Induction de l'alloantigène spécifique anergie dans les cellules mononucléaires du sang périphérique par stimulation alloantigène avec blocage du signal de co-stimulation

L'objectif général de l'expérience suivante est d'activer des lymphocytes T allospécifiques du donneur destinataires par une stimulation ex vivo avec des antigènes allo du receveur en présence d'anticorps bloquant la co-stimulation des lymphocytes T par les cellules présentatrices d'antigènes via leur récepteur CD 28. Ceci est réalisé en isolant d'abord des PBMC provenant de deux donneurs sains différents. Ensuite, une culture co-incubée allogénique globale est mise en place en incubant les populations de PBMC incompatibles au niveau HLA en présence d'anticorps monoclonaux dirigés contre les ligands B 7.1 et B 7.2 afin de bloquer la stimulation par CD 28.

Ensuite, l'efficacité de l'allo-activation est mesurée par des réactions lymphocytaires mixtes primaires et secondaires, ou RLM. Enfin, la spécificité allo de l'allo-activation est évaluée en déterminant les réponses dirigées contre un tiers donneur et contre le CMV. Les résultats obtenus montrent que les lymphocytes T du donneur deviennent hypo-réactifs à une stimulation antigénique allogénique ultérieure, tandis que les lymphocytes T du donneur non réactifs de façon allogénique restent intacts et fonctionnels.

Nous avons utilisé avec succès cette stratégie dans des essais cliniques pilotes antérieurs et en cours d'infusion de cellules T de donneur « énergisées » allogéniques pendant et après une greffe de cellules souches hématopoïétiques avec incompatibilité HLA, et nous avons observé une reconstitution immunitaire améliorée, moins d'infections et une maladie du greffon contre l'hôte aiguë et chronique moins sévère par rapport aux témoins historiques recevant des greffes HLA incompatibles non manipulées. Un avantage majeur de la stratégie d’anodisation allogénique est que les effets hors cible sont minimisés, car la technique ne réduit pas les réponses des cellules T spécifiques aux agents pathogènes ou aux antigènes associés aux tumeurs, ni n’élimine les cellules T régulatrices CD4 du pool de cellules T du donneur, démontrant ainsi que la procédure sera Christine Vin, une scientifique contractuelle de notre laboratoire. La première étape consiste à prélever du sang auprès de deux donneurs volontaires sains.

Les cellules provenant d'un donneur serviront de cellules répondeuses, tandis que les cellules provenant d'un autre donneur serviront de cellules stimulatrices. Ensuite, isoler les PBMC à partir du sang par centrifugation en gradient de densité en utilisant le fial pac. Conserver une petite quantité de cellules avec le trian blue et dénombrer les PBMC viables à l'aide du compteur hématométrique réutilisable.

Répartir les PBMC de chaque donneur dans 10 millilitres de milieu de culture complet à une concentration de 1 million de cellules viables par millilitre dans des tubes coniques séparés de 15 millilitres. Désigner un tube de PBMC donneur comme stimulateurs et l'autre comme répondeurs pour mettre en place la co-culture allogénique en masse.

Ajouter 100 microgrammes d'anticorps anti B 7.1 et anti B 7.2 dans le tube de 15 millilitres désigné comme stimulateur. Agiter doucement le tube et incuber pendant 30 minutes après la période d'incubation. Irradier les PBMC stimulateurs et les ajouter à un flacon de culture cellulaire T 25 de 50 centimètres cubes muni d'un bouchon perméable aux gaz.

Étiquetez le flacon contenant la culture mixte d'allo-charbon. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de PBMC répondeurs provenant d'un autre donneur, à une concentration de 1 million par millilitre dans un milieu complet, dans le flacon. Ajoutez en outre 100 microgrammes de chacun des anticorps 7.1 et 7.2 au flacon et mélangez délicatement avant de placer le flacon en position verticale dans un incubateur pendant 72 heures.

Ensuite, irradiez un autre lot de 10 millions de PBMC stimulateurs pour une co-culture témoin en vrac sans anticorps bloquants, puis ajoutez-les à un flacon de culture cellulaire T 25 de 50 centimètres cubes. Étiquetez le flacon « témoin de co-culture en vrac ». Ajoutez 10 millilitres des mêmes PBMC répondeurs utilisés pour la co-culture allogénique en vrac, à une concentration de 1 million par millilitre dans un milieu complet, au flacon et mélangez délicatement avant de placer le flacon verticalement dans un incubateur pendant 72 heures.

L'étape suivante consiste à mesurer la fonction du pool de cellules T donneuses activées de manière allogénique le même jour que les cultures coïncubées globales ; étiquetez une plaque 96 puits en U pour chaque point temporel parmi les trois à mesurer, destinée au MLR primaire. Ensuite, versez délicatement 5 millilitres de chacune des cultures coïncubées témoins globales et activées de manière allogénique dans des tubes de 15 millilitres.

Ensuite, pipetez 200 microlitres de suspension cellulaire de chaque tube dans des puits en triple exemplaire sur chacune des trois plaques. Identifiez ces puits comme « sans blocage co-stimulateur » ou « sans CSB » pour les cellules provenant des cultures froides témoins globales, et « CSB » pour les cellules provenant des cultures froides globales allogéniques activées. Ajoutez ensuite 200 microlitres de milieu complet dans six puits de chaque plaque servant de contrôles négatifs.

Enfin, ajouter 200 microlitres de PBS dans tous les puits vides afin de réduire l'évaporation, puis placer les plaques dans l'incubateur 72 heures après avoir mis en place les cocultures massives. Étiqueter une plaque 96 puits UBO, plaque secondaire MLR, pour chacun des trois points temporels à mesurer. Pour préparer les cellules répondeuses destinées au MLR secondaire, transférer cinq millilitres de chacune des cocultures témoins massives et allogéniques vers des tubes de 15 millilitres, puis centrifuger les tubes de cinq à dix minutes à 2000 tr/min à température ambiante. Ensuite, laver les cellules deux fois supplémentaires en aspirant soigneusement les surnageants, en redispersant les culots, en ajoutant 10 millilitres de milieu complet dans chaque tube, puis en centrifugeant à nouveau les cellules après le deuxième lavage.

Resuspendez les cellules dans un millilitre de milieu complet. Utilisez la coloration au bleu de trypan pour dénombrer les cellules viables et ajustez la concentration cellulaire à un million de cellules réceptrices viables par millilitre. Prélèvez 100 microlitres de suspension cellulaire de chaque tube et déposez-les dans des puits triplicates de chaque plaque.

Étiquetez d'abord ces puits comme stimulation par alliage de première partie ou FP. Ensuite, pipetez 100 microlitres de suspension cellulaire de chaque tube dans trois autres puits de chaque plaque, et étiquetez ces puits comme stimulation CD3/28 de PBMC provenant du même donneur utilisé pour fournir les PBMC stimulateurs de première partie pour l'allogreffe. Les cocultures activées et les cocultures témoins sont utilisées comme cellules stimulatrices pour le MLR secondaire : suspendez 10 millions de PBMC du donneur de première partie à une concentration de 1 million par millilitre et ajoutez une irradiation.

100 microlitres de cellules stimulateurs irradiées dans les puits étiquetés fp de restimulation allogénique sur chaque plaque de MLR secondaire. Pour les contrôles positifs, ajouter un microlitre d'anticorps monoclonaux anti-CD3 et anti-CD28 et 98 microlitres de milieu complet dans les puits étiquetés stimulation CD3/28 sur chaque plaque de MLR secondaire. En outre, ajouter 200 microlitres de milieu complet dans six puits vides de chaque plaque afin de servir de contrôles négatifs, et ajouter 200 microlitres de PBS dans tous les puits vides pour réduire l'évaporation.

Placer les plaques dans l'incubateur. L'étape suivante consiste à mesurer la spécificité du PBMC allo isolé à partir d'un nouveau donneur sain appelé donneur tiers, qui est utilisé pour tester la spécificité du processus allo dans un MLR secondaire. Suspendre les PBMC du donneur tiers à une concentration d'un million de cellules par millilitre et irradier l'étiquette 3 96 tandis que les plaques de spécificité de MLR secondaire aux jours trois, cinq et sept.

Pour préparer les cellules répondeuses pour le MLR secondaire afin de mesurer la spécificité, transférez cinq millilitres de chacun des cocultures témoins en masse et des cocultures avec stimulation allogénique vers des tubes de 15 millilitres et centrifugez les tubes pendant cinq à dix minutes à 2000 tr/min. Lavez ensuite les cellules deux fois en aspirant soigneusement les surnageants, en redispersant les culots, en ajoutant 10 millilitres de milieu complet dans chaque tube, puis en centrifugeant à nouveau les cellules après le deuxième lavage. Resuspendez les cellules dans un millilitre de milieu complet.

Utilisez la coloration au bleu de trypan pour compter les cellules et ajustez la concentration cellulaire à 1 million de cellules réceptrices viables par millilitre, puis pipetez 100 microlitres de suspension cellulaire de chaque tube dans des puits en triple exemplaire sur chaque plaque. Identifiez ces puits par TP ou stimulation allogénique tierce partie. Ajoutez ensuite 100 microlitres de cellules stimulatrices tierces parties irradiées dans les puits identifiés comme stimulation allogénique TP.

Pour tester davantage la spécificité des réponses allogéniques, les réponses aux agents pathogènes sont mesurées après l'activation des PBMC provenant de donneurs ayant déjà présenté des réponses prolifératives au CMV. Étiqueter les plaques 96 puits M-L-R-C-M-V aux jours trois, cinq et sept, puis transférer cinq millilitres de chacune des cultures témoins et des cultures activées de façon allogénique dans des tubes de 15 millilitres. Ensuite, laver, compter et resuspendre les cellules à une concentration d'un million par millilitre dans un milieu complet. Prélever à l’aide d’une pipette 100 microlitres de suspension cellulaire de chaque tube et les déposer dans trois puits de chaque plaque, puis étiqueter ces puits comme étant destinés à la stimulation par le CMV.

Ensuite, ajouter 0,1 microlitre de lysat de CMV dans 100 microlitres de milieu complet dans les puits étiquetés stimulation par CMV. Puis ajouter 200 microlitres de milieu complet dans six puits de chaque plaque comme témoins négatifs. Enfin, ajouter 200 microlitres de PBS dans tous les puits vides afin de réduire l'évaporation, puis placer les plaques dans l'incubateur pour mesurer la prolifération dans les réactions mixtes de lymphocytes primaires et secondaires (MLR).

Ajoutez un microcurie de thymidine tritiée au puits du témoin négatif et aux puits contenant les cellules, 16 heures avant la récolte des plaques. Récupérez la thymidine sur un tapis filtrant par plaque à l’aide d’un appareil de récolte TomTec ou équivalent à air. Faites sécher les tapis filtrants pendant une heure.

Ensuite, placez-les dans des sachets individuels. Ajoutez cinq millilitres de liquide de scintillation à chacun et scellez-les. Mesurez l'incorporation de la trithymidine durant les dernières 16 heures de l'expérience en lisant les membranes filtrantes à l'aide d'un compteur de scintillation Wallac MicroBeta, ou équivalent, en utilisant des PBMC stimulateurs et répondeurs avec incompatibilité HLA.

On peut observer sur cette figure que la présence d'un blocage co-stimulateur dans le MLR primaire réduit la prolifération allogène moyenne des PBMC effecteurs au jour cinq à environ 30 % de celle observée dans le MLR primaire témoin en l'absence de blocage co-stimulateur. Cela équivaut à une inhibition moyenne de la prolifération allogène primaire d'environ 70 % au jour cinq. Tel qu'observé sur cette figure.

On peut observer sur cette figure que, dans le MLR secondaire, la prolifération allogénique de première partie des PBMC activés par l'allogène au jour cinq est généralement de 10 à 15 % de celle observée avec les PBMC témoins. Cela correspond à une inhibition moyenne de la prolifération de 85 à 90 %, démontrant que les PBMC activés par l'allogène présentent une hyporéactivité aux stimulateurs allogéniques de première partie. Comme illustré sur cette figure, une fois maîtrisée, la mise en place de cocultures en grand volume avec les cellules mononucléées du sang périphérique du donneur activées par l'allogène peut être réalisée en deux à trois heures.

L'approche peut être facilement standardisée pour une utilisation clinique afin de générer des lymphocytes T donneurs présentant une alloreactivité réduite, mais une immunité spécifique aux agents pathogènes conservée. Ces cellules peuvent être transférées de façon adoptive dans le cadre d'une greffe de cellules souches hématopoïétiques allogéniques pour améliorer la reconstitution immunitaire sans provoquer de maladie du greffon contre l'hôte excessive. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de travailler rapidement.

Cela permet de préserver la viabilité des cellules et d'éviter l'activation non spécifique ou la perte de cellules présentatrices d'antigènes. Si l'on utilise des PBMC conservés par congélation comme stimulateurs ou répondeurs, il convient d'appliquer un protocole validé de récupération des cellules congelées permettant d'obtenir régulièrement des rendements élevés de cellules viables. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment allogéniser des cellules mononucléées du sang périphérique de donneurs humains, ainsi que la manière de réaliser des tests permettant d'évaluer l'efficacité et la spécificité de cette procédure. Cette stratégie peut être utilisée pour générer des lymphocytes T de donneurs humains présentant des réponses allogéniques réduites, lesquels peuvent être employés cliniquement afin d'améliorer la reconstitution immunitaire après une greffe de cellules souches hématopoïétiques allogéniques.