre la couche de cellules translucides corps et la structure en feuillets du cervelet dans une tranche saine. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Healthy tranche de cervelet au DIV 7. Dans cette image on peut encore observer la structure feuilletée du cervelet et de l'apparence des organes de cellule sombre. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Représentant l'image d'une tranche de Fas-traitée cérébelleux. Cette image confocale montre les cellules de Purkinje colorés avec calbindine (vert) et les cellules apoptotiques positifs pour la coloration TUNEL (rouge). Les cellules de Purkinje ne semblent pas en une seule rangée, mais sont regroupés en formant une structure ressemblant à folium.

<ol><li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+ependymal+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Human fetal ependymal cells in tissue cultures.</a> Anat Rec. 99, 523-529 (1947).</li>
<li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+studies+of+human+fetal+brain+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Etudes+Neonatales%22%5BJournal%5D)">Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures.</a> Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocol+for+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeat%2C+H+%22Organotypic+Slice+Cultures+of+Neural+Tissue+in+Culturing+Nerve+Cells%22">Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).</li>
</ol>

Tous les travaux menées sur des animaux a été effectué conformément aux politiques établies par le IACUC. Le Salk Institute est un centre accrédité AAALAC.

Cette méthode décrit l&#39;une des nombreuses applications possibles des cultures organotypiques neuronale et il nous a permis d&#39;étudier l&#39;effet de stimuli apoptotiques de type sauvage et mutant tranches cérébelleux. La partie la plus critique de cette expérience est d&#39;être capable de générer constamment de saines cultures tranche de cervelet. Les facteurs clés sont la dissection et la technique de tranchage et la capacité d&#39;exécuter le protocole dans le moins de temps possible, mais en même temps, en faisant attention à ne pas endommager les tranches. Un autre facteur crucial est la préparation et la composition des milieux de culture, ces cultures sont très sensibles, alors nous avons dû tester plusieurs recettes et les marques de médias. Même les différents lots de sérum ou de tout autre composant du média pourrait affecter la viabilité des tranches. Nous avons obtenu les meilleurs résultats avec le sérum de cheval à partir du lot # 480116 Invitrogen. Une fois les tranches de cervelet sont générés, on peut étudier le développement du cervelet, de l&#39;électrophysiologie, la survie cellulaire, seul ou en réponse à des stimuli apoptotiques, excitotoxicité ou la privation d&#39;oxygène. Des études comparatives à l&#39;aide de type sauvage et mutant tranches cérébelleuses ont été très perspicaces dans de nombreux aspects de la fonction cérébelleuse et le développement.

<table><tbody><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire 6 puits / 24 puits</td><td>Corning</td><td>3506/ 3527</td><td></td></tr><tr><td>Inserts pour plaque de culture de 30 mm (pore de 0,4-&amp;mu;m)</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps purifié NA/LE de hamster anti-souris CD95 (Jo2)</td><td>BD Biosciences</td><td>554254</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Détection in situ&lt;/em&gt; de la mort cellulaire, TMR rouge</td><td>Roche Group</td><td>12 156 792 910</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps primaire anti-calbindine D-28k de lapin</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire IgG de chèvre anti-lapin Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage Vectashield avec DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cultures organotypiques cérébelleuse: défis apoptotiques et détection

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Cultures organotypiques de tissu neuronal ont d&#39;abord été introduite par Hogue en 1947 1,2 et ont constitué une percée majeure dans le domaine des neurosciences. Depuis lors, la technique a été développée et actuellement il ya de nombreuses façons de préparer des cultures organotypiques. La méthode présentée ici a été adaptée de celle décrite par Stoppini et al. Pour la préparation des tranches et de Gogolla et al. Pour la procédure de 3,4 coloration. Une caractéristique unique de cette technique est qu&#39;elle vous permet d&#39;étudier les différentes parties du cerveau comme l&#39;hippocampe ou du cervelet dans leur structure d&#39;origine, offrant un gros avantage sur les cultures dissociées dans laquelle toute l&#39;organisation cellulaire et les réseaux neuronaux sont perturbés. Dans le cas du cervelet, il est encore plus avantageuse car elle permet l&#39;étude des cellules de Purkinje, extrêmement difficile d&#39;obtenir que la culture principale dissociées. Cette méthode peut être utilisée pour étudier certaines caractéristiques développementales du cervelet in vitro, ainsi que pour des expériences électrophysiologiques et pharmacologiques dans les deux de type sauvage et des souris mutantes. La méthode décrite ici a été conçu pour étudier l&#39;effet de stimuli apoptotiques tels que Fas ligand dans le cervelet en développement, utilisant une coloration TUNEL pour mesurer la mort cellulaire par apoptose. Si coloration TUNEL est combiné avec des marqueurs type de cellule spécifique, comme pour les cellules de Purkinje calbindine, il est possible d&#39;évaluer la mort cellulaire d&#39;une manière population cellulaire spécifique. La coloration calbindine sert aussi le but d&#39;évaluer la qualité des cultures du cervelet.

Cette méthode décrit la génération de cultures organotypiques cérébelleux et l&#39;effet de certains stimuli apoptotiques sur la viabilité des différents types de cellules du cervelet.

Cultures organotypiques cérébelleuse: Défis apoptotiques et détection

Les cultures organotypiques de tissu neuronal ont été introduites pour la première fois par Hogue en 1947 1,2 et ont constitué une avancée majeure dans le domaine des neurosciences. ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier l'effet du stimulus apoptotique fast ligand sur le cervelet en développement chez des souris de type sauvage et mutantes. Cette étude est réalisée en premier lieu par la dissection du cerveau de souris de type sauvage et de souris invalidées entre les jours postnataux 8 et 12. La deuxième étape consiste à découper les cerveaux en tranches de 400 micromètres d'épaisseur et à isoler le cervelet de chaque tranche.La troisième étape consiste à cultiver les tranches cérébelleuses pendant cinq jours afin de s'assurer qu'elles sont saines avant d'induire la mort cellulaire à l'aide du ligand rapide. La dernière étape de la procédure est d'analyser l'effet du ligand rapide sur les différentes populations cellulaires cérébelleuses chez des souris de type sauvage et des souris invalidées, en se basant sur une coloration immunofluorescente du marqueur apoptotique TUNEL, combinée à des marqueurs spécifiques des types cellulaires tels que la calbindine pour les cellules de Purkinje. Le principal avantage des cultures vivantes cérébelleuses est qu'elles permettent de préserver l'organisation régionale du cervelet, contrairement aux cultures primaires dissociées où les réseaux neuronaux et plusieurs organisations sont perturbés.Ainsi, cette méthode permettra de répondre à certaines questions clés en neurosciences, notamment parce qu'on dispose de la souris de type sauvage et de la souris mutante. On peut donc étudier le développement comparatif, la physiologie, ainsi que l'électrophysiologie et la pharmacologie. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la fonction du ligand rapide dans la survie des cellules cérébelleuses, elle peut également être utilisée pour examiner les effets du ligand rapide dans le cortex et l'hippocampe.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car afin d'obtenir une lyse cérébelleuse saine, il est essentiel de les mettre en culture le plus rapidement possible sans compromettre leur intégrité. Par conséquent, il est important de maîtriser de bonnes compétences en dissection et en sectionnement avant de tenter l'ensemble du processus. Lorsque cela est possible.Les étapes de la procédure suivante doivent être effectuées dans une hotte de culture tissulaire avant la dissection. Préparez un milieu de LCR pour la dissection cérébrale et la préparation des tranches, ainsi qu'un milieu de culture pour tranches selon le protocole écrit, et conservez-les à quatre degrés Celsius le jour de la dissection. Préparez des plaques de culture tissulaire pour la culture des tranches cérébelleuses.Ajoutez un millilitre de milieu de culture de tranches dans chaque puits d'une plaque à six puits. Ensuite, utilisez des pinces stériles pour placer les inserts de plaque de culture dans chacun. Veillez à ce qu'aucune bulle d'air ne soit piégée sous l'insert.Placer la plaque de culture dans un incubateur à culture tissulaire réglé à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins deux heures afin de préconditionner le milieu. Ensuite, faire barboter le milieu ACSF glacé avec du gaz carbogène ; la saturation du milieu avec du carbogène modifie le pH de la solution et provoque un changement de couleur du rouge à l'orange.Verser un peu de milieu A CSF glacé et saturé en gaz dans une boîte de Pétri stérile et dans une plaque à six puits. Placer le tout sur de la glace, avec la plaque du vibratome qui sera utilisée pour découper le cerveau. La boîte de Pétri contenant le milieu A CSF glacé et saturé en gaz servira à la dissection du cerveau d'un souriceau âgé de P8 à P12 après la dissection.Utilisez une lame de rasoir pour effectuer une coupe sagittale dans un hémisphère afin d'obtenir une surface plane pour le montage sur la plaque vibram. La partie rostrale du cortex peut également être sectionnée. Séchez la plaque vibram refroidie avec un papier absorbant.Ensuite, ajoutez un peu de colle cyanoacrylate sur la platine et répartissez-la en zigzag à l’aide de la pointe du tube de colle. Pour former une fine couche adhésive, utilisez une spatule pour transférer le cerveau sur la platine du vibrotome, le côté aplati étant en contact avec la colle. Une fois le cerveau fixé sur la plaque du vibrotome, ajoutez suffisamment de milieu ACSF pour recouvrir le cerveau et placez de la glace sous la platine afin de le maintenir au froid.Découper le cerveau en tranches de 400 micromètres. Puis utiliser une pipette en plastique pour pâtes dont l'extrémité élargie a été coupée pour transférer les tranches dans la plaque à six puits contenant le milieu A CSF sur de la glace, en travaillant sous microscope stéréo.Utilisez deux seringues à insuline équipées d'aiguilles de petit diamètre (28 gauge) pour séparer le cervelet du reste du cerveau. Si l'une des tranches présente de la colle forte sur le bord, utilisez les deux aiguilles de seringue pour retirer la colle de la tranche. Utilisez la pipette en plastique pour pâtes, dont l'extrémité a été coupée et élargie, pour transférer les tranches sur le dessus des filtres.Ajouter une à trois tranches par insert afin de s'assurer qu'elles sont complètement étendues et qu'aucun liquide ne les recouvre. Si nécessaire, aspirer l'excès de milieu à l'aide de la pipette, puis incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Après 48 heures, remplacer la moitié du volume de milieu par du milieu frais, en veillant à ce qu'aucune bulle d'air ne reste piégée sous l'insert.Le milieu original restant contient des facteurs trophiques découpés dérivés qui sont importants pour la survie cellulaire. Le défi apoptotique est réalisé après cinq jours de culture. Ajoutez l'anticorps agoniste rapide JO deux au milieu de culture cellulaire dans les puits à traiter.Laisser la moitié des puits non traités comme témoins. Une fois les 24 heures écoulées, aspirer le milieu provenant des puits. Ensuite, fixer les tranches en pipetant un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % glacé sous l'insert et un millilitre de PFA au-dessus de l'insert.Laisser les tranches fixer dans le PFA pendant 10 minutes à température ambiante après 10 minutes. Aspirer le PFA et rincer brièvement avec deux millilitres de PBS froid au moyen d'une pipette. Ajouter un millilitre au-dessus de l'insert et un millilitre sous l'insert.Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez un millilitre de méthanol à 20 %, glacé, dans le PBS sous la membrane et un millilitre au-dessus de la membrane. Incubez cinq minutes à température ambiante, puis aspirez le méthanol à 20 % du puits et lavez la membrane et le puits D avec du PBS. Comme précédemment, ajoutez un millilitre de Triton X-100 à 0,5 % dans le PBS au-dessus de la membrane, et un autre millilitre en dessous de la membrane.Incuber pendant au moins 12 heures à quatre degrés Celsius pour permettre la pénétration des tranches après perméabilisation. Aspirer le Triton X-100 0,5 % dans le PBS et ajouter un millilitre de BSA 20 % dans le PBS au-dessus de la tranche et un millilitre sous la tranche à l’aide d’une pipette. Bloquer les tranches pendant au moins quatre heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius.Lorsque le blocage est terminé, utilisez des ciseaux propres pour couper soigneusement la membrane porteuse du fragment de tranchée cérébelleuse. Ensuite, utilisez une pince propre pour transférer le morceau de membrane dans une plaque de 24 puits contenant du PBS, aspirez le PBS et ajoutez 250 microlitres de réactif tunnel dans chaque puits, en veillant à ce que le réactif recouvre entièrement la surface de la tranchée.Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure à l’obscurité ; une fois l’heure écoulée, aspirer le réactif du tunnel à partir des puits et le remplacer par 500 microlitres de PBS. Protéger la plaque de la lumière et l’incuber à température ambiante pendant 10 minutes afin de laver.Répétez ce processus deux fois après le dernier lavage. Aspirez le PBS et ajoutez 250 microlitres d'une dilution au 1/1000 de l'anticorps anti-calbindine dans du PBS, puis incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière. Le lendemain.Aspirez la solution d'anticorps primaire et lavez avec du PBS 3 fois pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez 250 microlitres d'anticorps secondaire dilué au 1/500 dans du PBS. Couvrez la plaque avec du papier d'aluminium pour la protéger de la lumière et incubez pendant au moins trois heures à température ambiante après l'incubation.Lavez les tranches trois fois pendant 10 minutes avec du PBS, en utilisant un milieu de montage contenant du dappy. Montez les tranches sur une lame de microscope en verre et recouvrez-les d'une lamelle. Observez les tranches au microscope confocal en utilisant des longueurs d'onde d'excitation de 488 nanomètres et de 561 nanomètres pour le kale, le bendin et le tunnel, respectivement.Cette image montre une coupe cérébelleuse saine. Après deux jours in vitro, la couche des corps cellulaires apparaît translucide et la structure foliée du cervelet est clairement visible au microscope. Après sept jours in vitro, la structure foliée de la coupe cérébelleuse saine est encore visible.En outre, des corps cellulaires sombres, probablement des macrophages, recouvrent généralement la tranche. L'image confocale présentée ici est représentative d'une tranche cérébelleuse traitée rapidement. Les cellules bikini apparaissent en vert après coloration avec un anticorps primaire, suivi d'un anticorps secondaire conjugué à l'Alexa 488.Les cellules apoptotiques positives au marquage TUNEL apparaissent en rouge car le kit TUNEL utilisé est marqué avec du TMR. Les cellules Bikini rouges n'apparaissent pas en une seule rangée, mais forment des agrégats semblables à une structure, lors de la réalisation de cette procédure. Il est important de se rappeler de travailler dans une hotte de culture tissulaire chaque fois que possible, et de minimiser le temps d'exposition du tissu cérébral à d'éventuels contaminants comme les bactéries ou les champignons.En utilisant cette procédure, d'autres méthodes peuvent être appliquées à ces tranches, notamment des analyses biochimiques et électrophysiologiques, afin d'obtenir des informations supplémentaires sur la teneur en protéines ainsi que sur l'excitabilité neuronale. Cette technique a été initialement développée pour étudier l'effet de la mort cellulaire rapide médiée dans les cellules de Perkin portant des mutations affectant la voie rapide. Les cellules périales survivent rarement en culture primaire.Ainsi, cette procédure constituait la meilleure approche expérimentale. J'espère qu'après avoir visionné cette vidéo, vous aurez une bonne idée de la manière de préparer des tranches de barillets cérébelleux et de la façon dont on peut étudier les stimuli apathiques ainsi que leurs effets sur différents types cellulaires cérébraux.

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La couche de granules cérébelleux externe est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement. Ici, nous présentons un protocole de cibler la modification génétique de cette couche au sommet de la prolifération utilisant ex électroporation et la culture de tranches de cervelet vivo à partir embryonnaires Jour 14 embryons de poulet.

Culture ex vivo de Chick cervelet tranches et spatialement ciblées électroporation de granules précurseurs de cellules

Ce protocole décrit comment mesurer avec précision la viabilité neuronale à l'aide de la diurétate de fluorescéine (FDA) et de la double coloration à l'iodure de propidium (PI) dans des neurones de granules cérébelleux cultivés, une culture neuronale primaire utilisée comme modèle in vitro dans les recherches en neuroscience et neuropharmacologie.

Évaluation de la viabilité neuronale à l&#39;aide de diacétate de fluorescéine-iodure de propidium Double coloration dans la culture du neurone de granulé céréalier

Ce protocole décrit une méthode simple pour isoler et cultiver les neurones de granule cérébral de souris primaire (SCT) de petits 6-7 jours vieux, transduction efficace du SCT pour la perte et gain d’études de fonction et modélisation excitotoxicité neuronale induite par le NMDA, la mort cellulaire induite par la basse-potassium, lésions de l’ADN et le stress oxydatif en utilisant le même modèle de culture.

Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris

Nous présentons ici une méthode pour préparer organotypique cultures tranche de cervelet de souris et de la gaine de myéline, la coloration par immunohistochimie approprié pour enquêter sur les mécanismes de la myélinisation et remyélinisation du système nerveux central.

Préparation et Immunostaining des cérébelleux Myélinisantes Organotypiques

Mener des expériences in vitro pour refléter les conditions in vivo aussi adéquatement que possible n'est pas une tâche facile. L'utilisation des cultures cellulaires primaires est une étape importante vers la compréhension de la biologie cellulaire dans un organisme entier. Le protocole fourni décrit comment se développer avec succès et cultiver les neurones cérévelaires embryonnaires de souris.

Culture primaire des neurones isolés du cervelet de souris embryonnaire

Les cultures de tranches organotypiques sont un outil puissant pour étudier les processus neurodéveloppementaux ou dégénératifs/régénérateurs. Ici, nous décrivons un protocole qui modélise la mort neurodéveloppementale des cellules de Purkinje dans les cultures de tranche de cévedrillon de souris. Cette méthode peut bénéficier à la recherche dans la découverte de médicaments neuroprotecteurs.

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Les cellules cérébelleuses de Purkinje (PC) sont particulièrement sensibles aux déficiences de la réponse aux dommages de l’ADN. Un protocole est présenté pour l’évaluation visuelle de la dynamique de la réponse de la PC aux dommages à l’ADN, ce qui implique la coloration des chaînes poly(ADP-ribose) liées aux protéines dans des cultures organotypiques cérébelleuses.

Visualisation de la réponse aux dommages de l’ADN dans les cellules de Purkinje à l’aide de cultures organotypiques cérébelleuses

Découvrez la culture organotypique cérébelleuse pour étudier l'apoptose induite par le ligand fast chez les souris sauvages et mutantes. Cette méthode permet d'analyser la viabilité cellulaire et les réponses des populations cérébelleuses.

Cultures organotypiques cérébelleuse: Défis apoptotiques et détection

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