Name: Étiquetage des cellules Lineage Zebrafish avec laser Uncagable dextran fluorescéine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Découvrez le marquage cellulaire par déverrouillage laser UV de fluoresceïne cagée chez l'embryon de zèbre. Cette méthode permet de tracer les lignées cellulaires en développement avec une précision spatiale et temporelle optimale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier Dan Carlin pour aider à faire la fluorescéine en cage. En outre, nous tenons à remercier les sources de financement suivantes: Programme de l&#39;Université Vanderbilt Medical School pour Grant Biologie formation de perfectionnement à la JAC, et les NIH HD054534to JTG.

1. Synthèse de la cage fluorescéine dextrane <ol><li> Mesurer 3,5 à 4 mg de aminodextrane et ajouter dans le tube Invitrogen fournis teintées contenant 1 mg de CMNB-cage SE fluorescéine. Dans nos mains ce ratio donne une moyenne de chargement de ~ 2,5 molécules de colorant par le dextran. </li><li> Ajouter 500 ul de 0,1 M Na 2 B 4 O 7 tampons (borate de sodium) dans le tube. </li><li> Cap et le vortex pendant 30 secondes pour dissoudre le aminodextrane et la fluorescéine en cage. </li><li> Laissez réagir toute la nuit sur un mélangeur vortex. </li><li> Dévissez la fermeture de fond sur une colonne spin Zeba et desserrer le bouchon. Marquer un point sur la colonne avec un stylo-feutre. Colonne de la Place dans un tube de 15 ml conique. </li><li> Centrifuger à 1000 xg pendant 2 minutes avec le point face au centre du rotor. Utiliser la colonne immédiatement après compactage. </li><li> Placer la colonne compactée dans une nouvelle de 15 ml tube conique. </li><li> Mélange réactionnel piscine et le transfert vers le centre du lit de résine colonnes compactées. Remettre le bouchon. </li><li> Centrifuger à 1000 xg pendant 2 minutes avec le point face au centre du rotor. Après le spin, l'éluant et le haut de la colonne sera à peu près la même nuance de couleur jaune. </li><li> Transfert de l'éluant jaune (~ 350 pi) dans un tube à centrifuger de 1,5 ml. </li><li> Lyophiliser à sec dans une speedvac. Couvrir le speedvac papier d'aluminium. </li><li> Re-suspendre le résultant ~ 2-3 mg de mousse jaune pâle dans l'eau à une concentration finale de 1% p / v. </li><li> Conserver cette solution à -20 ° C dans du papier recouvert de tubes. C'est une bonne idée de partie aliquote de la solution de dextrane pour empêcher congélation-décongélation répétés. </li></ol> 2. L'injection de fluorescéine Caged Dextran dans des embryons de poisson zèbre <ol><li> Diluer à 1% p / v stock de cage 01h05 fluorescéine dextran ou 01h10 dans KCl 0,2 M. </li><li> Injecter 0,5 - 1.0nL de solution de fluorescéine en cage dans un jaune d'embryons au stade de cellule à l'aide d'un injecteur à pression. Une fois injecté, embrayages d'embryons doivent être maintenus dans l'obscurité à 28,5 ° C pour réduire la non-spécifiques uncaging. </li><li> Supprimez manuellement chorions à partir d'embryons. </li><li> Anesthetize embryons dans 4% tricaïne. </li><li> Les embryons seront montés dans agarose à 0,8% dans la boîte de Petri 35mmx10mm, puis recouverte d'eau d'œuf. </li><li> Equilibrer fondue agarose dans 50 blocs ° C chaleur pendant au moins 15 minutes. </li><li> En utilisant une pipette en verre, d'élaborer un embryon dans un minimum d'eau et de le libérer dans l'agarose. Remarque: Il est important de refroidir le tube d'agarose dans votre main pendant environ 30 secondes avant de mettre l'embryon dans le tube pour éviter tuer l'embryon. </li><li> Pipeter l'embryon dans le tube, avec environ 50 pl d'agarose et éjecter le contenu sur le centre de la boîte de Pétri. </li><li> Vite orienter l'embryon à l'aide d'un fil en plastique avec les cellules à Uncaged vers le haut. Remarque: Le agarose refroidir rapidement afin d'être précipitée orientant l'embryon. Les embryons peuvent être endommagés si manipulé après la agarose devient rigide. </li><li> Laisser l'agarose solidifier complètement (cela prend quelques minutes) et remplir les deux tiers vaisselle avec de l'eau d'œuf contenant 4% tricaïne et PTU 0,003%. </li></ol> 3. Laser Uncaging de fluorescéine dextrane <ol><li> Le microscope utilisé pour uncaging doit avoir un objectif 40X d'eau par immersion. </li><li> Nous utilisons un laser photonique Instruments avec la cellule de teinture de 365 nm et 70% / 30% miroir fractionné dichroïque. </li><li> Avant uncaging, le laser doit être faite parfocale avec l'objectif et atténué à la puissance appropriée. </li><li> Pour concentrer le laser, placer une lame de verre en miroir sous l'objectif et de se concentrer l'objectif jusqu'à ce rayures dans la diapositive sont visibles. </li><li> Ajuster au laser atténuateur jusqu'à ce que le laser peut produire une rayure visible dans le miroir avec une seule impulsion. </li><li> Ajustez le point de vue objectif de haut en bas. Si le laser peut produire une égratignure lorsque l'objectif est hors de discussion, ajuster la focalisation du laser ¼ de tour vers le haut ou vers le bas. Répétez jusqu'à ce que le laser peut rayer le miroir seulement lorsque l'objectif est focalisé. </li><li> Placez montée embryon titre de l'objectif et se concentrer sur la zone à Uncaged. </li><li> Pour uncage, se concentrer sur une cellule d'intérêt et d'impulsion de l'10-20 fois à 2-3 Hz. </li><li> Après uncaging, sans l'embryon par déroulage agarose loin avec une pince et en les mettant dans de l'eau contenant des oeufs PTU 0,003%. Laissez les embryons se développent dans une boîte étanche à la lumière jusqu'à ce qu'ils soient fixes. </li></ol> 4. Marquage de l'anticorps et la détection des Uncaged fluorescéine dextrane <ol><li> Fixer des embryons dans Ab fixateur (paraformaldéhyde à 4%, 0,3 CaCl2, 8% de saccharose, phosphate 1X saline tamponnée, pH 7,3) pendant deux à quatre heures à température ambiante (RT) ou toute la nuit (O / N) à 4 ° C. Gardez embryons dans une boîte étanche à la lumière ou la papillote tube pour toutes les mesures d'étiquetage. </li><li> Retirer fixateur et le remplacer par du MeOH 100%, laisser reposer 10 minutes à température ambiante, enlever MeOH et remCE avec MeOH 100% frais. </li><li> Conserver dans MeOH à -20 ° C pendant au moins 30 minutes. Note: Vous pouvez stocker dans MeOH pour un maximum de deux semaines avant épitopes commencent à se dégrader. </li><li> Réhydrater embryons avec lavages de 5 minutes à température ambiante de phosphate MeOH/1X 75% saline tamponnée avec 0,1% de Tween 20 (1X PBSTw), puis 50% 1XPBTw MeOH/50%, puis 25% MeOH/75% 1X PBSTw. </li><li> Laver trois fois pendant 5 minutes dans 1XPBSTw. </li><li> Si les embryons sont&gt; 24 heures, permiabilize embryons avec 10 ug / ml de protéinase K dans 1XPBSTw. Le temps est dépendant Permiabilization sur scène. Cinq minutes de la protéinase K est suffisante si les embryons sont entre 24 et 48 heures après la fécondation (HPF). Plus de temps peut être nécessaire si des larves plus âgées. Re-fixer dans Ab fixateur pendant 20 minutes à température ambiante </li><li> Lavez cinq fois pendant 5 minutes dans 1XPBSTw à température ambiante. </li><li> Incuber dans une solution de bloc (1XPBS, Triton X100 à 0,1%, 10% de sérum de moutons, 10% d'albumine de sérum bovin, 1% de diméthylsulfoxyde) pendant 1-2 heures à température ambiante. </li><li> Diluer anticorps primaire (anti-fluorescéine ainsi que des anticorps contre un type de cellule des marqueurs spécifiques) dans une solution de blocage. </li><li> Incuber embryons O / N à 4 ° C dans une solution contenant des anticorps primaires. </li><li> Laver quatre fois pendant 20 minutes dans 1XPhosphate saline tamponnée avec du Triton X100 à 0,1% (PBSTx) à température ambiante. </li><li> Diluer fluorescence des anticorps secondaires marqués (généralement 1:300) dans une solution de blocage. </li><li> Incuber O / N à 4 ° C dans une solution contenant des anticorps secondaires. </li><li> Laver quatre fois pendant 20 minutes dans 1XPBSTx à température ambiante. </li><li> Embryons Clear 1XPBS 50% glycerol/50% pour au moins deux heures à température ambiante, puis retirez le glycérol / PBS et ajouter le mélange de glycérol à 100% et laisser reposer O / N à 4 ° C. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Après immunomarquage, il devrait y avoir une zone enrichie d'une coloration dans les cellules qui ont été Uncaged (Figure.1). Il n'est pas rare de voir un signal relativement élevé par rapport au bruit de&gt; 48 heures zebrafish vieux, à cause de uncaging spontanée de la fluorescéine. <img src="/files/ftp_upload/2672/2672fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Étiquetage du poisson zèbre Lineage pinéale complexes. A 24 HPF, une partie de l'ébauche antérieure pinéale, indiqué par foxd3:. Expression de la GFP, a été Uncaged utilisant des impulsions laser UV A) Par 48hpf, un cluster du côté gauche de cellules appelées les parapineal (cercle rouge) a émergé de la Uncaged domaine (cercle blanc). B) Uncaged signal de la fluorescéine est enrichi en parapineal (cercle rouge) et la glande pinéale (cercle blanc).

<ol><li>Hatada, Y., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fate+map+of+the+epiblast+of+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A fate map of the epiblast of the early chick embryo.</a> Development. 120, 2879-2889 (1994).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122, 300-319 (1987).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+Precursors+Can+Give+Rise+to+All+Major+Cell-Types+of+the+Frog+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina.</a> Science. 239, 1142-1145 (1988).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+fluorescent+tracers+to+study+neural+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages.</a> Development. , Suppl 2. 1-8 (1991).</li>
<li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuC%3AKaede%2C+a+useful+tool+to+label+neural+morphologies+in+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo.</a> Genesis. 44, 136-142 (2006).</li>
<li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+Fluorescent+Probes+and+Research+Chemicals%22">Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals</a>. , 9th Edition, 707-711 (2002).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+%28caged%29+fluorescein+as+a+cell+tracer+for+fate+mapping+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientation+of+first+cleavage+in+the+sea+urchin+embryo%2C+Lytechinus+variegatus%2C+does+not+specify+the+axes+of+bilateral+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry.</a> Dev Biol. 175, 177-183 (1996).</li>
</ol>

Tel que décrit, ce protocole fournit une méthode relativement rapide lignée étiquetage du poisson zèbre qui est construit sur les techniques couramment utilisées de microinjection, microscopie, et immunofluorescence. Nous avons trouvé que le laser uncaging d&#39;être le moyen le plus efficace et rentable de uncage fluorescéine de manière localisée. Cette méthode pourrait être utilisée pour étiqueter la lignée avec les terminaux expérimentale aussi tard que 4 dpf. Cependant, comme les cellules se divisent, la concentrati...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2672">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran</a>. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to: Ilya A. Shestopalov and James K. Chen instead of: Ilya Shestopalov and James Chen

A correction to the article Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran was made.

Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

<table><tbody><tr><td>CMNB-fluorescéine SE piégée</td><td>Invitrogen</td><td>C20050</td><td></td></tr><tr><td>Aminodextrane, 10 kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1860</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de désalinisation Zeba à rotation</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89889</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-fluorescéine de chèvre</td><td>Invitrogen</td><td>A11095</td><td></td></tr><tr><td>anticorps Alexa Fluor 633 de âne anti-chèvre</td><td>Invitrogen</td><td>A21082</td><td></td></tr><tr><td>boîtes de Pétri 35 mm x 10 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>microscope composé droit équipé d'un objectif à immersion dans l'eau 40x</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM6000B</td><td></td></tr><tr><td>Système d'illumination laser manuel MicroPoint</td><td>Photonic Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phénylthiourea (PTU)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Roche Group</td><td>03115836991</td><td></td></tr><tr><td>fil plastique</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Savant SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur vortex</td><td>VWR international</td><td>Vortex Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>injecteur sous pression</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr></tbody></table>

Étiquetage des cellules lineage zebrafish avec laser uncagable dextran fluorescéine

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Un problème central dans la biologie du développement est de déduire l&#39;origine de la myriade de types de cellules présentes dans les vertébrés à mesure qu&#39;ils surviennent à partir de précurseurs indifférenciés. Les chercheurs ont utilisé diverses méthodes d&#39;étiquetage lignée, tels que l&#39;étiquetage DiI 1 et l&#39;injection sous pression d&#39;enzymes traçable 2 à déterminer le destin des cellules à des stades ultérieurs de développement dans des systèmes modèles. Les cartes sort d&#39;abord dans le poisson zèbre (Danio rerio) ont été assemblés par injection iontophorétique de colorants fluorescents, tels que la rhodamine dextrane, dans des cellules individuelles dans des régions discrètes de l&#39;embryon et le traçage le sort de la cellule marquée au cours du temps 3-5. Bien qu&#39;ils soient efficaces, ces méthodes sont techniquement exigeantes et nécessitent un équipement spécialisé ne trouve pas couramment dans les laboratoires de poisson zèbre. Récemment, photoconvertable protéines fluorescentes, comme Eos et Kaede, qui irréversiblement passer du vert au rouge lorsque la fluorescence est exposé aux ultraviolets, voient une utilisation accrue chez le poisson zèbre 6-8. La clarté optique de l&#39;embryon de poisson zèbre et la facilité relative de la transgénèse ont fait de ces outils particulièrement attrayant pour l&#39;étiquetage lignée et d&#39;observer la migration des cellules in vivo 7. Malgré leur utilité, ces protéines ont quelques inconvénients par rapport aux colorants médiée par des méthodes d&#39;étiquetage lignée. La plupart des cruciale est la difficulté que nous avons trouvés dans l&#39;obtention de 3-D haute résolution pendant photoconversion de ces protéines. Dans cette perspective, peut-être la meilleure combinaison de résolution et de facilité d&#39;utilisation pour l&#39;étiquetage de la lignée dans le poisson-zèbre se sert de cage fluorescéine dextrane, un colorant fluorescent qui est lié à un groupe de trempe qui masque ses 9 fluorescence. La teinture peut alors être &quot;Uncaged&quot; (publié par le groupe de la trempe) dans une cellule spécifique en utilisant la lumière UV d&#39;une lampe laser ou le mercure, permettant la visualisation de sa fluorescence ou immunodétection. Contrairement aux méthodes d&#39;iontophorèse, la fluorescéine cage peut être injecté à des appareils d&#39;injection standard et Uncaged avec un microscope à épifluorescence équipé d&#39;un trou d&#39;épingle 10. En outre, les anticorps contre la fluorescéine ne détecter que le formulaire en liberté, et l&#39;épitope de fixation ainsi survit 11. Enfin, la fluorescéine en cage peuvent être activées à très haute résolution en 3-D, en particulier si la microscopie à deux photons est utilisée 12,13. Ce protocole décrit une méthode d&#39;étiquetage par la lignée de fluorescéine en cage et uncaging laser. Subsequenctly, uncaged fluorescéine est détectée simultanément avec les autres épitopes telles que la GFP en marquant avec des anticorps.

Ce protocole définit un moyen d&#39;étiqueter et de tracer le destin de petits groupes de cellules du poisson zèbre en utilisant UV-uncaging de fluorescéine en cage, suivi par l&#39;ensemble de montage immunomarquage pour amplifier le signal de la fluorescéine Uncaged.

Étiquetage des cellules Lineage Zebrafish avec laser Uncagable dextran fluorescéine

Un problème central en biologie du développement consiste à déduire l'origine de la myriade de types cellulaires présents chez les vertébrés alors qu'ils dérivent de cellules indifférenciées...

L'objectif général de cette procédure est d'étiqueter les cellules selon leur lignée dans un embryon de poisson zèbre. Cette opération est réalisée en synthétisant d'abord du fluorescéine piégé, puis en l'injectant dans les embryons de poisson zèbre. Les embryons sont ensuite montés dans de l'agarose afin que les cellules à étiqueter soient accessibles.Ensuite, un laser UV est utilisé pour activer la fluorescéine piégée dans des cellules sélectionnées de l'embryon. Enfin, les embryons sont récoltés une fois qu'ils ont atteint le stade désiré, et les cellules marquées sont détectées par rapport à des marqueurs de lignées particulières. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent le destin des cellules sélectionnées dans les embryons grâce à la photo-activation et à la microscopie immunofluorescente.L'avantage principal de cette technique par rapport aux techniques existantes, telles que la photoconversion de Cade, est que l'immunofluorescence multicolore permet de détecter la fluorescéine démasquée en plus d'autres anticorps spécifiques aux liaisons cellulaires. Pour injecter du dextran de fluorescéine cagée dans des embryons de poisson zèbre, commencez par le syn

lineage-labeling-zebrafish-cells-with-laser-uncagable-fluorescein

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ce protocole décrit l'imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

La clé de la compréhension des processus morphogénétiques qui façonnent l'embryon précoce est la capacité de cellules d'image à haute résolution. Nous décrivons ici une technique de marquage des cellules individuelles ou de petits amas de cellules dans des embryons de zebrafish entier avec membrane cible protéine fluorescente verte.

L&#39;étiquetage et l&#39;imagerie des cellules dans le cerveau postérieur Zebrafish

Cellules qui meurent sont extrudés à partir des tissus épithéliaux par la contraction concertée des cellules voisines, sans perturber la fonction de barrière. La clarté optique de développement du poisson zèbre offre un excellent système pour visualiser l'extrusion dans la vie épithéliums. Nous décrivons ici les méthodes d'induire et d'extrusion d'image dans l'épiderme zebrafish larvaire à une résolution cellulaire.

Imagerie cellulaire en direct d&#39;extrusion de l&#39;épiderme du poisson zèbre développement

Une méthode est décrite pour photoactiver cellules individuelles contenant une protéine fluorescente utilisant cage absorption à deux photons à partir d'un Ti: saphir oscillateur laser femtoseconde. Pour mapper le destin de la cellule photoactivé, l'immunohistochimie est utilisée. Cette technique peut être appliquée à n'importe quel type de cellule.

Simple cartographie du destin cellulaire chez le poisson zèbre

Fonction-Spacer-lipidique (FSL) des constructions permettent les caractéristiques de surface des cellules vivantes et des virions d'être modifiée sans perte de vitalité. La méthode nécessite seul contact simple de construire une solution avec une cellule de FLS / virion et l'incorporation de surface spontanée et stable se produit.

Construit en FLS: une méthode simple pour la modification des cellules / Virion surfaces avec une gamme de marqueurs biologiques sans affecter leur viabilité

Le développement de poisson zèbre peut être suivie au fil des jours avec la microscopie nappe de lumière lorsque les embryons sont incorporés dans des tubes de polymères optiquement transparents à faible concentration d'agarose.

Multicouche de montage pour à long terme Fiche microscopie optique de poisson zèbre

L’imagerie du comportement dynamique des organites et d’autres structures subcellulaires in vivo peut faire la lumière sur leur fonction dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous présentons des méthodes de marquage génétique de deux organites, les centrosomes et les mitochondries, et d’imagerie de leur dynamique dans des embryons de poisson-zèbre vivants à l’aide de la microscopie à grand champ et confocale.

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

Les manipulations ciblées pour provoquer un stress dirigé ou la mort dans des cellules individuelles ont été relativement difficiles à réaliser. Ici, une approche d’ablation à résolution cellulaire unique pour stresser et tuer sélectivement des cellules individuelles dans des cultures cellulaires et des animaux vivants est décrite sur la base d’un laser UV confocal standard.

Déclenchement Stress cellulaire et la mort Utilisation conventionnelle UV Laser Microscopie confocale

Développement de cils est vitale pour l’organogenèse appropriée. Ce protocole décrit une méthode optimisée pour étiqueter et de visualiser les cellules ciliées du poisson-zèbre.

Visualisation des cellules multiciliées dans le poisson-zèbre à travers un protocole combiné de toute monture Fluorescent In Situ hybridation et Immunofluorescence

L’ablation au laser est une technologie largement applicable pour étudier la régénération dans les systèmes biologiques. Le protocole présenté décrit l’utilisation d’un microscope confocal standard de laser-balayage pour l’ablation de laser et la formation image time-lapse suivante des cellules interuromast régénérantes dans la ligne latérale de zebrafish.

Essai confocal d’ablation et de régénération au microscope dans les cellules interuromast de Zebrafish

Ici, nous présentons un protocole pour marquer les protéines avec une étiquette de protéine de fluorescence chez les larves de poisson-zèbre, un système in vivo nouvellement développé et modifié particulièrement utile pour visualiser les protéines de faible abondance chez le poisson zèbre.

Marquage par fluorescence pour visualiser les protéines faiblement exprimées chez le poisson-zèbre

Découvrez le marquage cellulaire par déverrouillage laser UV de fluoresceïne cagée chez l'embryon de zèbre. Cette méthode permet de tracer les lignées cellulaires en développement avec une précision spatiale et temporelle optimale.

Étiquetage des cellules Lineage Zebrafish avec laser Uncagable dextran fluorescéine

Explorer plus de vidéos