Greffes d'ingénierie biologique vasculaire basé sur l'aide d'un bioréacteur pulsatile

L’objectif global de cette procédure est de concevoir des greffes vasculaires d’origine biologique à l’aide d’un système de bioréacteur pulsatile. Ceci est accompli en préparant un échafaudage biodégradable à partir d’un treillis PGA où les cellules se développeront en rangées et en les assemblant dans une chambre de bioréacteur. Les échafaudages sont ensuite reliés par des cellules musculaires lisses et un couvercle avec de l’air et un tube d’alimentation scelle la chambre du bioréacteur.

Le bioréacteur est ensuite connecté à un système d’écoulement pour fournir un flux pulsatile aux cuves du bioréacteur. Dans le réacteur, les cellules se transforment en vaisseaux qui passent des tests immunochimiques, biochimiques et mécaniques. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies coronariennes, car cette technique est une approche prometteuse pour régénérer des greffes vasculaires implantables de petit diamètre pour le pontage artériel.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’ingénierie vasculaire, elle peut être appliquée à d’autres systèmes organiques tels que les forces physiologiques cycliques. Généralement, les personnes novices dans cette méthode auront du mal. Vous aurez besoin de beaucoup de pratique pour maîtriser pleinement les compétences.

Nous avons eu l’idée de cette approche lorsque nous avons réalisé l’importance d’appliquer une stimulation mécanique physiologique pour régénérer les constructions d’ingénierie. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car le processus de fabrication du bioréacteur est difficile à apprendre car il comporte de nombreuses étapes et ne peut être acquis que par une démonstration détaillée. Pour commencer, utilisez de l’eau distillée pour nettoyer des sections de 30 centimètres de long d’un tube en silicone de trois millimètres de diamètre intérieur et laissez-le sécher à l’air.

Utilisez des ciseaux pour découper une section de 1,1 centimètre sur huit centimètres de maille PGA pour chaque morceau de tube à l’aide d’un hémostat, de sorte que la maille PGA au tube avec suture Dexon 6.0 fait trois nœuds chirurgicaux et suit avec des points simples avec de l’hémostat, le maillage sécurisé fait un échafaudage PGA. Lavez les échafaudages en les trempant d’abord dans une molaire d’hydroxyde de sodium pendant une à deux minutes, puis trois trempettes dans de l’eau distillée pendant deux minutes par trempage. Séchez-les en tapotant entre les lavages et laissez-les sécher à l’air libre dans une capuche pendant 15 minutes après le troisième lavage.

Une fois séché, suturez des poignets en Dacron d’un centimètre à chaque extrémité de la maille avec trois points de suture. Laissez un chevauchement de deux à trois millimètres du tube et ne percez pas le tube. Assurez-vous de laisser environ 15 centimètres de suture libre pour une utilisation ultérieure dans ce protocole.

Tous les composants et outils du bioréacteur sont préalablement autoclavés. La veille du lancement de la culture du bioréacteur, le bioréacteur doit être partiellement assemblé, immerger les composants du bioréacteur, les échafaudages, ainsi mailler les tubes en silicone, les instruments chirurgicaux et un fil mince plus long que la longueur du bioréacteur dans un bain d’éthanol à 70 % pendant au moins 30 minutes pendant l’immersion. Utilisez le fil pour tirer le tube en silicone à travers les bras latéraux du réacteur.

Sortez maintenant du bioréacteur et fixez les échafaudages PGA à l’intérieur en fixant les poignets en Dacron sur les lèvres en verre évasées. Utilisez l’excédent de suture pour attacher chaque poignet. Ensuite, à l’aide de connecteurs, fixez le tube en silicone d’un côté de l’échafaudage avec une paire de bras de bioréacteur et fixez le tube de l’autre côté de l’échafaudage aux deux autres bras.

Lorsque les connecteurs sont installés, retirez-les des bras latéraux et rincez le bioréacteur avec de l’éthanol. Laissez tremper le réacteur pendant 10 minutes de chaque côté. Placez le bioréacteur sur des boîtes de Pétri et rincez-le avec une culture tissulaire.

Eau de qualité. À l’aide d’une pipette, assurez-vous de rincer également le grillage et le tube. Placez maintenant une barre d’agitation stérile dans le réacteur pour une utilisation future et séchez l’appareil pendant la nuit dans la hotte avec le ventilateur allumé et les UV éteints à partir de ce moment.

Ne vous penchez pas sur le réacteur car cela pourrait entraîner une contamination Lors de l’installation, tous les connecteurs doivent être essuyés avec de l’alcool. Avant que les fixations ne soient fabriquées, de nombreux joints sont ensuite renforcés avec du paraform, qui doit être trempé dans de l’éthanol à 70 % avant d’être appliqué. Il en faut donc, abondamment des deux.

À portée de main, par mesure de précaution, placez une boîte de Pétri stérile sur chaque ouverture du bioréacteur pour protéger l’échafaudage PGA à l’intérieur des contaminants. Commencez maintenant la configuration en fixant l’orifice d’injection au troisième bras inutilisé du bioréacteur. Ensuite, connectez le sac IV au système d’écoulement.

Avec le jeu de tubes de morse, attachez l’extrémité bleue aussi près que possible de la jonction en Y et fixez le tube. Fixez le tube rouge à l’extrémité du sac IV. Fixez ensuite le tube blanc sur un côté du système d’écoulement.

Insérez un robinet d’arrêt à trois voies dans le système d’écoulement. Fixez une extrémité du tube du transducteur de pression au robinet d’arrêt et fixez l’autre extrémité à l’ouverture centrale du sac IV. Maintenant, pour remplir partiellement le système d’écoulement et vérifier les fuites, ajoutez 350 millilitres de PBS et 1 % de zone de champignons dans le sac IV.

À l’aide d’une seringue de 60 millilitres avant ou après la connexion au système d’écoulement, ajustez le robinet d’arrêt pour contrôler le sens d’écoulement du PBS et pressez le sac pour rincer le système. Cette étape peut être effectuée avant ou après l’installation de la cellule. Maintenant, les cellules peuvent être installées dans un bioréacteur.

Dans cet exemple, les cellules sont suspendues 8 millions de cellules SM, soit environ un confluent T 75 dans 1,25 millilitre de milieu, et les égouttent uniformément sur l’échafaudage PGA de la jonction Dacron à la jonction Dacron. Après avoir ajouté les cellules, essuyez le bord du bioréacteur avec de l’alcool. Évitez de planer au-dessus du réacteur.

Ensuite, assemblez soigneusement le couvercle du bouchon en silicone. Assurez-vous de ne pas exposer le bas du couvercle lorsqu’il est retiré du sac autoclave ou pendant l’une des étapes de fixation suivantes. Tout d’abord, fixez l’orifice d’injection à la sonde d’alimentation au niveau du connecteur mâle.

Deuxièmement, fixez des filtres en PTFE de 0,20 micron à chacun des trois aéroports. Troisième paragraphe, filmez l’orifice d’injection. Insérez le couvercle en silicone assemblé dans le bioréacteur en verre.

Assurez-vous que la sonde d’alimentation ne touche pas les échafaudages PGA assis. Scellez ensuite avec du paraform. Connectez maintenant le bioréacteur au système d’écoulement et placez le bioréacteur et le système d’écoulement dans un incubateur à 37 degrés Celsius.

Pendant 25 à 30 minutes, le réacteur doit être mis sur le côté et tourné toutes les cinq minutes. Ensuite, pendant que vous êtes encore dans l’incubateur, remplissez la chambre du bioréacteur avec 400 millilitres de quatre à 10 milieux de culture à l’aide d’une pompe à travers un tube d’alimentation. Maintenant, incubez les échafaudages ensemencés sans aucun pompage pulsatile pendant six à sept jours à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Il n’est pas nécessaire de changer de milieu ou de prendre une supplémentation en vitamine C pendant cette période avant d’allumer la pompe, inspectez le tube pour détecter les fuites ou les plis. Ajustez ensuite le taux de vitesse de la pompe pour maintenir une plage de pression entre moins 30 et 270 millimètres de mercure. Surveillez et maintenez cette pression quotidiennement tout au long de la culture.

Les changements de milieu et la supplémentation en acide ascorbique doivent être effectués deux fois par semaine pendant que l’échafaudage grandit avec un pompage pulsatile pour alimenter d’abord le milieu frais, fixez l’orifice d’injection et le filtre PTFE sur les couvercles d’alimentation à des fins de changement de milieu et d’élimination des déchets moyens. Ensuite, placez fermement le tube d’alimentation dans la pompe à double direction et insérez une extrémité dans l’orifice d’alimentation du bioréacteur et l’autre extrémité dans le couvercle d’alimentation. Maintenant, commencez lentement à pomper 200 millilitres de fluide.

Progressivement, la vitesse de la pompe peut être augmentée. Ensuite, fixez une nouvelle sonde d’alimentation et commencez lentement à pomper 200 millilitres de milieu frais. Pour ajouter de l’acide ascorbique dans le réacteur, prélever 25 millilitres de milieu à l’aide d’une seringue stérile de 30 millilitres.

Ajoutez cinq millilitres de solution stérile d’acide ascorbique, puis retournez les 25 millilitres. Les récipients d’ingénierie moyenne apparaîtront opaques et atteindront une épaisseur de paroi d’environ 250 microns après huit semaines de culture. Dans des conditions pulsatiles, la coloration à l’hémat, au toïn et à l’éosine des vaisseaux modifiés montre des changements de morphologie tissulaire avec le temps et avec les pulsations.

La face luminale des vaisseaux est indiquée par une coloration tri CHRO de L masson. Pour le collagène, le vaisseau pulsé de quatre semaines a plus de collagène que son homologue non pulsé, les flèches blanches indiquent les fragments PGA restants dans les vaisseaux à 12 semaines. L’analyse immunochimique montre l’expression du marqueur précoce du muscle lisse alpha actine, du marqueur intermédiaire du muscle lisse cal poin one et du marqueur tardif du muscle lisse myosine lourde Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept à huit heures si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de tout effectuer aussi proprement et régulièrement que possible en suivant cette procédure. D’autres méthodes, comme la modification de la lumière des vaisseaux conçus, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’importance de la modification de la surface luminale dans la maintenance des vaisseaux modifiés lors d’études in vivo. Après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’ingénierie tissulaire, en particulier de l’ingénierie vasculaire, pour explorer des moyens potentiels de traiter les maladies coronariennes dans des modèles animaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser des greffes vasculaires implantables par le biais d’une culture postale dynamique. N’oubliez pas que travailler avec de l’hydroxyde de sodium peut être dangereux et que des précautions telles que la protection oculaire et la blouse de laboratoire doivent toujours être utilisées lors de l’exécution de cette procédure.