Greffes d'ingénierie biologique vasculaire basé sur l'aide d'un bioréacteur pulsatile

L'objectif général de cette procédure est de concevoir des greffons vasculaires d'origine biologique à l'aide d'un système de bioréacteur pulsatile. Cela est réalisé en préparant une charpente biodégradable à partir d'une maille de PGA sur laquelle les cellules vont croître, puis en assemblant ces éléments dans une chambre de bioréacteur. Les charpentes sont ensuite ensemencées avec des cellules musculaires lisses, et un couvercle muni d'un tube d'aération et d'alimentation hermétise la chambre du bioréacteur.

Le bioréacteur est ensuite relié à un système de flux afin d'assurer un écoulement pulsatile dans les vaisseaux du bioréacteur. Dans le réacteur, les cellules se développent au sein des vaisseaux, qui passent des tests immunochimiques, biochimiques et mécaniques. Les implications de cette technique s'étendent au traitement de la maladie coronarienne, car elle constitue une approche prometteuse pour régénérer des greffons vasculaires de petit diamètre implantables destinés au pontage artériel.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'ingénierie vasculaire, elle peut être appliquée à d'autres systèmes organiques soumis à des forces physiologiques cycliques. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés. Vous aurez besoin de beaucoup de pratique pour maîtriser complètement ces compétences.

L'idée de cette approche nous est d'abord venue lorsque nous avons pris conscience de l'importance d'appliquer une stimulation mécanique physiologique afin de régénérer des constructions ingénieriques. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car le processus d'utilisation du bioreacteur est difficile à apprendre en raison du grand nombre d'étapes et ne peut être maîtrisé qu'au travers d'une démonstration détaillée. Pour commencer, utilisez de l'eau distillée pour nettoyer des sections de 30 centimètres de longueur de tubulure en silicone ayant un diamètre intérieur de trois millimètres, puis laissez-les sécher à l'air libre.

Utilisez des ciseaux pour découper une section de treillis de PGA de 1,1 centimètre sur huit centimètres pour chaque morceau de tube à l’aide d’un clamp, puis fixez le treillis de PGA au tube avec un fil chirurgical Dexon 6.0 en faisant trois nœuds chirurgicaux, suivis de points simples à l’aide du clamp ; le treillis fixé forme un échafaudage en PGA. Lavez les échafaudages en les trempant d’abord dans une solution d’hydroxyde de sodium à une molaire pendant une à deux minutes, puis effectuez trois trempages dans de l’eau distillée pendant deux minutes chacun. Séchez-les délicatement entre chaque lavage et laissez-les sécher à l’air libre dans une hotte pendant 15 minutes après le troisième lavage.

Une fois sec, suturer une embase de Dacron d'un centimètre à chaque extrémité du maillage à l'aide de trois points de suture. Laisser un recouvrement de deux à trois millimètres du tube et ne pas percer le tube. Veiller à laisser environ 15 centimètres de suture libre pour une utilisation ultérieure dans ce protocole.

Tous les composants du bioréacteur et les outils sont stérilisés en autoclave au préalable. La veille du démarrage de la culture en bioréacteur, le bioréacteur doit être partiellement assemblé : plonger les composants du bioréacteur, les échafaudages, le tube en silicone, les instruments chirurgicaux et un fil fin plus long que la hauteur du bioréacteur dans un bain d'éthanol à 70 % pendant au moins 30 minutes, en les maintenant immergés. Utiliser le fil pour faire passer le tube en silicone à travers les branchements latéraux du réacteur.

Sortez maintenant le bioréacteur et fixez les échafaudages en PGA en attachant les manchons en Dacron sur les rebords évasés du verre. Utilisez l'excès de suture pour fixer chaque manchon. Ensuite, à l’aide de raccords, reliez le tube en silicone d’un côté de l’échafaudage à une paire de bras du bioréacteur, puis reliez le tube de l’autre côté de l’échafaudage aux deux autres bras.

Lorsque les raccords sont installés, retirez-les des tubulures latérales et rincez le bioréacteur avec de l'éthanol. Laissez le réacteur tremper pendant 10 minutes de chaque côté. Placez le bioréacteur sur des boîtes de Pétri et rincez-le avec du milieu de culture tissulaire.

Évaluez l'eau. À l'aide d'une pipette, veillez également à rincer la maille et le tube. Placez maintenant une barrette d'agitation stérile dans le réacteur pour une utilisation ultérieure et faites sécher l'appareil toute la nuit sous la hotte avec le ventilateur allumé et la lumière UV éteinte à partir de ce moment.

Ne vous penchez pas au-dessus du réacteur, car cela pourrait entraîner une contamination. Pendant la mise en place, tous les connecteurs doivent être nettoyés soigneusement avec de l’alcool. Avant de fixer les raccords, plusieurs des jonctions sont ensuite renforcées avec du paraform, qui doit être imbibé d’éthanol à 70 % avant son application. Veillez donc à disposer en quantité suffisante des deux éléments.

En guise de précaution, placez une boîte de Petri stérile sur chaque ouverture du bioréacteur pour protéger la structure PGA à l'intérieur des contaminants. Commencez maintenant la mise en place en fixant le port d'injection au troisième bras inutilisé du bioréacteur. Ensuite, reliez le sac de perfusion au système de circulation.

Avec le dispositif de tubulure pour morse, fermer l'extrémité bleue aussi près que possible de la jonction en Y et pincer le tube. Relier la tubulure rouge à l'extrémité opposée du sac de perfusion. Puis relier le tube blanc à un côté du système d'écoulement.

Insérez un robinet trois voies dans le système d'écoulement. Fixez une extrémité du tube du transducteur de pression au robinet et l'autre extrémité à l'orifice central du sac de perfusion. Pour remplir partiellement le système d'écoulement et vérifier les fuites, ajoutez 350 millilitres de PBS et 1 % de fungi zone dans le sac de perfusion.

À l’aide d’une seringue de 60 millilitres, avant ou après avoir raccordé au système de flux, régler le robinet à trois voies pour contrôler le sens d’écoulement du PBS et comprimer le sac pour rincer le système. Cette étape peut être réalisée soit avant, soit après le semis des cellules. Les cellules peuvent désormais être ensemencées dans le bioréacteur.

Dans cet exemple, resuspendre 8 millions de cellules SM, soit environ une culture confluente en flacon T75, dans 1,25 millilitre de milieu, puis les déposer uniformément sur le support PGA, d'une jonction en Dacron à l'autre. Après avoir ajouté les cellules, essuyer soigneusement le bord du bioréacteur avec de l'alcool. Éviter de rester au-dessus du réacteur.

Ensuite, assemblez soigneusement le couvercle en bouchon de silicone. Veillez à ne pas exposer la face inférieure du couvercle lors de son retrait du sac d'autoclave ou pendant chacune des étapes suivantes de fixation. Commencez par fixer le port d'injection au tube d'alimentation au niveau du raccord mâle.

Deuxièmement, fixez des filtres en PTFE de 0,20 micron à chacun des trois aéroports. Troisième paragraphe, filmez le port d'injection. Insérez le bouchon en silicone assemblé dans le bioréacteur en verre.

Veillez à ce que le tube d'alimentation ne touche pas les échafaudages PGA en place. Scellez ensuite avec du paraforme. Connectez maintenant le bioréacteur au système de flux et placez le bioréacteur ainsi que le système de flux à l'intérieur d'un incubateur à 37 degrés Celsius.

Pendant 25 à 30 minutes, le réacteur doit être placé sur le côté et tourné toutes les cinq minutes. Ensuite, tout en restant dans l’incubateur, remplir la chambre du bioréacteur avec 400 millilitres de milieu de culture quatre à dix à l’aide d’une pompe par un tube d’alimentation. Incuber ensuite les supports ensemencés sans pompage pulsatile pendant six à sept jours à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Il n'est pas nécessaire de changer le milieu ni d'ajouter de la vitamine C pendant cette période avant d'activer la pompe ; inspectez les tubulures à la recherche de fuites ou de coudes. Réglez ensuite la vitesse de la pompe afin de maintenir une pression comprise entre -30 et 270 millimètres de mercure. Surveillez et maintenez cette pression quotidiennement tout au long de la culture.

Les changements de milieu et la supplémentation en acide ascorbique doivent être effectués deux fois par semaine pendant que la matrice se développe avec une perfusion pulsatile. Pour commencer, fixez le port d'injection et le filtre en PTFE sur les couvercles d'alimentation, à la fois pour le changement de milieu et pour l'élimination des déchets. Ensuite, insérez fermement le tube d'alimentation dans la pompe bidirectionnelle, puis connectez une extrémité au port d'alimentation du bioréacteur et l'autre extrémité au couvercle d'alimentation. Démarrez maintenant lentement la pompe pour évacuer 200 millilitres de milieu.

Progressivement, la vitesse de la pompe peut être augmentée. Ensuite, fixer un nouveau tube d'alimentation et commencer lentement à pomper 200 millilitres de milieu frais. Pour ajouter de l'acide ascorbique dans le réacteur, prélever 25 millilitres de milieu à l'aide d'une seringue stérile de 30 millilitres.

Ajoutez cinq millilitres de solution stérile d'acide ascorbique, puis remettez les 25 millilitres. Les vaisseaux ingénierisés apparaîtront opaques et atteindront une épaisseur pariétale d'environ 250 micromètres après huit semaines de culture. Dans des conditions pulsées, la coloration hématéine-éosine des vaisseaux ingénierisés montre des modifications de la morphologie tissulaire au fil du temps et en fonction des pulsations.

Le côté luminal des vaisseaux est indiqué par une coloration de Masson au rouge trichrome. La coloration du collagène montre que le vaisseau soumis à une impulsion de quatre semaines contient plus de collagène que son homologue non pulsatif. Les flèches blanches indiquent les fragments résiduels de PGA présents dans les vaisseaux au bout de 12 semaines. L'analyse immunochimique révèle l'expression du marqueur précoce des cellules musculaires lisses, l'alpha-actine, du marqueur intermédiaire, la calponine-1, et du marqueur tardif, la chaîne lourde de myosine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept à huit heures, à condition d'être exécutée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'effectuer chaque étape de manière aussi propre et stérile que possible en suivant ce protocole. D'autres méthodes, comme la modification de la lumière des vaisseaux conçus, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l'importance de la modification de la surface luminaire dans le maintien des vaisseaux conçus pendant les études in vivo. Après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du génie tissulaire, en particulier celui du génie vasculaire, pour explorer des moyens potentiels de traiter les maladies coronariennes chez des modèles animaux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir des greffons vasculaires ingénierisés implantables grâce à une culture postale dynamique. N'oubliez pas que le travail avec l'hydroxyde de sodium peut être dangereux, et que des précautions telles que la protection oculaire et la blouse de laboratoire doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.