Name: Dissection et 2-Photon Imaging des ganglions lymphatiques périphériques chez les souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 48 s
Description: Découvrez la dissection et l'imagerie deux-photons des ganglions lymphatiques périphériques chez la souris. Cette méthode permet de visualiser la motilité des cellules T CD4+ in vivo pour étudier les réponses immunitaires.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier Rebecca Paquette de l&#39;aide pour la préparation des réactifs. MPM est soutenu par une bourse de Ruth L. Kirchstein prédoctoral de la National Institutes of Health et le soutien de subventions GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48071 (IP) aussi de la National Institutes of Health.

1. Le transfert adoptif de cellules: Veine de la queue ou par injection intra-oculaire sont à la fois des méthodes appropriées pour l&#39;introduction de cellules tracker-étiquetés ou exprimant la protéine fluorescente-lymphocytes. Dans cette vidéo. nous démontrons transfert adoptif de cellules par injection dans la veine de la queue. a. Matériaux Lymphocytes T CD4 + sont étiquetés avec 1,4 uM CFSE pendant 30 minutes à 37 º C, lavées deux fois, et re-suspendues dans 100 ul de RPMI-1640. Les cellules sont chargées dans une solution stérile de calibre 28 seringue à insuline pour l&#39;injection. Le nombre de cellules utilisées dépend de l&#39;expérience en cours. Généralement, 5 millions de cellules T sont suffisants pour la visualisation des cellules T simples. Un dispositif de retenue des rongeurs pour la souris est nécessaire pour prévenir les blessures à l&#39;animal et à vous-même. b. Sécurisation de l&#39;animal La souris est sécurisé pour le transfert adoptif par lentement soutien de l&#39;animal dans le dispositif de retenue des rongeurs (voir vidéo) et la fermeture à la fin ouverte du tube en appuyant délicatement sur le piston. Ne pas laisser aller de la queue de la souris lors de ce processus, comme certains petits animaux peuvent tourner autour à l&#39;intérieur du dispositif de retenue. Cette méthode empêche l&#39;animal de se blesser et de se déplacer pendant l&#39;injection. Lorsque la mise en place du dispositif de retenue des rongeurs, ne pas pousser le piston dans plus que nécessaire pour garder l&#39;animal de sauter vers l&#39;avant. Aussi, ne pas pousser le piston contre l&#39;animal, et ne pas laisser l&#39;animal dans le dispositif de retenue pour une période de temps prolongée. C. Visualiser le veine de la queue Tirez doucement la queue vers vous afin qu&#39;il soit légèrement enroulée sur votre index et maintenu contre l&#39;intérieur du doigt par votre pouce. Identifier les veines caudales situées de chaque côté de la queue verticale. La visualisation est facilitée par le réchauffement de la queue à l&#39;eau tiède, puis essuyer avec de l&#39;éthanol. d. L&#39;injection de cellules Lorsque la veine a été localisé, insérez la seringue en biseau vers le haut à un angle parallèle à la veine superficielle. Une fois dans la veine, doucement appuyer sur le piston, si vous êtes dans la veine il devrait y avoir aucune résistance à l&#39;injection. S&#39;il ya une résistance, retirez la seringue et essayez de nouveau dans un endroit différent. Si vous êtes dans la veine, lentement appuyer sur le piston jusqu&#39;à ce que l&#39;injection est terminée. La queue ne doit pas devenir distendu pendant l&#39;injection. Si c&#39;est le cas, cela voudrait dire que l&#39;aiguille n&#39;est pas dans la veine. Il est possible de «perdre» la veine lors de l&#39;injection. Si cela se produit, retirez l&#39;aiguille et essayez votre injection à un endroit différent. Si vous avez besoin d&#39;essayer plus d&#39;une injection, il est préférable de déplacer la queue vers le corps de la souris à partir du site d&#39;injection d&#39;origine. Planifiez à l&#39;avance de cette possibilité en commençant distalement sur la queue pour vous donner la place pour une autre tentative de transfert adoptif. e. Post-injection considérations Après l&#39;injection est terminée, un petit reflux du sang de la veine va se produire. Appuyez doucement sur le site d&#39;injection avec un nettoyage essuyez jusqu&#39;à ce que le saignement cesse. Retirer le piston et laissez l&#39;animal marche en avant, hors de la de contention, tout doucement en tenant la queue. Toujours vérifier auprès de votre comité de protection des animaux et des protocoles d&#39;utilisation d&#39;animaux pour vous assurer de la conformité. Il est important de pratiquer cette technique plusieurs fois avant de tenter l&#39;expérience réelle. 2. Isolement des ganglions lymphatiques Isolement des ganglions lymphatiques pour deux d&#39;imagerie photonique exige l&#39;élimination soigneuse du ganglion correcte du tissu environnant. a. Sélection et localisation des ganglions lymphatiques périphériques Sélection des ganglions lymphatiques pour l&#39;imagerie dépendra des objectifs expérimentaux. Soyez conscient de l&#39;infection locale ou par injection ganglions lymphatiques, et sélectionnez le nœud approprié pour l&#39;imagerie. L&#39;article de Van den Broeck et al., Décrit l&#39;emplacement et la morphologie des ganglions lymphatiques murins en détail 3. Dans cette vidéo, nous démontrons l&#39;excision des six grandes ganglions lymphatiques périphériques qui sont appropriées pour l&#39;isolement cellulaire ou d&#39;imagerie. b. Ablation des ganglions lymphatiques: Gardez à l&#39;esprit de l&#39;intégrité des tissus tout en retirant les ganglions lymphatiques. Attention à ne pas rompre la capsule ou dans tout autre manière d&#39;endommager la structure des ganglions lymphatiques. La perte d&#39;intégrité structurale des ganglions lymphatiques de compromettre l&#39;expérience. Si nécessaire, retirez la graisse de la surface des ganglions lymphatiques avec de fines pinces à disséquer (# 5 Dumont), sous un microscope à dissection. Les ganglions lymphatiques ne devrait pas avoir de graisse restant sur la surface du noeud, car cela va obscurcir l&#39;imagerie par diffusion de la lumière. Une bonne excision des ganglions lymphatiques est aussi une technique importante à la pratique avant la première expérience réelle. 3. Nod lymphatiquese Imaging configuration et considérations Le ganglion lymphatique doit être fixé au stade de l&#39;imagerie, qui dans ce cas constitué d&#39;une chambre de retrait. Réchauffé, oxygène perfusé médias est pompé dans la chambre d&#39;un côté à l&#39;aide d&#39;une pompe péristaltique et radiateur en ligne, et il sort par un canal vers le bas classés dans une chambre de collecte avec un tube à vide dans un ballon à la collecte des déchets. Dans notre système, le ganglion lymphatique est immergé dans 37 ° C des médias et de super-perfusés avec qualité médicale carbogène (5% de CO 2, 95% d&#39;O 2). La température du support de perfusion doivent être enregistrées au plus près des ganglions lymphatiques que possible. Votre système particulier peut exiger des variations dans le débit des médias et de la scénographie pour accueillir la platine du microscope et objective. a. Configuration lymphatiques imagerie noeud: Comme le montre la vidéo, nous avons sécurisé les ganglions lymphatiques en commençant par l&#39;attacher, médullaires vers le bas (à l&#39;image de T ou des zones de cellules B en utilisant un microscope droit) pour une lamelle en plastique, coupées à la taille appropriée. Il est important d&#39;utiliser une colle tissulaire non toxique (que nous utilisons Vetbond ™ de 3M Corporation). La lamelle est garanti dans les médias qui coule en plaçant une mince couche de graisse silicone sur la face inférieure de la lamelle, puis adhère à la base de ce verre de la chambre de l&#39;imagerie. b. 2-Photon considérations d&#39;imagerie: Plusieurs facteurs peuvent causer des lymphocytes à arrêter de bouger: la température est trop élevée ou trop basse; excès de puissance du laser, la compression ou d&#39;autres dommages à des ganglions lymphatiques et le manque d&#39;oxygène. Les dommages dus à la puissance du laser excessive ou à des températures&gt; ~ 39 ° C est irréversible. Si les cellules sont faibles, il est souvent préférable d&#39;augmenter le gain du détecteur ou le protocole de cellules-étiquetage plutôt que d&#39;utiliser une puissance supérieure au laser pour visualiser les cellules. Optimisation de l&#39;étiquetage ou l&#39;expression de protéines fluorescentes peut être nécessaire d&#39;apporter de la fluorescence au-dessus du niveau de l&#39;autofluorescence de fond. Avec un gain raisonnable et des réglages de puissance laser, sur un décalage de deux journaux de la fluorescence-dessus de référence (mesuré par cytométrie en flux) est raisonnable pour la visualisation des cellules. Avec accordable à deux photons des lasers, la longueur d&#39;onde utilisée pour l&#39;excitation devrait être un peu moins que le double du maximum d&#39;excitation monophotonique du fluorophore étant imagé. En deux photons expériences en utilisant plus d&#39;une étiquette ou d&#39;une protéine fluorescente, il peut être nécessaire d&#39;expérimenter avec la longueur d&#39;onde d&#39;excitation utilisée pour trouver les réglages optimaux pour les deux labels. D&#39;excitation à deux photons peuvent aussi être utilisés pour des structures d&#39;image collagène endogène en prenant avantage de la valeur intrinsèque de génération de second harmonique bleue. Deuxième génération d&#39;harmoniques (SHG) se produit lorsque deux photons sont combinés au sein d&#39;un matériau et émettent un photon unique de deux fois la fréquence des photons d&#39;origine. Dans les tissus, excitation à deux photons se produit lorsque la lumière laser incidente est perpendiculaire à une structure de protéine hautement ordonnés tels que le collagène. Questions pratiques concernant l&#39;imagerie à deux photons ont été discutés en 4 critiques aperçu, 5.

<ol><li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+tissue+imaging%3A+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
</ol>

Dans ce protocole vidéo, nous montrons les procédures de transfert de cellules adoptifs et l&#39;isolement des ganglions lymphatiques et la préparation nécessaire pour la motilité des lymphocytes imagerie dans un ganglion lymphatique périphérique. Deux photons d&#39;imagerie a plusieurs avantages sur l&#39;imagerie confocale dans les deux tissus explantés (illustré ici) et dans les préparations intravitale. Notamment, l&#39;utilisation des infra-rouge d&#39;excitation minimise diffusion de la lumière et permet à l&#39;imagerie ~ 300 micromètres dessous de la capsule du ganglion lymphatique et plus profondes dans certains tissus 4. Par ailleurs, multi-photons d&#39;excitation est limitée au point focal de l&#39;objectif, en minimisant photoblanchiment et les lésions tissulaires à côté du plan focal. Comme avec toute nouvelle technique, cependant, à deux photons d&#39;imagerie n&#39;est pas une panacée et ses limites et ses pièges potentiels doivent garder à l&#39;esprit 5. Parmi eux se trouve l&#39;exigence que - sauf signaux intrinsèques telles que seconde génération de l&#39;harmonique par le collagène des cellules d&#39;intérêt doivent être marqués par fluorescence par des sondes extrinsèques ou par expression de protéines fluorescentes. L&#39;impression est donc créé que ces cellules marquées sont la natation dans un vide noir, tandis que dans la vérité, ils sont immergés dans, et d&#39;interagir avec un environnement complexe d&#39;éléments structurels et une myriade d&#39;autres non étiquetés, les cellules invisibles. Au cours des six années écoulées depuis l&#39;introduction de deux photons d&#39;imagerie pour l&#39;immunologie, cette technique a permis aux chercheurs d&#39;examiner des questions de longue date par les visualisant directement dans les tissus vivants intacts processus, y compris interactions cellule-cellule, la motilité cellulaire et la localisation, voies de signalisation cellulaire et les cellules cytotoxiques tuant des événements. Le champ a évolué rapidement au-delà des premières descriptions phénoménologiques, et des analyses quantitatives avec modélisation et simulation informatiques commencent maintenant à faire comprendre comment les mouvements apparemment chaotique cellulaire et les interactions au sein des ganglions lymphatiques conduire à une réponse immunitaire efficace. Ce progrès est examiné en détail dans une publication récente 1, qui recense plus de 100 documents décrivant l&#39;application de la microscopie à deux photons pour immunoimaging.

dissection et 2-photon imaging des ganglions lymphatiques périphériques chez les souris

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Deux photons d&#39;imagerie a révélé une chorégraphie élégante de la motilité et les interactions cellulaires dans le ganglion dans des conditions basales et à l&#39;initiation d&#39;une réponse immunitaire 1. Ici, nous présentons les méthodes pour le transfert adoptif de cellules T étiqueté, l&#39;isolement des ganglions lymphatiques, et la motilité imagerie des cellules T CD4 + dans le ganglion lymphatique explantés que décrite pour la première en 2002 2. L&#39;imagerie à deux photons de cellules immunitaires nécessite que les cellules sont marquées par fluorescence, soit par coloration avec un colorant Tracker cellulaire ou en exprimant une protéine fluorescente. Nous démontrons la procédure de transfert adoptif de cellules dérivées de l&#39;injection de souris donneuses dans la veine caudale d&#39;un animal receveur, où ils abritent les organes lymphoïdes dans environ 15-30 min. Nous illustrons l&#39;isolement d&#39;un ganglion lymphatique et de décrire des méthodes pour assurer une fixation correcte du ganglion excisé. D&#39;autres considérations telles que l&#39;oxygénation correcte des médias perfusé, la température et la puissance du laser sont discutées. Enfin, nous présentons des images vidéo en 3D de cellules CD4 + naïves T présentant motilité état stationnaire à 37 ° C.

Deux photons d&#39;imagerie a permis de découvrir la motilité des lymphocytes et les interactions cellulaires dans le ganglion dans des conditions basales et pendant une réponse immunitaire 1. Ici, nous démontrons le transfert adoptif de lymphocytes T, l&#39;isolement des ganglions lymphatiques, et la motilité imagerie des cellules T CD4 + dans les ganglions lymphatiques retirés.

Dissection et 2-Photon Imaging des ganglions lymphatiques périphériques chez les souris

L'imagerie biphotonique a révélé une chorégraphie élégante de la motilité et des interactions cellulaires au sein du ganglion lymphatique dans des conditions basales et lors de...

Bonjour, je m'appelle Melanie Matthew. Je viens du laboratoire de Micah Helen à l'Université de Californie à Irvine. Aujourd'hui, nous allons prélever des ganglions lymphatiques chez une souris en vue d'une imagerie photonique in situ.Cela consiste à retirer les ganglions lymphatiques inguinaux, les ganglions lymphatiques axillaires et les ganglions lymphatiques cervicaux. Les six ganglions lymphatiques périphériques facilement accessibles chez la souris afin d'obtenir des cellules fluorescentes dans les ganglions lymphatiques de nos souris. Pour réaliser une imagerie par microscopie biphotonique, nous devons d'abord effectuer un transfert adoptif de cellules marquées au fluorochrome.Pour cette expérience, je vais d'abord vous montrer le transfert adoptif. Voici notre seringue à insuline de calibre 28. Je vais la charger avec des cellules.D'abord, je veux déboucher la seringue pour qu'elle coule facilement. Ensuite, je vais charger soigneusement les cellules. J'essaierai au mieux de ne pas toucher les parois du tube avec la seringue à insuline, car cela émousserait la seringue et rendrait plus difficile l'injection dans la veine caudale de la souris.S'il y a des bulles d'air, vous devez les chasser en les tapotant, pour les écarter. Tapez-les pour les déloger ici. Voilà, c'est fait.Nous sommes maintenant prêts à injecter ces cellules dans la veine caudale. Très bien, voici notre souris C57 black six. Nous allons la guider lentement et délicatement vers l'injecteur de la veine caudale.Beaucoup de souris n'apprécient pas cela, mais cela les empêche de sauter pendant l'injection proprement dite, ce qui pourrait leur causer davantage de blessures ou entraîner une piqûre d'aiguille pour vous. Ainsi, vous fixez lentement la souris à l'intérieur. Ensuite, vous recherchez la veine caudale le long des côtés de la queue de la souris.Une grande artère passe donc le long du dessus. De chaque côté de la queue de la souris, il y a deux belles veines longues qui descendent jusqu'au bout.Vous prenez alors votre aiguille et commencez vers la base de la queue en cherchant une veine. Je peux en voir une juste ici. Je vais humidifier légèrement la zone avec de l'éthanol, ce qui peut permettre de mieux visualiser la veine.Très bien, nous allons maintenant injecter la veine de la queue, et il est important de maintenir l'aiguille avec le biseau vers le haut, c'est-à-dire l'extrémité ouverte de l'aiguille orientée vers le haut. Il faut ensuite avancer presque parallèlement à la queue.Vous ne devez pas pénétrer en oblique car les veines se trouvent juste en surface. Vous souhaitez simplement faire glisser lentement l'aiguille dans la veine de la queue. En procédant ainsi, avec un peu d'expérience, vous devriez pouvoir sentir quand elle pénètre.Mais les premières fois, vous voulez pousser le liquide et vérifier s'il y a une résistance. S'il n'y a aucune résistance, vous êtes dans la veine caudale et vous pouvez effectuer une injection rapide et facile, comme je viens de le faire. Ensuite, vous pouvez retirer lentement l'aiguille.Une autre confirmation que vous êtes dans la veine est la présence d'une petite bulle de sang due au reflux. Ainsi, l'apparition d'un léger reflux sanguin au niveau du site d'injection confirme que vous vous trouviez bien dans la veine de la queue. De plus, la souris devrait cesser de saigner peu de temps après votre injection.Voici donc notre souris black six. Nous allons prélever les ganglions lymphatiques de la souris au niveau des flancs inguinaux, ici, ainsi que sous l'aisselle, là où se trouvent les ganglions axillaires, de ce côté-ci et de l'autre côté. Puis les ganglions cervicaux superficiels, situés ici au niveau de la gorge, un de chaque côté.Bonjour. Nous sommes maintenant prêts à disséquer notre souris. Je vais commencer par piquer la souris sur cette planche, la planche de dissection. Allez-y et fixez simplement la pause. Oui.Vous voulez vous assurer qu'il s'agit d'une fixation solide. Cela nous permettra d'exposer plus facilement les ganglions lymphatiques périphériques. J'ai donc l'habitude d'épingler les quatre pattes vers le bas.Je ne m'inquiète pas de la queue. Certaines personnes aiment aussi pincer la queue. Ensuite, afin d'éviter que les poils ne pénètrent dans la zone que nous disséquons et ne se répandent sur nos ganglions lymphatiques et nos instruments, nous vaporisons du mouse avec de l'éthanol à 70 %.Et maintenant que la souris est anesthésiée à l'éthanol, je vais pratiquer une incision médiane. Pour cela, j'écarte le pelage du corps. Comme vous pouvez le voir, je peux soulever la peau et former une petite tente.Et cela vous empêchera de couper le péritoine, ce que vous ne voulez pas faire dans ce cas. Très bien, je vais commencer par mon incision médiane ici. Je fais une petite coupure et je m'assure de ne pas pénétrer dans le péritoine.On peut voir qu'il y a le péritoine en dessous. Je glisse ma paire de ciseaux sous l'incision et je progresse lentement en séparant la peau du péritoine, en effectuant de petites coupures au fur et à mesure, car nous allons prélever les ganglions lymphatiques cervicaux. Je vais couper jusqu'à la ligne de la mâchoire de la souris très prudemment et lentement, en veillant à ne pas toucher de vaisseaux sanguins importants.Ensuite, comme nous prélevons les ganglions lymphatiques inguinaux, situés dans la partie inférieure du lambeau cutané, je vais pratiquer une incision médiane jusqu'au niveau de la queue, à la base de celle-ci. Voilà. Nous avons maintenant une incision médiane qui conviendra.Maintenant, je vais séparer la peau du péritoine. Je vais procéder délicatement avec une pince en tirant la peau vers l'extérieur, loin du péritoine, au fur et à mesure. Et j'expose le premier ganglion lymphatique que nous allons disséquer.Voici le ganglion lymphatique inguinal situé ici dans le lambeau cutané inférieur. Maintenant que j'ai écarté un lambeau de peau du corps principal de la souris, je vais le fixer afin d'exposer le ganglion lymphatique inguinal. Cette exposition améliorée du ganglion lymphatique inguinal nous permettra de le disséquer proprement.Ici, nous avons le ganglion lymphatique inguinal exposé après fixation. On le trouve généralement dans le lambeau de peau, juste au-dessus de la patte. On peut le localiser en repérant la jonction en forme de Y des vaisseaux sanguins qui passent au-dessus.Et voilà. Il est niché avec un peu de tissu adipeux et les vaisseaux sanguins qui courent au-dessus. Très bien, maintenant je vais retirer le ganglion lymphatique inguinal.Je gratte les pinces de chaque côté du ganglion lymphatique pour l'écarter de la graisse. Nous ne voulons aucune graisse. Avec notre imagerie à deux photons, cela obscurcirait la pénétration du laser dans le tissu.Voyons voir. Il est important de séparer entièrement la graisse du ganglion lymphatique tout en conservant intacte la corticale du ganglion lymphatique. Très bien, c'est fait.Voici donc notre ganglion lymphatique de iena. Je vais le placer dans notre milieu, et la meilleure façon de vérifier que tout le tissu adipeux a été retiré consiste à observer si le ganglion s'enfonce. Une fois placé dans le milieu, il doit descendre directement au fond.S'il y a de la graisse, elle flottera. Très bien, maintenant je vais retirer le ganglion lymphatique auxiliaire. Il se situe dans l'aisselle de la souris, juste le long d'un vaisseau sanguin majeur.Parfois, cela peut être délicat, car vous risquez d'avoir beaucoup de saignement qui masquera le ganglion. Mais je vais vous montrer ce que je fais, et j'espère que nous n'aurons pas de saignement cette fois-ci. Tout d'abord, j'écarte le lambeau de peau, puis je désinsère effectivement l'avant-bras à côté du ganglion que je souhaite prélever.Cela me permet de détacher la peau avec plus d'habileté à l’aide de mes doigts, tout en maintenant ce muscle qui passe au-dessus de l’aisselle, ce qui devrait faire apparaître un ganglion axillaire avec un léger tiraillement. Et je vais le chercher maintenant. Et le voilà.Il se trouve juste là, dans l'aisselle, le long d'un vaisseau sanguin important. Je vais maintenant disséquer le ganglion axillaire, et vous pouvez repositionner la peau avec des épingles ou la maintenir avec les doigts, selon ce qui vous semble le plus confortable. Mais j'aime travailler avec précaution dans cette zone.Il y a très peu de graisse autour de ce ganglion lymphatique, ce qui le rend approprié pour l'imagerie, mais il est situé à proximité d'un vaisseau sanguin important, de sorte que vous pouvez parfois les perdre si vous n'êtes pas prudent. Ainsi, pour le ganglion axillaire, je saisis le tissu conjonctif qui l'entoure et je le sépare lentement des vaisseaux sanguins. Et voilà, c'est fait.Voici notre ganglion axillaire. Il est juste là. C'est un beau ganglion lymphatique long et plat.Et je tiens un petit morceau du tissu conjonctif restant sur le côté du ganglion pour ne pas endommager le ganglion lui-même. Nous allons procéder à l'imagerie afin de maintenir les ganglions lymphatiques hydratés. Avant notre imagerie ex vivo, nous les plaçons dans un milieu indépendant du CO2, dans des chambres individuelles, afin de pouvoir distinguer les ganglions lymphatiques inguinaux, axillaires et cervicaux.La manière de savoir si vous avez bien préparé un ganglion lymphatique consiste à observer s’il coule au fond après sa dissection. Cela signifie qu’il contient très peu de graisse. Maintenant, je vais retirer le ganglion lymphatique cervical, le cervical superficiel.Et je fais cela, je commence par repiquer à partir du moment où j'ai retiré le ganglion axillaire, afin d'exposer un peu mieux le tissu cervical. Les ganglions lymphatiques cervicaux se trouvent près des muscles de la mâchoire de la souris, en réalité le long du côté.Il s'agit des mêmes ganglions lymphatiques que vous pouvez sentir lorsque vous êtes malade. Ce sont ceux-ci que votre médecin palpera en cas de rhume. Pour ce faire, j'aime généralement insérer mon doigt sous le tissu afin de le tirer légèrement vers l'avant tout en faisant glisser mes forceps le long du côté.Je devrais avoir un ganglion lymphatique qui ressort. Ah, le voilà. Il est là-haut dans le tissu.Le voilà. Il s'agit donc d'un ganglion cervical superficiel. Vous devez faire attention à ne pas prélever les glandes salivaires.Vous ne trouverez aucune cellule T dans vos glandes salivaires. Et ces ganglions lymphatiques particuliers contiennent des cellules T positives pour le CD4 marquées au CFSC. Nous allons donc vous montrer quelques vidéos en situation montrant ces cellules T en mouvement dans le tissu.Très bien, je vais maintenant coller le ganglion lymphatique sur une lame de couverture en plastique incassable afin de le fixer au fond de notre plateau d'imagerie insitu. Cela permettra d'éviter tout mouvement du tissu ou toute dérive pendant l'acquisition des images des cellules T. J'ai donc ici mes lames de couverture en plastique incassable.La première chose que je vais faire est de découper l'un d'eux à la bonne taille pour notre ganglion lymphatique. Je prends donc mes ciseaux et je découpe un petit carré ici. Bon, maintenant je vais appliquer de la colle dessus.C'est un peu de colle. Étalez-la sur la partie de la lame que nous avons découpée. Ensuite, je vais prendre un essuie-tout et absorber une partie de la colle.Ceci est une colle qui va recouvrir le ganglion. Nous voulons simplement une couche très fine afin qu'elle n'obscurcisse pas l'imagerie. Je vais ensuite sortir un ganglion lymphatique de la solution.Nous allons donc commencer avec notre premier ganglion lymphatique ici, prélevé du milieu. Vous devez être délicat avec celui-ci. Vous ne devez pas endommager le cortex du ganglion.Je vais saisir uniquement le bord du ganglion et le coller sur la lame en posant délicatement d'abord le coin du ganglion lymphatique sur la lame, puis en tirant le ganglion le long de la lame pour le fixer solidement. J'ai donc utilisé ce tout petit fragment de tissu adipeux restant sur le bord du ganglion pour effectuer cette manipulation. Ainsi, je n'endommage pas le cortex du ganglion.Je prends ensuite le ganglion lymphatique et, afin de fixer la colle, je vais le plonger dans le même puits d'où je l'ai prélevé. Je vais donc le retourner et le plonger délicatement dans le milieu, transportant toute la colle. Retirer un peu de la colle exo qui s'est fixée avec lui.Voilà. Nous avons maintenant un ganglion lymphatique préparé pour l'imagerie à deux photons. C'est ainsi que l'on prépare les ganglions lymphatiques pour l'imagerie in situ à deux photons.Nous allons maintenant les transférer vers notre microscope, l'installer et obtenir de superbes images des lymphocytes T que nous avons transférés de façon adoptive. Ici, nous observons des lymphocytes T marqués au CFSE en mouvement à l'intérieur d'un ganglion lymphatique inguinal. Cette vidéo est accélérée d'environ 500 fois et l'on peut constater que les cellules sont très mobiles.Ils sont grossis d'environ 20 x grâce à notre objectif à immersion dans l'eau de 20 x. Ceci est simplement un exemple de déplacement des cellules T uniquement. Nous n'avons rien fait pour colorer les cellules environnantes.Typiquement, dans des expériences plus avancées à deux photons, vous pouvez observer des cellules dendritiques marquées interagissant avec des cellules B marquées, des cellules T et des cellules NK marquées. Vous pouvez étiqueter presque n'importe quel type cellulaire que vous vous attendez à trouver à l'intérieur du ganglion lymphatique et procéder à son imagerie. Voilà donc le protocole d'imagerie du ganglion lymphatique de notre institut.

dissection-and-2-photon-imaging-of-peripheral-lymph-nodes-in-mice

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous présentons, étape par étape les instructions pour la génération des chimères néonatale ainsi que la dissection et la préparation du thymus pour l'imagerie ex vivo par microscopie biphotonique 2.

Dans l&#39;imagerie in situ de la souris en utilisant deux Thymus microscopie biphotonique

Ce protocole décrit une méthode pour imager des cellules T fluorescentes introduites dans les tranches de ganglions lymphatiques. La technique permet en temps réel des analyses de la migration des cellules T avec grand champ traditionnel fluorescence ou microscopie confocale.

Ex vivo l&#39;imagerie de cellules T dans murin tranches avec des ganglions lymphatiques et la microscopie confocale Widefield

Nous avons développé des outils de laboratoire roman et de protocoles pour l'acquisition d'imagerie intravitale du thymus. Notre technique devrait aider à l'identification de «niches» dans le thymus où le développement des cellules T se produit.

Imagerie intravitale du Thymus souris utilisant la 2-microscopie biphotonique

Les progrès récents dans la microscopie 2-photons ont permis en temps...

Imagerie intravitale du ganglion lymphatique poplité souris

Les techniques d'imagerie développées récemment en utilisant la fluorescence dans le proche infrarouge (NIRF) peut aider à élucider le rôle du système lymphatique joue dans les métastases du cancer, la réponse immunitaire, la cicatrisation des plaies, et d'autres maladies associées lymphatique.

Non invasive d&#39;imagerie optique du système vasculaire lymphatique d&#39;une souris

Cette vidéo montre une technique de dissection pour prélever des ganglions lymphatiques poplités drainants sur les pattes arrière de la souris. Les ganglions lymphatiques jouent un rôle essentiel dans le rapprochement de l’immunité innée et adaptative, et la récolte de ganglions lymphatiques intacts – avec une structure tissulaire et une viabilité cellulaire préservées – peut aider à étudier les réponses immunitaires locales et systémiques.

Méthode de dissection pour prélever des ganglions lymphatiques drainants poplités murins pour l’imagerie ex vivo

Haute résolution intravitale imagerie avec un contraste accru jusqu'à 120 um de profondeur dans les ganglions lymphatiques de la souris adulte est obtenue en modulant spatialement le modèle d'excitation d'un multi-focal microscope à deux photons. En 100 profondeur pm nous avons mesuré des résolutions de 487 nm (latéraux) et 551 nm (axial), contournant ainsi les limites de diffusion et de diffraction.

Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

Ce protocole décrit une technique pour imager différentes populations de cellules dans les ganglions lymphatiques drainants sans altérations dans la structure d'organe.

Visualisation de la structure des ganglions lymphatiques et de la localisation cellulaire à l'aide de la microscopie confocale ex-Vivo

Un protocole est présenté combinant la compensation de tissu avec la microscopie de fluorescence de feuille de lumière (LSFM) pour obtenir des images tridimensionnelles et de résolution cellulaire des vaisseaux lymphatiques et des ganglions lymphatiques (LNs) recueillant le fluide céphalo-rachidien (CSF) et le fluide épidural spinal.

Imagerie tridimensionnelle de la vascularisation lymphatique vertébrale et du drainage à l’aide d’iDISCO+ et de la microscopie de fluorescence des feuilles légères

Le manuscrit démontre une méthode innovante pour l’étude in vivo de la contractilité des vaisseaux lymphatiques cervicaux et du flux lymphatique chez la souris, afin de tester diverses fonctions physiologiques des vaisseaux lymphatiques cervicaux (cLV) et des stratégies thérapeutiques pour la modulation des mécanismes régulateurs lymphatiques du drainage et du dégagement cérébraux.

Installation reproductible pour l’imagerie à deux photons in vivo de la contractilité des vaisseaux lymphatiques cervicaux et du flux lymphatique chez la souris

Ici, un protocole est présenté pour évaluer les vaisseaux lymphatiques méningés (MLV) de la souris, qui jouent un rôle important dans de multiples maladies neurologiques. L’objectif de ce protocole est de fournir une méthode intégrée permettant à la fois l’évaluation fonctionnelle du drainage des traceurs et la caractérisation morphologique détaillée du réseau dorsal des MLV.

Protocole intégré pour l’évaluation des lymphatiques méningées : injection de cisterna magna, imagerie des ganglions lymphatiques, dissection méningée et coloration totale

Découvrez la dissection et l'imagerie deux-photons des ganglions lymphatiques périphériques chez la souris. Cette méthode permet de visualiser la motilité des cellules T CD4+ in vivo pour étudier les réponses immunitaires.

Dissection et 2-Photon Imaging des ganglions lymphatiques périphériques chez les souris

Explorer plus de vidéos