Name: Imagerie par bioluminescence pour lévaluation des réponses immunitaires après limplantation du tissu cardiaque dingénierie (ISE) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Découvrez l'imagerie par bioluminescence pour évaluer les réponses immunitaires après implantation de tissu cardiaque d'ingénierie chez le rat. Cette méthode permet un suivi longitudinal non invasif de la survie du greffon.

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Sonja Schrepfer, Lenard Conradi et Arne Hansen a reçu un financement de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1, CO 858/1-1, HA 3423/3-1). Le travail a également été soutenue par des subventions de l&#39;Union européenne à Thomas Eschenhagen (EUGeneHeart et Angioscaff).

1. Génération d'ISE et de la Culture Conditions Fabrication de base de fibrine ISE a été réalisée comme décrit par ailleurs 4. En bref, pour produire à base de fibrine ISE à des fins d'implantation, un mélange maître a été préparée contenant des cellules isolées à partir néonatale ROSA / luciférase-LEW coeurs de rats transgéniques, le fibrinogène bovin et Matrigel. Agarose moules ont été préparés en utilisant des entretoises en téflon placés dans des boîtes de culture de 6 puits. Après solidification de l'agarose, entretoises ont été enlevés et racks message de silicone ont été placés sur des boîtes de culture avec des messages d'atteindre dans les moules. Pour générer l'ISE, le Mastermix a été brièvement mélangé à un montant calculé de la thrombine et à la pipette dans le moule. Après polymérisation du fibrinogène, des supports en silicone avec HASTI adhérant à des postes ont été délicatement retirée de la coulée des moules d'agarose, transférés à de nouveaux 6-même boîtes de culture cellulaire et maintenu dans un 37 ° C, 7% de CO 2 incubateur de culture cellulaire à l'aide sur-mesure milieu de culture cellulaire. ISE ont été conservés dans des conditions de culture cellulaire jusqu'à dix jours. Pendant ce laps de temps, les cellules de coeur de rat néonatal a commencé à allongée, d'interconnexion et d'aligner le long des lignes de force entre les deux poteaux de silicone. Au moment de l'implantation, les contractions spontanées cohérentes ont été observées, en déviant les messages de silicone. 2. Implantation d'ISE L'implantation d'ISE a été réalisée en soit immunocompétent brun de Norvège (BN), les rats, ou immunodéficientes rats nus pour étudier la réponse allogénique immunitaire. Rats BN et nue pesant 100 - 150 g ont été achetés auprès de Charles River Allemagne (Sandhofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld) et logés dans des conditions classiques, nourris standards pour rats et libidum ad eau. Rats immunodéprimés sont logés dans la literie stérile, les cages, et de l'eau stérilisée est utilisée. Le comité d'examen éthique allemande examiné et approuvé les procédures animales. Tous les instruments chirurgicaux sont stérilisés avant leur utilisation. La procédure d'implantation sont effectués comme suit: Rat sont anesthésiés à l'isoflurane (2,5-3%) en utilisant une chambre d'induction. L'exposition humaine à l'isoflurane peut être réduit en travaillant dans une table aspirante ou non-recirculation capot. La température corporelle est maintenue pendant l'intervention chirurgicale. <ol><li> Rasez la zone abdominale et d'appliquer une pommade oculaire pour éviter les yeux de sécher pendant l'anesthésie. </li><li> Placez le rat sur son dos et placer un masque sur sa bouche et le nez pour maintenir l'anesthésie. </li><li> Désinfectez la zone abdominale à l'aide Bétadine puis 80% d'éthanol. Swab de nettoyage de salir, de centre de la zone rasée déplaçant vers l'extérieur vers la zone de cheveux. </li><li> Vérifiez réflexes pinçant les pattes postérieures pour être sûr que le rat est suffisamment anesthésiés. </li><li> Drapé de l'animal et d'effectuer une incision abdominale médiane séparant la peau et de muscle en deux étapes pour ouvrir le ventre. La stérilisation à chaud billes est utilisé entre la peau et l'ouverture du muscle. </li><li> Placez les intestins dans un gant de poudre de sérum physiologique réchauffé hydratée libre. Pliez le gant autour de l'intestin pour empêcher la perte d'humidité. </li><li> Enlever les tissus adipeux et exposer la rate. </li><li> Visualisez et la propagation grand omentum avec une pince. </li><li> Découpez soigneusement l'ISE de suspendre les messages de silicone et de transfert sur le grand épiploon. </li><li> Enveloppez la plus grande autour de la omentus ISE et de fixer l'aide de deux simples sutures 7-0 Prolène (Ethicon, Norderstedt, Allemagne) </li><li> Suivant déplacer les intestins dans l'abdomen. </li><li> Rincer l'abdomen avec une solution saline stérile préchauffée. </li><li> Fermez la couche musculaire de la paroi abdominale en utilisant 6-0 prolène sutures course (Ethicon, Norderstedt, Allemagne). </li><li> Utilisez 5-0 Prolène (Ethicon, Norderstedt) fonctionnant sutures pour refermer la peau. </li><li> Alors que le rat est encore en anesthésie, injecter 5 mg / kg carprofène sous-cutanée. </li><li> Pour fournir une analgésie suffisante pour ce type de procédure, un analgésique (comme Metamizol) est ajouté à l'eau potable (50 mg par 100 ml Metamizol) pour des analgésiques pour 3 jours après la transplantation. </li></ol> 3. Imagerie par bioluminescence de suite à l'implantation d'ISE La plate-forme bio-imagerie IVIS (Xenogen, Alameda, CA, USA) est utilisé pour l'imagerie par bioluminescence non-invasif in vivo et les résultats sont analysés en utilisant l'image vivante IVIS (Xenogen) logiciel. L'imagerie est effectuée quotidiennement à partir de 2 heures après l'opération. Anesthetize rat avec l'isoflurane (2,5 - 3%) en utilisant une chambre d'induction. <ol><li> Désinfectez la zone abdominale et thoracique en utilisant largement Provo-iode, la prochaine utilisation d'éthanol à 80%, répétez cette étape trois fois. </li><li> Injecter D-luciférine (Xenogen; 375 mg / kg) ip </li><li> Placez rats anesthésiés dans la chambre d'imagerie IVIS (jusqu'à 4 rats peuvent être analysés en même temps). </li><li> Évaluer l'intensité du signal de luc + cellules à l'intérieur d'ISE dans les unités de photons / sec / cm 2 / steridianin la région d'intérêt (ROI) au départ (120 minutes après l'implantation) et aux jours 1, 2, 3, 5, 7, 10, et aux semaines 2, 3 et 4. Notez le signal de crête (apparaît environ 20 minutes après l'injection D-luciférine). </li></ol> Créer un graphique (Excel) montrant l'intensité du signal dans le temps. 4. Corrélation des résultats BLI et ELISPOT Le cellulaire in vivo des réponses immunitaires chez BN immunocompétents et immunodéprimés rats nus ont été étudiés après la transplantation d'ISE. La rate des animaux receveurs a été récolté 5 jours après la transplantation d'ISE pour isoler splénocytes destinataire. Tests ELISPOT en utilisant la mitomycine-inhibée HASTI (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) comme stimulateur et 5 splénocytes x10 bénéficiaires 6 comme cellules répondeuses ont été effectués selon le protocole du fabricant (BD Biosciences) en utilisant l'IFN-γ et IL-4 revêtement plaques d'enquêter TH1, TH2 et la réponse, respectivement. IFN-γ et IL-4 spots ont été significativement plus élevé dans le immunocompétents, le modèle par rapport au modèle immunodéficientes (IFN-γ: p = 0,001; IL-4: p = 0,023; t de Student-test). 5. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2605/2605fig1.jpg" alt="Figure 1"> Figure 1. Corrélation des résultats BLI et ELISPOT a) Le cellulaire in vivo des réponses immunitaires chez immunocompétents Brown Norvège et immunodéficientes rats nus ont été étudiés après l'implantation d'ISE. Récipiendaire splénocytes ont été récoltés 5 jours après l'implantation d'ISE. IFN? et IL-4 d'expression a été évaluée par tests ELISPOT en utilisant la mitomycine-inhibée ISE comme stimulateurs et 5x106 splénocytes destinataire comme cellules répondeuses. Th1 et Th2 étaient significativement plus élevés dans le modèle immunocompétentes par rapport au modèle immunodéficientes comme en témoigne IFNy et IL-4, respectivement. b) Luc HASTI + ont été transplantées dans plus de la omentus des rats BN soit immunocompétents ou immunodéprimés rats nus. La survie des cellules a été suivie par BLI longitudinalement. Le taux d'animaux qui a rejeté l'HASTI transplanté est présenté. Tous les rats BN rapidement rejeté les greffes de l'ISE, alors que les cellules ont survécu dans des rats de cellules T déficientes.

<ol><li>Eschenhagen, T., Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+myocardial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering myocardial tissue.</a> Circ Res. 97, 1220-1231 (2005).</li>
<li>van der Bogt, K. E., Schrepfer, S., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transplantation+of+adipose+tissue-+and+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+the+infarcted+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of transplantation of adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the infarcted heart.</a> Transplantation. 87, 642-652 (2009).</li>
<li>Hakamata, Y., Murakami, T., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Firefly+rats%22+as+an+organ%2Fcellular+source+for+long-term+in+vivo+bioluminescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">"Firefly rats" as an organ/cellular source for long-term in vivo bioluminescent imaging.</a> Transplantation. 81, 1179-1184 (2006).</li>
<li>Hansen, A., Eder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drug+Screening+Platform+Based+on+Engineered+Heart+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a Drug Screening Platform Based on Engineered Heart Tissue.</a> Circ Res. , (2010).</li>
</ol>

Avant la mise en œuvre clinique de la technologie d&#39;ISE pour la réparation cardiaque, des questions fondamentales telles que l&#39;immunogénicité de deux composants cellulaires et de la matrice ou de la survie du greffon après l&#39;implantation doivent être évalués dans des modèles expérimentaux. Imagerie par bioluminescence in vivo représente une nouvelle technique utile pour la survie des cellules de suivi après la transplantation . Nous avons réussi à généré à base de fibrine ISE contenant la luciférase...

<ul><li> LEW-Tg (Gt (ROSA) 26Sor-Luc) 11Jmsk rat (Rat Nombre NBPR 0299, http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/) </li><li> Fibrinogène bovin (solution stock: 200 mg / ml, plus aprotinine 5 ug / ml dans le fibrinogène NaCl 0,9%, Sigma F4753) </li><li> Matrigel (BD Bioscience 356235) </li><li> DMEM (Biochrome F0415) </li><li> Sérum de cheval (Gibco 26050) </li><li> Pénicilline / streptomycine (Gibco 15140) </li><li> L&#39;insuline (Sigma-Aldrich I9278) </li><li> L&#39;aprotinine (Sigma Aldrich A1153) </li><li> D-luciférine (Biosynth L-8220) </li><li> Immuno-enzymatique plaques spot test (ELISpot) (Hassa Laborbedarf, S2EM004M99) </li></ul>

imagerie par bioluminescence pour l&#39;évaluation des réponses immunitaires après l&#39;implantation du tissu cardiaque d&#39;ingénierie (ise)

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Diverses techniques d&#39;ingénierie tissulaire cardiaque ont été poursuivis dans les dernières décennies, y compris les stratégies d&#39;échafaudage en utilisant soit natif ou bioartificiel matériaux d&#39;échafaudage, piégeage des myocytes cardiaques dans les hydrogels tels que la fibrine ou de collagène et l&#39;empilement des monocouches myocytes 1. Ces concepts visent à la restauration de la fonction cardiaque compromise (par exemple après un infarctus du myocarde) ou comme modèles expérimentaux (par exemple, la toxicologie prédictive et le dépistage de substances ou de modélisation de la maladie). Un suivi précis de la survie des cellules après l&#39;implantation du tissu cardiaque d&#39;ingénierie (ISE) est désormais possible en utilisant la bioluminescence in vivo d&#39;imagerie (BLI) des techniques 2. Nous décrivons ici la génération de base de fibrine ISE partir d&#39;une souche de rats transgéniques avec expression ubiquitaire de la luciférase de luciole (ROSA / luciférase-LEW Tg; 3). L&#39;implantation est réalisée dans le grand omentum des différentes souches de rats afin d&#39;évaluer la réponse immunitaire de l&#39;organisme receveur après l&#39;implantation d&#39;ISE. Comparaison des résultats générés par BLI et l&#39;enzyme liée Technique spot Immuno (ELISPOT) confirment l&#39;utilité de BLI pour l&#39;évaluation des réponses immunitaires.

Cette vidéo montre l&#39;utilisation de<em&gt; In vivo</emL&#39;imagerie par bioluminescence&gt; pour étudier les réponses immunitaires après l&#39;implantation du tissu cardiaque d&#39;ingénierie (ISE) chez le rat.

Imagerie par bioluminescence pour l&#39;évaluation des réponses immunitaires après l&#39;implantation du tissu cardiaque d&#39;ingénierie (ISE)

Diverses techniques d'ingénierie tissulaire cardiaque ont été explorées au cours des dernières décennies, notamment des stratégies d'échafaudage utilisant soit des supports natifs, soit...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser l'imagerie bioluminescente in vivo pour étudier les réponses immunitaires après l'implantation de tissu cardiaque génétiquement modifié, ou EHT, chez des rats. Cela est réalisé en premier lieu en générant des EHS positifs pour la luciférase. Ensuite, les EHS exprimant de manière stable la luciférase sont transplantés dans l'omentum majeur de rats receveurs.Ensuite, une imagerie bioluminescente in vivo peut être réalisée sur les animaux receveurs afin de surveiller de manière non invasive la survie et le rejet de l'EHT au fil du temps. À l’aide de ce modèle, l’intensité et la cinétique du rejet aigu, par exemple, peuvent être corrélées à la diminution de l’intensité du signal bioluminescent observé au cours du temps. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l’histologie, réside dans le fait que des mesures quotidiennes permettent une évaluation non invasive et longitudinale de la survie de la greffe.Cette méthode peut fournir des informations sur la survie et le rejet de tissus cardiaques ingénierisés, mais elle peut également être appliquée à d'autres questions. Par exemple, le métabolisme de ehs. La technique bili sera démontrée par Christiana Parman, qui pratique cette technique quotidiennement.Dans mon laboratoire, des cellules cardiaques transgéniques sont d'abord isolées de rats néonatals luciférase Lu afin de générer un DHT à base de fibrine destiné à des fins d'implantation, préparer un mélange maître contenant des cellules isolées de cœurs de rats transgéniques luciférase Lu néonatals, du fibrinogène bovin et du Matrigel dans du X-D-M-E-M et du NKM. Préparer des moules de coulée en aros en ajoutant neuf millilitres d'aros 2 % dans du PBS dans chaque puits de plaques de culture à six puits, puis en plaçant des entretoises en téflon dans les puits. Une fois l'aros solidifié, retirer les entretoises et positionner des supports en silicone munis de plots sur les plaques de culture, les plots pénétrant dans les moules.Pour générer les EHT, mélanger délicatement le mélange maître, puis ajouter une quantité calculée de thrombine dans le mélange maître et mélanger brièvement. Ensuite, pipeter rapidement 1100 microlitres de mélange maître dans chaque moule. Après la polymérisation du fibrinogène, retirer délicatement les supports munis des poteaux auxquels adhèrent désormais les EHT des moules de coulée en agarose et transférer les supports vers de nouvelles plaques de culture cellulaire à six puits contenant huit millilitres de milieu personnalisé par puits.Les EHT sont maintenues pendant 10 jours dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 7 % de dioxyde de carbone. Le milieu est renouvelé trois fois par semaine. Pendant cette période de culture, les cellules cardiaques de rat néonatales commencent à s'allonger, à s'interconnecter et à s'aligner le long des lignes de force situées entre les piliers en silicone.Au moment de l'implantation, des contractions spontanées cohérentes seront observées. Stériliser les instruments chirurgicaux à l'autoclave avant utilisation et réchauffer 30 millilitres de solution saline stérile. Les rats destinés à l'implantation doivent peser entre 100 et 150 grammes et être élevés en conditions conventionnelles, avec une alimentation standard pour rats et de l'eau ad libitum.Dans cette vidéo, des rats brun de Norv&egrave;ge sont utilis&eacute;s apr&egrave;s anesth&eacute;sie ; s&eacute;dater les rats avant la chirurgie et confirmer la s&eacute;dation par l'absence de r&eacute;ponse &agrave; une pincement des orteils tandis que le rat est sous anesth&eacute;sie, injecter cinq milligrammes par kilogramme de poids corporel, carens par voie sous-cutan&eacute;e dans le flanc, raser la zone abdominale et appliquer une pommade ophtalmique afin d'emp&ecirc;cher les yeux de l'animal de s'ass&eacute;cher. Pendant l'anesth&eacute;sie, d&eacute;sinfecter la zone abdominale &agrave; l'aide de B&eacute;tadine, puis effectuer un essuyage avec de l'&eacute;thanol &agrave; 80 % en allant du propre vers le sale. R&eacute;p&eacute;ter cette d&eacute;sinfection.Effectuez trois pas, draper l'animal et pratiquer une incision abdominale médiane, en séparant la peau et le muscle en deux étapes afin d'ouvrir l'abdomen. Utiliser la stérilisation à la perle chaude sur les outils entre les incisions. Humidifier un gant sans poudre avec la solution saline.Placer les intestins à l'intérieur du gant. Replier le gant autour des intestins afin d'éviter la perte d'humidité. Élargir l'incision et exposer la rate.Identifier et déployer le moment de force supérieur à l’aide de pinces. Couper soigneusement l’EHT sur les piliers en silicone auxquels il est suspendu et le transférer sur le moment de force supérieur. Enrouler le moment de force supérieur autour de l’EHT et le fixer fermement à l’aide de deux points de suture simples en proline 7-0.Ensuite, remettez les intestins dans l'abdomen. Rincez l'abdomen avec un millilitre de solution saline stérile préchauffée. Fermez la couche musculaire de la paroi abdominale à l'aide de six points continus en proline 6-0.Utilisez cinq points de suture proline en surjet pour fermer la peau afin d'assurer une analgésie suffisante pour ce type de procédure. Administrez 50 milligrammes pour 100 millilitres d'ole dans l'eau de boisson pendant trois jours après l'implantation. La plateforme IVUS Bioimaging est utilisée pour l'imagerie bioluminescente non invasive in vivo et les résultats sont analysés à l'aide du logiciel IVUS Living Image.L'imagerie d'emballage est effectuée quotidiennement, à partir de deux heures après l'intervention chirurgicale. Avant de visualiser la bioluminescence du THC, anesthésiez le rat et confirmez la sédation par une pincée au niveau de l'orteil. Désinfectez la zone abdominale.Injectez de la luciférine à une dose initiale de 375 milligrammes par kilogramme de poids corporel et placez le rat anesthésié dans la chambre d'imagerie ivu. Jusqu'à quatre rats peuvent être analysés simultanément. Utilisez le logiciel d'imagerie IVUS en temps réel pour observer et enregistrer le signal maximal, qui apparaît environ 20 minutes après l'injection de luciférine.Ensuite, établir l'intensité du signal de base des cellules positives pour la luciférase dans le EHT, exprimée en photons par seconde par centimètre carré par Ceridian, dans la région d'intérêt, 120 minutes après l'implantation puis aux jours 1, 2, 3, 5, 7, 10 et aux semaines deux, trois et quatre. Les données peuvent être représentées sous forme de graphique montrant l'intensité du signal en fonction du temps. Les réponses immunitaires cellulaires in vivo chez les sujets Brown, Norway immunocompétents et immunodéficients.Des rats nus ont été étudiés après la récolte des cytes SP du donneur cinq jours après l'implantation du THÉ. L'expression de l'interféron gamma et de l'IL-4 a été évaluée par des tests ELISA en utilisant le THÉ inhibé par la mitomycine comme stimulateurs et 5 × 10⁶ cytes du receveur comme cellules répondeuses. Les réponses Th1 et Th2 étaient significativement plus élevées dans le modèle immunocompétent par rapport au modèle immunodéficient, comme en témoignent respectivement la production d'interféron gamma et d'IL-4.Des EHS positifs pour la luciférase ont été transplantés dans l'omentum majeur de rats PN immunocompétents ou de rats nus immunodéficients. La survie cellulaire a été suivie longitudinalement par imagerie bioluminescente (BLI). Le taux d'animaux ayant rejeté les EHS transplantés est présenté.Tous les rats BN ont rejeté rapidement les greffes d'EHT, tandis que les cellules ont survécu chez les rats déficients en lymphocytes T. Une fois maîtrisées, les interventions chirurgicales peuvent être réalisées en quelques minutes si la technique est correctement effectuée après l'opération. D'autres méthodes, telles que les dosages immunologiques et l'histologie, peuvent être réalisées afin de répondre à d'autres questions concernant l'infiltration cellulaire et la réponse humorale.

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