Name: Mise à jour annexine V / propidium Assay apoptose iodure permettant une évaluation précise de la mort cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Découvrez un protocole amélioré d'annexine V/iodure de propidium pour évaluer précisément la mort cellulaire par apoptose et nécrose. Cette méthode réduit les faux positifs jusqu'à 40% grâce à la fixation et la dégradation de l'ARN.

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Cette étude a été soutenue par un en sciences naturelles et en génie du Canada de subvention (CRSNG) de recherche et un ministère de l&#39;Agriculture Financement Consortium accorder à la DRB. AMR est soutenu par une bourse CRSNG Vanier canadien des études supérieures, Université de l&#39;Alberta et assistanat à l&#39;enseignement une reine Elizabeth II bourses d&#39;études supérieures.

Cette procédure peut être effectuée dans 500 ul des tubes siliconés ou 6 ml en polystyrène à fond rond tubes FACS. Ce dernier est normalement utilisée lors de la réalisation d'analyses de viabilité en conjonction avec d'autres procédures. Tous les volumes sont donnés à 6 ml tubes en polystyrène FACS à fond rond. Pour 500 ul des tubes siliconés, de réduire l'ensemble des volumes de 1 / 5. La concentration optimale pour l'analyse de cytométrie en flux est de 2-4 x 10 6 cellules par 200 le volume ul. La perte de cellules peuvent résulter de cette procédure et donc nous recommandons que chaque échantillon se compose de 4 x 10 6 cellules au début de la procédure. 1. Préparation des cellules <ol><li> Récolte des cellules - se référer à des procédures spécifiques pour les lignées de cellules correspondant ou des isolations de cellules primaires. </li><li> Centrifuger les échantillons à 335 x g pendant 10 minutes et décanter le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans 2 ml de phosphate 1 x saline tamponnée (PBS) - / - (pas de calcium, de magnésium aucune). </li><li> Centrifuger les échantillons à 335 x g pendant 10 minutes et décanter le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon 1 x V annexine contraignant. </li><li> Centrifuger les échantillons à 335 x g pendant 10 minutes et décanter le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans 100 ul de tampon 1 x V annexine contraignant. </li></ol> 2. Application de l'annexine V / PI Stain <ol><li> Ajouter annexine V, conformément aux recommandations du fabricant [par exemple, 5 uL annexine V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)]. </li><li> Incuber les tubes dans l'obscurité pendant 15 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter 100 ul d'une mémoire tampon annexine V x contraignant pour chaque tube de réaction. Il devrait y avoir environ 200 uL dans chaque tube. </li><li> Ajouter 4 pi de PI (Sigma, Cat # P-4864-10 ml) qui a été diluée à 1:10 dans une mémoire tampon annexine V x contraignant (1 PI uL avec 9 x 1 ul annexine V tampon de liaison). Cela produira une concentration finale de PI 2 ug / ml dans chaque échantillon. </li><li> Incuber les tubes dans l'obscurité pendant 15 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter 500 ul 1 x annexine V tampon de liaison pour laver les cellules. </li><li> Centrifuger les échantillons à 335 x g pendant 10 minutes et décanter le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans 500 ul de tampon 1 x V annexine contraignant et 500 uL de formaldéhyde à 2% pour créer une solution à 1% de formaldéhyde (fixateur). Mélanger en tapotant doucement les tubes. </li><li> Fixer les échantillons sur la glace pendant 10 minutes. Alternativement, les échantillons peuvent être conservés une nuit à 4 ° C dans l'obscurité. Si cette dernière méthode est choisie, assurez-vous d'être cohérent dans tous les tubes étiquetés avec l'annexine V / PI (y compris les contrôles de compensation). </li><li> Ajouter 1 mL 1 x PBS - / - pour chaque échantillon et mélanger doucement en tapotant. </li><li> Centrifuger les tubes à 425 x g pendant huit minutes et décanter le surnageant. </li><li> Répétez les étapes 2.10 et 2.11. </li><li> Resuspendre le culot en feuilletant le tube. </li><li> Ajouter 16 uL d'dilué à 1:100 Une RNase (Sigma, R4642) pour donner une concentration finale de 50 ug / ml. Incuber pendant 15 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 1 mL 1 x PBS - / - et mélanger doucement en tapotant. </li><li> Centrifuger les tubes à 425 x g pendant huit minutes. </li><li> Les échantillons sont maintenant prêts à être analysés. Alternativement, les échantillons peuvent être utilisés pour les étapes ultérieures, si coloration annexine / PI coloration est effectuée en parallèle avec d'autres procédures. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Exemples de types de cellules et de lignées cellulaires qui présentent divers degrés de coloration PI faux-positifs sont présentés dans la figure 1. Pour tenir compte des événements de faux-positifs, les cellules ont été fixées puis traités à la RNase A. Il en résulte une diminution significative du nombre de faux positifs événements, comparativement aux cellules qui n'ont pas subi un traitement RNase (figure 2B). La figure 2C montre des images représentant des cellules qui ont subi un traitement RNase, par rapport aux cellules qui n'ont reçu aucun traitement RNase. La figure 3 montre comment la modification annexine V / PI protocole, avec fixation et étapes de traitement RNase, améliore les protocoles conventionnels en limitant le nombre d'événements coloration de faux-positifs. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Conventionnel protocoles iodure de propidium coloration conduire à un nombre important de faux événements positifs. Nous avons déjà évalué l'étendue de la coloration de faux positifs dans les cellules primaires à travers un large éventail de modèles animaux ainsi que dans une variété de 10 lignées cellulaires. Images représentant montrent l'étendue de coloration de faux positifs dans les trois populations cellulaires uniques (une lignée cellulaire couramment utilisés - les macrophages RAW et deux cellules primaires - les macrophages murins de moelle osseuse (BMM) et les macrophages des poissons rouges rénale primaire (PKM)). Certes les événements positifs attendus afficher le co-localisation entre PI et DRAQ5 dans le compartiment nucléaire (zones jaunes représentent colocalisation entre PI et DRAQ5). DRAQ5 est très membraNE perméables colorant qui précise compartiment colorants nucléaires dans les deux cellules vivantes et mortes 10,11,12. Pour faciliter la détermination visuelle de la colocalisation DRAQ5 tache a été donnée une pseudo couleurs vertes. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Améliorer la précision du PI coloration nucléaire. (A) Nous avons évalué la précision de la PI coloration nucléaire basée sur le degré de similitude d'un certain nombre de taches bien caractérisés nucléaire (BrdU, 7-AAD et DAPI) pour DRAQ5. BrdU est un nucléoside synthétique qui est incorporé dans l'ADN des cellules en prolifération, et en tant que tels ne tache dans le compartiment nucléaire. 7-AAD a une forte affinité pour l'ADN et, semblable à PI, ne peut pas traverser une membrane plasmique intacte. DAPI a également une forte affinité pour l'ADN et le nucléaire, le plus couramment utilisé dans la coloration de microscopie à fluorescence. Le degré de similarité était&gt; 99% entre BrdU, 7-AAD, DAPI et DRAQ5, mettant en évidence leur capacité à bien tacher le noyau de la cellule en RAW 264.7 macrophages. En revanche, coloration cytoplasmique PI repose sur des protocoles classiques conduit à une diminution marquée de la similitude pour cent de coloration par rapport à DRAQ5. (B) Des résultats similaires sont observés dans deux cellules primaires testées: les macrophages murins de moelle osseuse (BMM) et les macrophages des poissons rouges rénale primaire (PKM). Incorporation de 50 ug / ml de RNase A au stade spécifique au sein de la procédure de coloration supprime coloration PI non nucléaire et augmente considérablement le degré de similitude par rapport à DRAQ5 coloration. (C) des images représentant des macrophages rénaux primaires montrent le degré de similitude des cellules avec et sans traitement RNase. Pour faciliter la détermination visuelle des différences entre les traitements, DRAQ5 a été donné un vert. Les zones jaunes représentent colocalisation entre BrdU et DRAQ5 et PI et DRAQ5. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Mise à jour annexine V / PI réduit significativement l'apoptose fausses / événements nécrotiques. Primaire des macrophages rénaux Goldfish (PKM) ont été colorés avec conventionnels et modifiés annexine V / PI protocoles. Les diagrammes de dispersion illustrent l'annexine V / PI tache dans PKM poissons rouges. Le nuage de points sur la gauche montre conventionnelle annexine V / PI coloration (pas de RNase) des cellules PKM. Le nuage de points sur la droite montre les cellules PKM colorés avec le V modifiés annexine / PI protocole (par la RNase). L'addition de RNase en une réduction marquée de la coloration PI en raison de la suppression des fausses taches de positif. PKM cellules ont ensuite été analysées en fonction des populations distinctes dans les progéniteurs des cultures-précoce (EP), les monocytes (Mono) et les macrophages matures (Mat Mac). La réduction du nombre d'événements positifs PI, en raison de l'enlèvement de faux événements positifs est plus prononcé dans les grandes cellules macrophages matures que dans les petites cellules souches précoces. Les conclusions fondées sur des protocoles classiques aurait tort suggéré une corrélation positive dans la mort cellulaire des sous-ensembles de macrophages plus mature.

<ol><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
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</ol>

L&#39;annexine V / PI protocole présenté ici est une version modifiée de protocoles conventionnels et prend en compte la présence d&#39;ARN dans le cytoplasme, qui a également une forte affinité pour les PI. Introduction de la RNase A (50 pg / ml) après une étape de fixation de formaldéhyde à 1% en fin de la procédure de coloration améliore considérablement la précision de la PI coloration nucléaire. Pas d&#39;effets négatifs sont observés dans la PI coloration nucléaire ou de la membrane plasmique annexine V coloration. Sans RNase A de traitement, jusqu&#39;à 40% des résultats de PI tache peut conduire à de faux événements positifs, ce qui conduit à un impact potentiellement significatif et négatif sur les conclusions aval 10. Notre protocole de coloration modifiée annexine V / PI est simple et a été utilisé efficacement dans un large éventail de types de cellules (cellules primaires: les macrophages murins de moelle osseuse et des splénocytes; porcine cellules résidentes du poumon, les macrophages pulmonaires alvéolaires, mésentériques isole des ganglions lymphatiques, les leucocytes du sang périphérique , splénocytes, les cellules de blastoderme de poulet; macrophages goldfish rénale primaire; leucocytes du sang périphérique de carpe; lignées cellulaires: les macrophages RAW 264.7, Jurkat cellules T, les macrophages 3D4/31 porcine, le CCA-71 fibroblastes nageoires des poissons rouges, les cellules B 3B11 silure 10). Il est important de noter que les cellules sont touchés différemment par la coloration PI faux positifs, avec des cellules primaires ayant généralement un plus grand nombre de faux événements positifs 10. Les différences de coloration de faux positifs parmi PI ces populations cellulaires peut être partiellement attribuée à des différences dans la taille des cellules, mais peut aussi résulter de différences dans le contenu ARN. En tant que tel, l&#39;incorporation de cette procédure est particulièrement pertinent pour les systèmes expérimentaux qui utilisent, entre autres, les cellules subissant un stress génotoxique, les cellules traitées avec des médicaments du cycle cellulaire arrestation tels que la thymidine ou l&#39;hydroxyurée, les cellules infectées viralement, et des études sur les cellules embryonnaires, où la progression développementale est caractérisée par des changements discrets dans la synthèse d&#39;ARN cellulaire.

<table><tbody><tr><td>1 x tampon PBS-/-</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 x tampon de liaison de l'annexine V</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>Annexine V-Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>1 mg/mL dans H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Formaldéhyde à 2 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1268</td><td></td></tr><tr><td>ARNase A provenant du pancréas de bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50050</td><td>Diluer au 1:60 dans du PBS-/- 1 x</td></tr></tbody></table>

mise à jour annexine v / propidium assay apoptose iodure permettant une évaluation précise de la mort cellulaire

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Les études de l&#39;apoptose cellulaire ont été significativement impacté depuis l&#39;introduction de la cytométrie de flux basé sur des méthodes. L&#39;iodure de propidium (PI) est largement utilisé en conjonction avec l&#39;annexine V afin de déterminer si les cellules sont viables, apoptose, ou nécrotiques par des différences dans l&#39;intégrité de la membrane plasmique et 1,2 perméabilité. L&#39;annexine V / PI protocole est une méthode couramment utilisée pour étudier les cellules apoptotiques 3. PI est utilisé plus souvent que d&#39;autres colorants nucléaires, car il est économique, stable et un bon indicateur de la viabilité cellulaire, basée sur sa capacité à exclure les colorants dans les cellules vivantes 4,5. La capacité de la PI pour entrer dans une cellule dépend de la perméabilité de la membrane; PI ne tache pas vivre ou début cellules apoptotiques en raison de la présence d&#39;une membrane plasmique intacte 1,2,6. À la fin de cellules apoptotiques et nécrotiques, l&#39;intégrité du plasma et les membranes nucléaires diminue 7,8, permettant PI à traverser les membranes, s&#39;intercaler dans les acides nucléiques, et afficher une fluorescence rouge 1,2,9. Malheureusement, nous constatons que conventionnelles annexine V / PI protocoles conduire à un nombre important de faux événements positifs (jusqu&#39;à 40%), qui sont associés à coloration PI de l&#39;ARN dans le compartiment cytoplasmique 10. Les cellules primaires et des lignées cellulaires dans un large éventail de modèles animaux sont touchés, avec de grandes cellules (nucléaire: les ratios cytoplasmique &lt;0,5) montrant la plus haute fréquence 10. Ici, nous démontrons une modification annexine V / PI méthode qui apporte une amélioration significative pour l&#39;évaluation de la mort cellulaire par rapport aux méthodes conventionnelles. Ce protocole prend avantage de modifications de la perméabilité cellulaire au cours de la cellule de fixation à promouvoir l&#39;entrée de la RNase A dans les cellules après coloration. Tant le moment et la concentration de la RNase A ont été optimisés pour l&#39;enlèvement de l&#39;ARN cytoplasmique. Le résultat est une amélioration significative par rapport conventionnels annexine V / PI protocoles (&lt;5% des événements avec coloration PI cytoplasmique).

Une méthode précise pour l&#39;évaluation de la mort cellulaire est décrite. Le protocole améliore conventionnels annexine V / iodure de propidium (PI) des protocoles, qui affichent jusqu&#39;à 40% de faux positifs des événements dans des lignées cellulaires et cellules primaires à partir d&#39;un large éventail de modèles animaux.

Mise à jour annexine V / propidium Assay apoptose iodure permettant une évaluation précise de la mort cellulaire

Les études sur l'apoptose cellulaire ont été considérablement influencées depuis l'introduction des méthodes basées sur la cytométrie en flux. L'iodure de propidium (PI) est largement...

L'objectif général de l'expérience est de surmonter les problèmes actuels liés aux techniques conventionnelles de coloration par l'Annexine cinq et l'iodure de propidium pour l'évaluation de la mort cellulaire par apoptose et/ou nécrose. Nous avons constaté que les approches conventionnelles de coloration appliquées à un large éventail de lignées cellulaires et de cellules primaires entraînent jusqu'à 40 % d'événements faux positifs. Ces événements faux positifs sont dus à la coloration de l'ARN cytoplasmique.En revanche, notre protocole réduit considérablement le nombre de faux positifs en introduisant des étapes de fixation et de dégradation de l'ARN à des stades spécifiques du protocole de coloration. Tout d'abord, les cellules sont colorées avec un X dans du iodure de propidium pour détecter la mort cellulaire selon les procédures classiques. Ensuite, les cellules sont fixées avec du formaldéhyde à 1 %, ce qui augmente la perméabilité de la membrane plasmique. Enfin, les cellules fixées sont traitées avec de la RNase A afin de dégrader l'ARN cytoplasmique, éliminant ainsi la coloration par le iodure de propidium responsable des faux positifs.Comme de nombreux biologistes cellulaires, nous avons utilisé les méthodes classiques de cytométrie en flux par la néxine V et l'iodure de propidium pour détecter la mort cellulaire apoptotique et nécrotique. Malheureusement, nous avons récemment constaté que cette méthode entraîne un nombre important d'événements faux positifs, allant jusqu'à 40 %, dans une variété de lignées cellulaires et de cellules primaires. Cette méthode mise à jour permet de surmonter ces inconvénients.Notre approche exploite la fixation des cellules et la digestion de l'ARN à des étapes spécifiques du protocole afin d'éliminer sélectivement l'ARN cytoplasmique, dont la détection conduit directement à ces événements faussement positifs. Récupérez les cellules à analyser pour l'expérience. Dans cette vidéo, nous utilisons des macrophages bruts comme exemple. Centrifugez les échantillons à 335 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, décantez le surnageant et resuspendez les cellules dans deux millilitres de PBS 1X.Ensuite, lavez à nouveau les cellules dans les mêmes conditions. Cette fois, resuspendez les cellules dans un millilitre de tampon de liaison 1 X NX et cinq. Après avoir centrifugé les échantillons et décanté le surnageant, resuspendez les cellules dans un volume final de 100 microlitres de tampon de liaison 1 X NX Xin cinq.Ajouter un Xin cinq à chaque échantillon cellulaire selon les recommandations du fabricant. Par exemple, dans cette vidéo, 2,5 µL d'un Xin cinq zi sont ajoutés à chaque tube rond en polystyrène. Incuber les tubes à l'abri de la lumière pendant 15 minutes à température ambiante.Ensuite, ajouter 100 microlitres d’un X NX dans cinq tampons de liaison à chaque tube de réaction. Chaque tube doit maintenant contenir environ 200 microlitres de solution. Préparer ensuite une dilution au 1/10 de l’iodure de propidium, ou PI, dans un X NX. Dans cinq tampons de liaison, ajouter quatre microlitres de PI dilué à chaque tube, afin d’obtenir une concentration finale de deux microgrammes par millilitre de PI dans chaque échantillon.Incuber les tubes à l'obscurité pendant 15 minutes à température ambiante. Après cette période d'incubation, laver les cellules avec 500 microlitres de tampon de liaison 1 x et x et 5, puis centrifuger les échantillons à 335 G pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius et décanté le surnageant. Résuspendre les cellules dans 500 microlitres supplémentaires de tampon de liaison 1 X NX et 5 contenant 500 microlitres de formaldéhyde à 2 %.Pour préparer une solution de formaldéhyde à 1 %, mélanger les tubes par de légers coups. Fixer les échantillons sur de la glace pendant 10 minutes après la fixation. Ajouter un millilitre de PBS 1X à chaque échantillon et mélanger délicatement en agitant, puis centrifuger les cellules à 425 G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius, et répéter cette opération de lavage trois fois.Préparez une dilution de un à cent de l'ARN A dans du PBS 1X, resuspendez le culot en tapotant les tubes et ajoutez 16 microlitres de la solution d'ARN A diluée pour obtenir une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre. Incubez ensuite les échantillons pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules avec un millilitre de PBS 1X et mélangez délicatement en tapotant, puis centrifugez les tubes à 425 ×g pendant huit minutes à quatre degrés Celsius.Les échantillons sont désormais prêts à être analysés. Alternativement, les échantillons peuvent être utilisés pour des étapes de coloration ultérieures si la coloration N-X-M-P-I est réalisée en parallèle avec d'autres procédures. Des images représentatives provenant d'un cytomètre en flux à lecture d'images montrent l'ampleur des colorations faussement positives dans trois populations cellulaires distinctes.Une lignée cellulaire couramment utilisée est celle des macrophages bruts, ainsi que deux lignées cellulaires primaires modélisant respectivement les macrophages de la moelle osseuse et les macrophages primaires du rein du poisson rouge. L'utilisation de macrophages primaires de poisson rouge illustre l'applicabilité de cette technique sur diverses plates-formes cellulaires. Les événements vrais positifs montrent une colocalisation attendue au niveau du compartiment nucléaire entre l'iodure de propidium (PI) et le drac.Cinq, un colorant hautement perméable aux membranes, colore avec précision le compartiment nucléaire des cellules vivantes et mortes, comme en témoigne la coloration jaune. Ici, la précision de la coloration nucléaire par l'iodure de propidium (PI) a été évaluée en fonction de son degré de similitude avec D dr cinq BRDU sept A.A D DPI, et DRAC cinq a présenté une similitude supérieure à 99 % dans leur capacité à colorer précisément le noyau dans la lignée cellulaire macrophagique RAW 264.7. En revanche, la coloration cytoplasmique par le PI observée lors de l'utilisation de protocoles conventionnels a entraîné une diminution marquée du pourcentage de similitude de la coloration nucléaire par rapport à d dr cinq.Dans cette figure, on peut observer que l'incorporation de 50 microgrammes par millilitre d'ARN A élimine la coloration au PI non nucléaire et augmente significativement le degré de similitude par rapport à la coloration d dr cinq dans les cellules de macrophages de moelle osseuse murins, de macrophages primaires de rein de poisson rouge. Les images représentatives de macrophages primaires de rein dans cette figure montrent la perte de la coloration des ARN dans le compartiment cytoplasmique après traitement aux ARN A. Ces diagrammes de dispersion de macrophages primaires de rein de poisson rouge montrent une réduction significative des événements faux apoptotiques ou nécrotiques dans les cellules préparées selon le protocole modifié de nexine PI.Le nouveau protocole montre que 84,9 % des cellules sont viables. Les fenêtres ont été définies à partir d'échantillons parallèles de flux d'images évaluant les caractéristiques fluorescentes et morphologiques. Dans un exemple, les monocytes progéniteurs précoces et les macrophages matures ont été marqués par le NX modifié selon le protocole PI cinq décrit dans cette vidéo, ou par la méthode conventionnelle ; pour cette figure, les cellules marquées par le protocole modifié ont présenté une réduction visuelle du nombre d'événements PI positifs en raison de l'élimination des événements faux positifs par le traitement aux ARNs.En outre, cet effet était plus prononcé dans les grandes cellules macrophagiques matures que dans les cellules progénitrices plus petites et précoces. Des conclusions basées sur des protocoles conventionnels auraient suggéré à tort une corrélation positive entre la mort cellulaire et les sous-ensembles de macrophages plus matures. Après cette procédure de coloration, des étapes supplémentaires telles que des marquages intracellulaires ou membranaires peuvent être réalisées afin de répondre à des questions spécifiques concernant les sous-populations présentes dans votre isolat cellulaire. L'importance de cette technique va au-delà des questions liées à l'immunité ; elle est par exemple également pertinente pour les systèmes expérimentaux utilisant des cellules subissant un stress génotoxique, des cellules traitées par un arrêt du cycle cellulaire, des médicaments tels que la thymidine ou l'hydroxyurée, ainsi que pour les études sur les cellules embryonnaires, dans lesquelles la progression du développement est caractérisée par des changements discrets de la synthèse de l'ARN cellulaire.

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Les effets de l'activation de la protéine kinase C (PKC) isozymes de la fonction mitochondriale associés à la respiration et la phosphorylation oxydative et sur la viabilité cellulaire sont décrites. L'approche technique s'adapte adénoviral de façon sélective surexprimer isoenzymes de PKC dans une culture cellulaire primaire et une variété de tests pour déterminer les fonctions mitochondriales et l'état énergétique de la cellule.

Évaluation des fonctions mitochondriales et la viabilité cellulaire dans les cellules rénales surexprimant la protéine kinase C Isozymes

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration du test de liaison à l’Annexine V pour mesurer le degré d’éryptose, la mort cellulaire programmée par l’érythrocyte, à l’aide de la coloration fluorescente à l’Annexine V. Les érythrocytes apoptotiques présentent une translocation de la phosphatidylsérine de la feuille interne à la foliole externe de la membrane cellulaire, provoquant la liaison de l’annexine V marquée au fluorophore à la phosphatidylsérine transloquée, émettant ainsi un signal...

Dosage de la liaison à l’annexine V : une technique basée sur la fluorescence pour identifier les érythrocytes apoptotiques via le marquage à la phosphatidylsérine

Les composés thérapeutiques sont souvent d'abord examiné in vitro par des tests de viabilité. Le nombre de cellules aveugles par un observateur humain peuvent être très sensibles à de faibles variations du nombre de cellules mais ne pas évaluer la fonction. Essais de viabilité informatiques, tel que décrit ici, peuvent évaluer à la fois la structure et la fonction d'une manière objective.

Les analyses de viabilité de cellules en culture

Les essais multiplex peuvent fournir des informations utiles pour les mécanismes cellulaires de base et d'éliminer les déchets de réactifs et d'expériences répétitives inutiles. Nous décrivons ici une caspase-3/7 dosage de l'activité de multiplexage, en utilisant des procédés fluorescents, luminescents et située, pour déterminer la viabilité cellulaire dans un modèle in vitro de l'hypothalamus après provocation par oxydation avec de l'acide palmitique.

Utilisation d&#39;un multiplexage Caspase test destiné à déterminer l&#39;apoptose dans une cellule du modèle hypothalamique

Le terme anastase fait référence au phénomène dans lequel les cellules mourantes inversent un processus de suicide cellulaire à un stade avancé, se réparent elles-mêmes et finissent par survivre. Nous démontrons ici des protocoles de détection et de suivi des cellules qui subissent une anastase.

Stratégies pour le suivi Anastasis, une cellule de survie Phénomène qui renverse apoptose

Un flux de travail par écoulement cytometry ou prime de centrifugation est conçu pour détecter, quantifier et isoler les corps apoptotiques d’un échantillon d’apoptotic à haute pureté.

Détection et isolement des corps apoptotiques de haute pureté

Le protocole décrit un essai rapide, à haut débit, fiable, peu coûteux et impartial pour déterminer efficacement la viabilité cellulaire. Cet essai est particulièrement utile lorsque les mitochondries des cellules ont été endommagées, ce qui interfère avec d’autres analyses. L’essai utilise le comptage automatisé des cellules tachées de deux teintures nucléaires – Hoechst 33342 et iodure de propidium.

Un essai automatisé de coloration nucléaire différentielle pour la détermination précise de la cytotoxicité mitocan

L’apoptose peut être caractérisée par l’analyse cytométrique en flux de biomarqueurs apoptotiques précoces et tardifs. La lignée cellulaire du cancer du col de l’utérus, SiHa, a été analysée pour les biomarqueurs de l’apoptose après un traitement avec l’actinomycine D à l’aide d’un cytomètre de flux de paillasse.

Analyse cytométrique en flux de biomarqueurs apoptotiques dans les cellules cancéreuses SiHa traitées à l’actinomycine D

Ce protocole est basé sur la mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA. Nous utilisons la cytométrie en flux pour analyser l’annexine V et la double coloration 7-AAD pour détecter la mort cellulaire, en utilisant la cellule entière et en utilisant la microscopie électronique à balayage pour observer la morphologie de la membrane cellulaire.

Mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA et sa validation

Pyroséquençage (R) est l'une des méthodes les plus approfondies, mais simple à ce jour utilisé pour analyser les polymorphismes. Cette méthode a conduit à l'évaluation du polymorphisme rapide et efficace d'un seul nucléotide, y compris de nombreux polymorphismes cliniquement pertinents. La technique et la méthodologie de Pyroséquençage est expliqué.

Pyroséquençage: une méthode simple pour le génotypage précis

Découvrez un protocole amélioré d'annexine V/iodure de propidium pour évaluer précisément la mort cellulaire par apoptose et nécrose. Cette méthode réduit les faux positifs jusqu'à 40% grâce à la fixation et la dégradation de l'ARN.

Mise à jour annexine V / propidium Assay apoptose iodure permettant une évaluation précise de la mort cellulaire

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