Mise à jour annexine V / propidium Assay apoptose iodure permettant une évaluation précise de la mort cellulaire

L’objectif global de l’expérience est de surmonter les problèmes actuels liés aux techniques conventionnelles de coloration à l’annexine cinq et à l’iodure de propidium pour l’évaluation de la mort cellulaire par apoptose et/ou nécrose. Nous avons constaté que les approches conventionnelles de coloration d’un large éventail de lignées cellulaires et de cellules primaires entraînent jusqu’à 40 % d’événements faussement positifs. Ces événements faussement positifs sont dus à la coloration de l’ARN cytoplasmique.

À l’inverse, notre protocole réduit considérablement le nombre d’incidences de faux positifs en introduisant des étapes de fixation et de dégradation de l’ARN à des étapes spécifiques Dans la procédure de coloration, les premières cellules sont colorées avec un X sur cinq et de l’iodure de péridium pour détecter la mort cellulaire selon les procédures conventionnelles. Ensuite, les cellules sont fixées avec 1 % de formaldéhyde, ce qui augmente la perméabilité de la membrane plasmique. Enfin, les cellules fixées sont traitées avec des ARN A afin de dégrader l’ARN cytoplasmique, éliminant ainsi les faux positifs provoquant une coloration à l’iodure de propidium.

Comme de nombreux biologistes cellulaires, nous avons utilisé les méthodes conventionnelles de cytométrie en flux nexin five et d’iodure de propidium pour détecter la mort cellulaire apoptotique et nécrotique. Malheureusement, nous avons récemment constaté que cette méthode conduit à un nombre important d’événements faussement positifs allant jusqu’à 40 % dans une gamme de lignées cellulaires et de cellules primaires. Cette méthode mise à jour permet de surmonter ces mises en garde.

Notre approche tire parti de la fixation cellulaire et de la digestion de l’ARN dans des étapes spécifiques tout au long de la procédure pour éliminer sélectivement l’ARN plasmique cyop, la coloration qui conduit directement à ces événements faussement positifs, Récoltez les cellules à analyser pour l’expérience. Dans cette vidéo, nous utilisons des macrophages bruts. À titre d’exemple, centrifugez les échantillons à 335 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, décantez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans deux millilitres d’un XPBS.

Ensuite, lavez à nouveau les cellules dans les mêmes conditions. Cette fois, il s’agit de suspendre les cellules dans un millilitre d’un X NX et de cinq tampons de liaison. Après la centrifugation des échantillons et la décantation du surnageant, remettez à nouveau les cellules en suspension dans un volume final de 100 microlitres du tampon de liaison One X NX Xin five.

Ajoutez un Xin cinq à chaque échantillon de cellule selon les recommandations du fabricant. Par exemple, dans cette vidéo, 2,5 microlitres d’un Xin five zi sont ajoutés à chaque tube à fond rond en polystyrène. Incuber les tubes dans l’obscurité pendant 15 minutes à température ambiante.

Ajoutez ensuite 100 microlitres d’un X NX dans cinq tampons de liaison dans chaque tube de réaction. Il devrait maintenant y avoir environ 200 microlitres de solution dans chaque tube. Ensuite, préparez une dilution de 1 à 10 de propidium, d’iodure ou de PI dans un tampon de liaison X NX.In cinq, ajoutez quatre microlitres de PI dilué dans chaque tube, ce qui donne une concentration finale de deux microgrammes par millilitre pi dans chaque échantillon.

Incuber à nouveau les tubes dans l’obscurité pendant 15 minutes à température ambiante. Après cette période d’incubation, laver les cellules avec 500 microlitres d’un x et d’un x et de cinq tampons de liaison et centrifuger les échantillons à 335 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et décanter le nat. Mettez à nouveau les cellules en suspension dans 500 microlitres supplémentaires d’un X NX et cinq tampons de liaison avec 500 microlitres de formaldéhyde à 2 %.

Pour créer une solution de formaldéhyde à 1 %, mélangez les tubes en effleurant doucement. Fixez les échantillons sur de la glace pendant 10 minutes après la fixation. Ajoutez un millilitre d’un XPBS à chaque échantillon et mélangez doucement en agitant la centrifugeuse sur les cellules à 425 G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius trois fois pendant le lavage.

Préparez une dilution de un à 100 de l’ARN A dans un XPBS, remettez la pastille en suspension en agitant les tubes et ajoutez 16 microlitres d’ARN dilués, une solution pour donner une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre. Ensuite, incubez les échantillons pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules dans un millilitre d’un XPBS et mélangez doucement en effleurant, puis centrifugez les tubes à 425 GS pendant huit minutes à quatre degrés Celsius.

Les échantillons sont maintenant prêts à être analysés. Alternativement, les échantillons peuvent être utilisés pour les étapes de coloration ultérieures si la coloration N-X-M-P-I est effectuée en parallèle avec d’autres procédures. Les images représentatives du cytomètre de flux de flux montrent l’étendue de la coloration faussement positive dans trois populations cellulaires uniques.

Une lignée cellulaire couramment utilisée : macrophages bruts et deux lignées cellulaires primaires reflétant les macrophages de la moelle osseuse et les macrophages primaires du rein du poisson rouge. L’utilisation de macrophages primaires de poissons rouges met en évidence l’applicabilité de cette technique sur une variété de plateformes cellulaires. Les événements positifs réels montrent la colocalisation attendue dans le compartiment nucléaire entre PI et drac.

Cinquièmement, un colorant hautement perméable à la membrane qui colore avec précision le compartiment nucléaire des cellules vivantes et mortes, comme en témoigne la coloration jaune. Ici, la précision de la coloration nucléaire de l’IP a été évaluée en fonction de son degré de similitude avec D dr cinq, BRDU sept A.A, D D, D, et DRAC cinq ont montré une similitude supérieure à 99 % dans leur capacité à colorer avec précision le noyau dans la lignée cellulaire macrophage brute 2 64 0,7. En revanche, la coloration cytoplasmique de l’IP qui se produit lors de l’utilisation de protocoles conventionnels a conduit à une diminution marquée du pourcentage de similitude de la coloration nucléaire par rapport à d d cinq.

Dans cette figure, on peut voir que l’incorporation de 50 microgrammes par millilitre d’ARN A élimine la coloration PI non nucléaire et augmente considérablement le degré de similitude par rapport à la coloration d dr cinq dans les cellules de macrophages primaires, de murn, de moelle osseuse et de rein de poisson rouge. Des images représentatives de macrophages rénaux primaires dans cette figure montrent la perte de coloration de l’ARN dans le compartiment cytoplasmique avec le traitement de l’ARN a. Ces diagrammes de dispersion des macrophages rénaux primaires de poissons rouges montrent une réduction significative des événements nécrotiques faussement apoptotiques dans les cellules préparées avec le protocole NI modifié de nexin.

Le nouveau protocole montre que 84,9 % des cellules sont viables. Les portes ont été dessinées sur la base d’échantillons de flux d’images parallèles qui évaluent les caractéristiques fluorescentes et morphologiques. Dans un exemple, les monocytes progéniteurs précoces et les macrophages matures ont été colorés par le protocole modifié NX en cinq PI décrit dans cette vidéo, ou par la méthode conventionnelle pour cette figure de cellule colorée par le protocole modifié a montré une réduction visuelle du nombre d’événements IP positifs en raison de l’élimination des événements faussement positifs par le traitement par ARN.

De plus, cet effet était plus prononcé dans les grandes cellules macrophages matures que dans les cellules progénitrices précoces plus petites. Des conclusions basées sur des protocoles conventionnels auraient suggéré à tort une corrélation positive dans la mort cellulaire pour les sous-ensembles de macrophages plus matures. Après cette procédure de coloration, d’autres étapes telles que la coloration intracellulaire ou de surface peuvent être effectuées pour répondre à des questions spécifiques sur les sous-populations au sein de votre isolat cellulaire. La pertinence de cette technique va au-delà des questions basées sur l’immunité, par exemple, elle est également pertinente pour les systèmes expérimentaux qui utilisent des cellules subissant un stress génotoxique, des cellules traitées par arrêt du cycle cellulaire, des médicaments tels que la thymidine ou l’hydroxyurée, et des études sur des cellules embryonnaires où la progression du développement est caractérisée par des changements discrets dans la synthèse de l’ARN cellulaire.