Name: Étiquetage des cellules Lineage Zebrafish avec laser Uncagable dextran fluorescéine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Découvrez le marquage cellulaire par déverrouillage laser UV de fluoresceïne cagée chez l'embryon de zèbre. Cette méthode permet de tracer les lignées cellulaires en développement avec une précision spatiale et temporelle optimale.

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Nous tenons à remercier Dan Carlin pour aider à faire la fluorescéine en cage. En outre, nous tenons à remercier les sources de financement suivantes: Programme de l&#39;Université Vanderbilt Medical School pour Grant Biologie formation de perfectionnement à la JAC, et les NIH HD054534to JTG.

1. Synthèse de la cage fluorescéine dextrane <ol><li> Mesurer 3,5 à 4 mg de aminodextrane et ajouter dans le tube Invitrogen fournis teintées contenant 1 mg de CMNB-cage SE fluorescéine. Dans nos mains ce ratio donne une moyenne de chargement de ~ 2,5 molécules de colorant par le dextran. </li><li> Ajouter 500 ul de 0,1 M Na 2 B 4 O 7 tampons (borate de sodium) dans le tube. </li><li> Cap et le vortex pendant 30 secondes pour dissoudre le aminodextrane et la fluorescéine en cage. </li><li> Laissez réagir toute la nuit sur un mélangeur vortex. </li><li> Dévissez la fermeture de fond sur une colonne spin Zeba et desserrer le bouchon. Marquer un point sur la colonne avec un stylo-feutre. Colonne de la Place dans un tube de 15 ml conique. </li><li> Centrifuger à 1000 xg pendant 2 minutes avec le point face au centre du rotor. Utiliser la colonne immédiatement après compactage. </li><li> Placer la colonne compactée dans une nouvelle de 15 ml tube conique. </li><li> Mélange réactionnel piscine et le transfert vers le centre du lit de résine colonnes compactées. Remettre le bouchon. </li><li> Centrifuger à 1000 xg pendant 2 minutes avec le point face au centre du rotor. Après le spin, l'éluant et le haut de la colonne sera à peu près la même nuance de couleur jaune. </li><li> Transfert de l'éluant jaune (~ 350 pi) dans un tube à centrifuger de 1,5 ml. </li><li> Lyophiliser à sec dans une speedvac. Couvrir le speedvac papier d'aluminium. </li><li> Re-suspendre le résultant ~ 2-3 mg de mousse jaune pâle dans l'eau à une concentration finale de 1% p / v. </li><li> Conserver cette solution à -20 ° C dans du papier recouvert de tubes. C'est une bonne idée de partie aliquote de la solution de dextrane pour empêcher congélation-décongélation répétés. </li></ol> 2. L'injection de fluorescéine Caged Dextran dans des embryons de poisson zèbre <ol><li> Diluer à 1% p / v stock de cage 01h05 fluorescéine dextran ou 01h10 dans KCl 0,2 M. </li><li> Injecter 0,5 - 1.0nL de solution de fluorescéine en cage dans un jaune d'embryons au stade de cellule à l'aide d'un injecteur à pression. Une fois injecté, embrayages d'embryons doivent être maintenus dans l'obscurité à 28,5 ° C pour réduire la non-spécifiques uncaging. </li><li> Supprimez manuellement chorions à partir d'embryons. </li><li> Anesthetize embryons dans 4% tricaïne. </li><li> Les embryons seront montés dans agarose à 0,8% dans la boîte de Petri 35mmx10mm, puis recouverte d'eau d'œuf. </li><li> Equilibrer fondue agarose dans 50 blocs ° C chaleur pendant au moins 15 minutes. </li><li> En utilisant une pipette en verre, d'élaborer un embryon dans un minimum d'eau et de le libérer dans l'agarose. Remarque: Il est important de refroidir le tube d'agarose dans votre main pendant environ 30 secondes avant de mettre l'embryon dans le tube pour éviter tuer l'embryon. </li><li> Pipeter l'embryon dans le tube, avec environ 50 pl d'agarose et éjecter le contenu sur le centre de la boîte de Pétri. </li><li> Vite orienter l'embryon à l'aide d'un fil en plastique avec les cellules à Uncaged vers le haut. Remarque: Le agarose refroidir rapidement afin d'être précipitée orientant l'embryon. Les embryons peuvent être endommagés si manipulé après la agarose devient rigide. </li><li> Laisser l'agarose solidifier complètement (cela prend quelques minutes) et remplir les deux tiers vaisselle avec de l'eau d'œuf contenant 4% tricaïne et PTU 0,003%. </li></ol> 3. Laser Uncaging de fluorescéine dextrane <ol><li> Le microscope utilisé pour uncaging doit avoir un objectif 40X d'eau par immersion. </li><li> Nous utilisons un laser photonique Instruments avec la cellule de teinture de 365 nm et 70% / 30% miroir fractionné dichroïque. </li><li> Avant uncaging, le laser doit être faite parfocale avec l'objectif et atténué à la puissance appropriée. </li><li> Pour concentrer le laser, placer une lame de verre en miroir sous l'objectif et de se concentrer l'objectif jusqu'à ce rayures dans la diapositive sont visibles. </li><li> Ajuster au laser atténuateur jusqu'à ce que le laser peut produire une rayure visible dans le miroir avec une seule impulsion. </li><li> Ajustez le point de vue objectif de haut en bas. Si le laser peut produire une égratignure lorsque l'objectif est hors de discussion, ajuster la focalisation du laser ¼ de tour vers le haut ou vers le bas. Répétez jusqu'à ce que le laser peut rayer le miroir seulement lorsque l'objectif est focalisé. </li><li> Placez montée embryon titre de l'objectif et se concentrer sur la zone à Uncaged. </li><li> Pour uncage, se concentrer sur une cellule d'intérêt et d'impulsion de l'10-20 fois à 2-3 Hz. </li><li> Après uncaging, sans l'embryon par déroulage agarose loin avec une pince et en les mettant dans de l'eau contenant des oeufs PTU 0,003%. Laissez les embryons se développent dans une boîte étanche à la lumière jusqu'à ce qu'ils soient fixes. </li></ol> 4. Marquage de l'anticorps et la détection des Uncaged fluorescéine dextrane <ol><li> Fixer des embryons dans Ab fixateur (paraformaldéhyde à 4%, 0,3 CaCl2, 8% de saccharose, phosphate 1X saline tamponnée, pH 7,3) pendant deux à quatre heures à température ambiante (RT) ou toute la nuit (O / N) à 4 ° C. Gardez embryons dans une boîte étanche à la lumière ou la papillote tube pour toutes les mesures d'étiquetage. </li><li> Retirer fixateur et le remplacer par du MeOH 100%, laisser reposer 10 minutes à température ambiante, enlever MeOH et remCE avec MeOH 100% frais. </li><li> Conserver dans MeOH à -20 ° C pendant au moins 30 minutes. Note: Vous pouvez stocker dans MeOH pour un maximum de deux semaines avant épitopes commencent à se dégrader. </li><li> Réhydrater embryons avec lavages de 5 minutes à température ambiante de phosphate MeOH/1X 75% saline tamponnée avec 0,1% de Tween 20 (1X PBSTw), puis 50% 1XPBTw MeOH/50%, puis 25% MeOH/75% 1X PBSTw. </li><li> Laver trois fois pendant 5 minutes dans 1XPBSTw. </li><li> Si les embryons sont&gt; 24 heures, permiabilize embryons avec 10 ug / ml de protéinase K dans 1XPBSTw. Le temps est dépendant Permiabilization sur scène. Cinq minutes de la protéinase K est suffisante si les embryons sont entre 24 et 48 heures après la fécondation (HPF). Plus de temps peut être nécessaire si des larves plus âgées. Re-fixer dans Ab fixateur pendant 20 minutes à température ambiante </li><li> Lavez cinq fois pendant 5 minutes dans 1XPBSTw à température ambiante. </li><li> Incuber dans une solution de bloc (1XPBS, Triton X100 à 0,1%, 10% de sérum de moutons, 10% d'albumine de sérum bovin, 1% de diméthylsulfoxyde) pendant 1-2 heures à température ambiante. </li><li> Diluer anticorps primaire (anti-fluorescéine ainsi que des anticorps contre un type de cellule des marqueurs spécifiques) dans une solution de blocage. </li><li> Incuber embryons O / N à 4 ° C dans une solution contenant des anticorps primaires. </li><li> Laver quatre fois pendant 20 minutes dans 1XPhosphate saline tamponnée avec du Triton X100 à 0,1% (PBSTx) à température ambiante. </li><li> Diluer fluorescence des anticorps secondaires marqués (généralement 1:300) dans une solution de blocage. </li><li> Incuber O / N à 4 ° C dans une solution contenant des anticorps secondaires. </li><li> Laver quatre fois pendant 20 minutes dans 1XPBSTx à température ambiante. </li><li> Embryons Clear 1XPBS 50% glycerol/50% pour au moins deux heures à température ambiante, puis retirez le glycérol / PBS et ajouter le mélange de glycérol à 100% et laisser reposer O / N à 4 ° C. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Après immunomarquage, il devrait y avoir une zone enrichie d'une coloration dans les cellules qui ont été Uncaged (Figure.1). Il n'est pas rare de voir un signal relativement élevé par rapport au bruit de&gt; 48 heures zebrafish vieux, à cause de uncaging spontanée de la fluorescéine. <img src="/files/ftp_upload/2672/2672fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Étiquetage du poisson zèbre Lineage pinéale complexes. A 24 HPF, une partie de l'ébauche antérieure pinéale, indiqué par foxd3:. Expression de la GFP, a été Uncaged utilisant des impulsions laser UV A) Par 48hpf, un cluster du côté gauche de cellules appelées les parapineal (cercle rouge) a émergé de la Uncaged domaine (cercle blanc). B) Uncaged signal de la fluorescéine est enrichi en parapineal (cercle rouge) et la glande pinéale (cercle blanc).

<ol><li>Hatada, Y., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fate+map+of+the+epiblast+of+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A fate map of the epiblast of the early chick embryo.</a> Development. 120, 2879-2889 (1994).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122, 300-319 (1987).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+Precursors+Can+Give+Rise+to+All+Major+Cell-Types+of+the+Frog+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina.</a> Science. 239, 1142-1145 (1988).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+fluorescent+tracers+to+study+neural+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages.</a> Development. , Suppl 2. 1-8 (1991).</li>
<li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuC%3AKaede%2C+a+useful+tool+to+label+neural+morphologies+in+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo.</a> Genesis. 44, 136-142 (2006).</li>
<li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+Fluorescent+Probes+and+Research+Chemicals%22">Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals</a>. , 9th Edition, 707-711 (2002).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+%28caged%29+fluorescein+as+a+cell+tracer+for+fate+mapping+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientation+of+first+cleavage+in+the+sea+urchin+embryo%2C+Lytechinus+variegatus%2C+does+not+specify+the+axes+of+bilateral+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry.</a> Dev Biol. 175, 177-183 (1996).</li>
</ol>

Tel que décrit, ce protocole fournit une méthode relativement rapide lignée étiquetage du poisson zèbre qui est construit sur les techniques couramment utilisées de microinjection, microscopie, et immunofluorescence. Nous avons trouvé que le laser uncaging d&#39;être le moyen le plus efficace et rentable de uncage fluorescéine de manière localisée. Cette méthode pourrait être utilisée pour étiqueter la lignée avec les terminaux expérimentale aussi tard que 4 dpf. Cependant, comme les cellules se divisent, la concentrati...

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A correction to the article Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran was made.

Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

<table><tbody><tr><td>CMNB-fluorescéine SE piégée</td><td>Invitrogen</td><td>C20050</td><td></td></tr><tr><td>Aminodextrane, 10 kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1860</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de désalinisation Zeba à rotation</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89889</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-fluorescéine de chèvre</td><td>Invitrogen</td><td>A11095</td><td></td></tr><tr><td>anticorps Alexa Fluor 633 de âne anti-chèvre</td><td>Invitrogen</td><td>A21082</td><td></td></tr><tr><td>boîtes de Pétri 35 mm x 10 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>microscope composé droit équipé d'un objectif à immersion dans l'eau 40x</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM6000B</td><td></td></tr><tr><td>Système d'illumination laser manuel MicroPoint</td><td>Photonic Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phénylthiourea (PTU)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Roche Group</td><td>03115836991</td><td></td></tr><tr><td>fil plastique</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Savant SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur vortex</td><td>VWR international</td><td>Vortex Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>injecteur sous pression</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr></tbody></table>

Étiquetage des cellules lineage zebrafish avec laser uncagable dextran fluorescéine

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Un problème central dans la biologie du développement est de déduire l&#39;origine de la myriade de types de cellules présentes dans les vertébrés à mesure qu&#39;ils surviennent à partir de précurseurs indifférenciés. Les chercheurs ont utilisé diverses méthodes d&#39;étiquetage lignée, tels que l&#39;étiquetage DiI 1 et l&#39;injection sous pression d&#39;enzymes traçable 2 à déterminer le destin des cellules à des stades ultérieurs de développement dans des systèmes modèles. Les cartes sort d&#39;abord dans le poisson zèbre (Danio rerio) ont été assemblés par injection iontophorétique de colorants fluorescents, tels que la rhodamine dextrane, dans des cellules individuelles dans des régions discrètes de l&#39;embryon et le traçage le sort de la cellule marquée au cours du temps 3-5. Bien qu&#39;ils soient efficaces, ces méthodes sont techniquement exigeantes et nécessitent un équipement spécialisé ne trouve pas couramment dans les laboratoires de poisson zèbre. Récemment, photoconvertable protéines fluorescentes, comme Eos et Kaede, qui irréversiblement passer du vert au rouge lorsque la fluorescence est exposé aux ultraviolets, voient une utilisation accrue chez le poisson zèbre 6-8. La clarté optique de l&#39;embryon de poisson zèbre et la facilité relative de la transgénèse ont fait de ces outils particulièrement attrayant pour l&#39;étiquetage lignée et d&#39;observer la migration des cellules in vivo 7. Malgré leur utilité, ces protéines ont quelques inconvénients par rapport aux colorants médiée par des méthodes d&#39;étiquetage lignée. La plupart des cruciale est la difficulté que nous avons trouvés dans l&#39;obtention de 3-D haute résolution pendant photoconversion de ces protéines. Dans cette perspective, peut-être la meilleure combinaison de résolution et de facilité d&#39;utilisation pour l&#39;étiquetage de la lignée dans le poisson-zèbre se sert de cage fluorescéine dextrane, un colorant fluorescent qui est lié à un groupe de trempe qui masque ses 9 fluorescence. La teinture peut alors être &quot;Uncaged&quot; (publié par le groupe de la trempe) dans une cellule spécifique en utilisant la lumière UV d&#39;une lampe laser ou le mercure, permettant la visualisation de sa fluorescence ou immunodétection. Contrairement aux méthodes d&#39;iontophorèse, la fluorescéine cage peut être injecté à des appareils d&#39;injection standard et Uncaged avec un microscope à épifluorescence équipé d&#39;un trou d&#39;épingle 10. En outre, les anticorps contre la fluorescéine ne détecter que le formulaire en liberté, et l&#39;épitope de fixation ainsi survit 11. Enfin, la fluorescéine en cage peuvent être activées à très haute résolution en 3-D, en particulier si la microscopie à deux photons est utilisée 12,13. Ce protocole décrit une méthode d&#39;étiquetage par la lignée de fluorescéine en cage et uncaging laser. Subsequenctly, uncaged fluorescéine est détectée simultanément avec les autres épitopes telles que la GFP en marquant avec des anticorps.

Ce protocole définit un moyen d&#39;étiqueter et de tracer le destin de petits groupes de cellules du poisson zèbre en utilisant UV-uncaging de fluorescéine en cage, suivi par l&#39;ensemble de montage immunomarquage pour amplifier le signal de la fluorescéine Uncaged.

Étiquetage des cellules Lineage Zebrafish avec laser Uncagable dextran fluorescéine

Un problème central en biologie du développement consiste à déduire l'origine de la myriade de types cellulaires présents chez les vertébrés alors qu'ils dérivent de cellules indifférenciées...

L'objectif général de cette procédure est d'étiqueter les cellules selon leur lignée dans un embryon de poisson zèbre. Cette opération est réalisée en synthétisant d'abord du fluorescéine piégé, puis en l'injectant dans les embryons de poisson zèbre. Les embryons sont ensuite montés dans de l'agarose afin que les cellules à étiqueter soient accessibles.Ensuite, un laser UV est utilisé pour activer la fluorescéine piégée dans des cellules sélectionnées de l'embryon. Enfin, les embryons sont récoltés une fois qu'ils ont atteint le stade désiré, et les cellules marquées sont détectées par rapport à des marqueurs de lignées particulières. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent le destin des cellules sélectionnées dans les embryons grâce à la photo-activation et à la microscopie immunofluorescente.L'avantage principal de cette technique par rapport aux techniques existantes, telles que la photoconversion de Cade, est que l'immunofluorescence multicolore permet de détecter la fluorescéine démasquée en plus d'autres anticorps spécifiques aux liaisons cellulaires. Pour injecter du dextran de fluorescéine cagée dans des embryons de poisson zèbre, commencez par le synthétiser et préparez une solution à 1 % en poids par volume. Réalisez des aliquotes de stock conformément au protocole écrit joint.Ensuite, effectuez une dilution par aliquots, d’un à cinq ou d’un à dix dans du chlorure de potassium 0,2 molaire. Ensuite, injectez de 0,5 à un nanolitre de solution de fluorescéine piégée dans le vitellus d’embryons au stade unidcellulaire. À l’aide d’un injecteur sous pression, une fois l’injection réalisée, les lots d’embryons doivent être conservés à l’obscurité à 28,5 degrés Celsius afin de réduire l’activation non spécifique au stade de développement souhaité.Retirer manuellement la choroine des embryons, anesthésier les embryons dans 4 % de trica pour monter les embryons en équilibre, 0,8 % d’agarose fondue dans un bloc chauffant à 50 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes. Ensuite, refroidir le tube dans la main pendant environ 30 secondes. Avant d'ajouter les embryons à l’aide d’une pipette en verre, aspirer un embryon avec une quantité minimale d’eau et le relâcher dans l’agarose. Prélever l’embryon du tube avec environ 50 microlitres d’agarose et expulser le contenu au centre d’une boîte de Pétri de 35 millimètres par 10 millimètres.À l’aide d’un fil en plastique, orientez rapidement l’embryon de manière à ce que les cellules à photoliberer soient dirigées vers le haut. Laissez l’agarose se solidifier complètement et remplir la boîte. Remplissez-la aux deux tiers avec de l’eau d’œufs contenant 4 % de trica et 0,003 % de PTU, et conservez les embryons dans une boîte étanche à la lumière jusqu’au moment du piégeage.Pour réaliser le piégeage par laser de la dextrane-fluorescéine, utilisez un microscope composé équipé d'un objectif à immersion dans l'eau de 40 x. Nous utilisons un laser d'instruments photoniques doté d'une cellule à colorant de 365 nanomètres et d'un miroir dichroïque à répartition 70 %/30 % avant le dépiégeage. Le laser doit être mis au point parafocallement avec l'objectif et atténué à la puissance appropriée afin de focaliser le laser.Placez une lame de verre réfléchissante sous l'objectif et focalisez l'objectif jusqu'à ce que les rayures sur la lame soient visibles. Réglez l'atténuateur du laser jusqu'à ce que le laser produise une rayure nettement visible sur le miroir avec une seule impulsion, puis ajustez la mise au point de l'objectif vers le haut et vers le bas. Si le laser peut produire une rayure lorsque l'objectif est hors focus, réglez la mise au point du laser d'un quart.Régler vers le haut ou vers le bas. Répéter jusqu'à ce que le laser puisse graver le miroir. Uniquement lorsque l'objectif est au point, placer l'embryon monté sous l'objectif et faire la mise au point sur la zone à découvrir afin de procéder à la découverte.Se concentrer sur une cellule d'intérêt et la stimuler par impulsions 10 à 20 fois à deux ou trois hertz. Après la libération du caging. Libérer l'embryon en retirant les chorions à l’aide de pinces et les placer dans de l’eau pour œufs contenant 0,003 % de PTU. Fixer les embryons dans un fixateur contenant des anticorps pendant deux à quatre heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius.Retirer le fixateur et le remplacer par du méthanol à 100 %. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Puis retirer le méthanol et le remplacer par du méthanol frais à 100 %.Conserver les embryons dans du méthanol à moins 20 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Vous pouvez les conserver dans du méthanol jusqu'à deux semaines avant que les épitopes ne commencent à se dégrader. Réhydrater les embryons par des lavages de cinq minutes à température ambiante avec une solution de 75 % de méthanol, 25 % de PBS 1x tamponné au phosphate contenant 0,1 % de Tween 20, puis avec 50 % de méthanol, 50 % de PBS 1x Tween 20, ensuite avec 25 % de méthanol, 75 % de PBS 1x Tween 20, puis effectuer trois lavages de cinq minutes dans du PBS 1x Tween 20.Si les embryons ont plus de 24 heures, les rendre perméables avec 10 microgrammes par millilitre de protéinase K dans un tampon XPBS contenant du Tween 20. Le temps de perméabilisation dépend du stade des embryons. Cinq minutes dans la protéinase K sont suffisantes.Si les embryons ont entre 24 et 48 heures post-fécondation, un temps supplémentaire peut être nécessaire pour les larves plus âgées. Réaliser une nouvelle fixation avec un fixateur d'anticorps pendant 20 minutes à température ambiante. Laver les embryons cinq fois pendant cinq minutes dans du XPBS contenant du Tween 20 à température ambiante.Incuber ensuite dans la solution de blocage pendant une à deux heures à température ambiante. Diluer les anticorps primaires dans la solution de blocage. Puis incuber les embryons toute la nuit à quatre degrés Celsius dans une solution contenant les anticorps primaires ; le lendemain matin, laver les embryons quatre fois dans du XPBS 1 % Triton X-100, puis diluer les anticorps secondaires marqués de manière fluorescente dans la solution de blocage.Incuber les embryons toute la nuit à quatre degrés Celsius dans une solution contenant les anticorps secondaires. Après quatre lavages dans du XPBS Triton X-100 1×, clarifier les embryons dans un mélange à 50 % de glycérol et 50 % de XPBS 1× pendant au moins deux heures à température ambiante. Ensuite, retirer le mélange glycérol-PBS et ajouter du glycérol à 100 % ; incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius.Les résultats représentatifs pour les larves témoins et les larves ayant subi un démasquage photochimique sont présentés sous forme de projections confocales. Les embryons témoins ont été injectés avec de la fluorescéine cagée mais n'ont pas été soumis à un démasquage photochimique 48 heures après la fécondation. L'embryon témoin présente un marquage GFP dans le complexe pinéal.Une étiquetage ponctuel diffus en arrière-plan, mais aucune accumulation localisée de fluorescéine marquée n'est détectable. Les embryons dont la fluorescéine a été libérée par photoactivation montrent une accumulation nette de fluorescéine libérée dans certaines cellules marquées par GFP. Il s'agit des descendantes des cellules ciblées par la photoactivation de l'agent piégé 24 heures auparavant, avec de légères modifications.Cette procédure peut être utilisée pour étiqueter presque n'importe quel tissu dans l'embryon de poisson zèbre avant 48 heures post-fécondation.

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JoVE Journal

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Biologie

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