Solide plaque à base de restriction alimentaire Caenorhabditis elegans

La procédure effectue une restriction alimentaire sur la plaque standard abased dans l’élégance de la mer pour étudier son effet sur la longévité, la reproduction et le métabolisme. Pour ce faire, il faut d’abord mesurer avec précision la concentration des bactéries qui seront utilisées comme source de nourriture. La deuxième étape de la procédure consiste à diluer correctement la culture bactérienne à des concentrations appropriées.

Préparez ensuite des plaques SDR à base de bactéries tuées. Enfin, mettez en place des expériences SDR avec une population de vers synchronisée par âge. Les résultats de la production de la descendance et des mesures de la durée de vie peuvent montrer une production de descendance retardée et réduite ainsi qu’une augmentation de la durée de vie moyenne.

Le principal avantage de cette technique sur 60 méthodes comme Dian en milieu AZA, est que toutes les expériences seront faites sur un jeu solide standard basé sur l’AGA qui est utilisé par la plupart des laboratoires chauds Pour les expériences de restriction alimentaire et voir l’élégance établir des courbes de calibrage distinctes pour chaque souche de bactérie utilisée comme source de nourriture. Prélevez une seule colonie de bactéries E. coli OP 50 à partir d’une traînée fraîche sur une gélose lb et inculquez trois millilitres de culture de bouillon liquide dans un agitateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Préparez une double dilution en série de la culture de nuit.

Mesurez ensuite l’absorbence de chaque dilution à 600 nanomètres par spectrophotomètre en trois exemplaires. De plus, chaque suspension bactérienne, 1 million de fois plus uniformément ensemence 0,4 millilitre de suspension bactérienne de chaque dilution sur une plaque agricole de 100 millimètres lb et incuber à 37 degrés Celsius pendant 18 à 24 heures. Comptez le nombre de colonies bactériennes cultivées sur chaque plaque afin de calculer le nombre d’unités formant des colonies par millilitre pour chaque échantillon.

Tracez maintenant la DO 600 en fonction de la concentration bactérienne et effectuez une analyse de régression linéaire pour établir la relation entre les valeurs mesurées de la DO 600 et les concentrations de bactéries OP 50. Pour cette méthode, une concentration de bactéries d’une fois 10 à la 11e UFC par millilitre est utilisée dans la condition d’alimentation ad lido et une fois 10 à la huitième UFC par millilitre comme condition d’alimentation DR optimale. Cependant, quatre à six concentrations différentes de bactéries peuvent être nécessaires pour établir une relation dose-dépendante complète.

Pour SDR et ses réponses. Préparez un inoculum avec une seule colonie de bactéries E. coli OP 50 dans trois millilitres de bouillon liquide LB, cultivé dans un agitateur à 37 degrés Celsius pendant six à huit heures. Transférez la culture OP 50 dans un nouveau flacon contenant 500 millilitres de bouillon LB et cultivez-la pendant la nuit pour que les bactéries atteignent la saturation si nécessaire.

Préparer une dilution appropriée de la culture OP 50 pour la mesure de l’absorbence à OD 600. Pour déterminer la concentration en bactéries, granulez les bactéries par centrifugation à 1500 G pendant 20 minutes. Retirez le surnageant et remettez les bactéries en suspension à une concentration d’un fois 10 à la 12e UFC par millilitre.

Maintenant, préparez des cultures de bactéries de 10 millilitres dans six concentrations différentes, allant d’une fois 10 de la 12e à une fois 10 de la septième UFC par pipette d’un millilitre. Pointez deux millilitres de culture bactérienne au centre d’une plaque de N GM solidifié de 60 millimètres. Évitez de toucher la surface de la plaque avec la pointe de la pipette car les entailles à la surface permettent aux vers de s’enfouir dans les aérations.

Placez les assiettes dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure. Appliquez ensuite 10 microlitres de 100 milligrammes par millilitre de soin carbonique et 10 microlitres de 50 milligrammes par millilitre de mycine dans chaque assiette pour une croissance au repos des bactéries. Conservez les assiettes contenant différentes concentrations de bactéries tuées par les antibiotiques à quatre degrés Celsius pour une utilisation future jusqu’à un mois.

Il est important de préparer et de stocker suffisamment de plaques, de préférence le même lot pour l’ensemble de l’usine. Faites des expériences au moins un à deux jours à l’avance pour vérifier la viabilité de la bactérie. Grattez quelques bactéries des plaques SDR et étalez-les sur une plaque N GM vide avec du carbonique, du sein et de l’antimycine.

Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant six à huit heures et confirmez l’absence de croissance bactérienne. Pour la plupart des études liées aux RDS, telles que l’analyse de la durée de vie et le profilage de la production de descendance, la préparation d’une population de vers synchronisée par âge est essentielle. À l’aide d’un ramasseur de vers de platine, transférez de 20 à 30 adultes actifs sur plusieurs plaques NGM régulières.

Avec OP 50. Selon le nombre d’œufs requis pour les expériences, un plus grand nombre d’adultes peut être nécessaire. Laissez les assiettes à 20 degrés Celsius pendant quatre heures pour permettre la ponte.

Retirez les adultes de la plaque et inspectez visuellement les plaques pour les œufs. Continuez à incuber les plaques à 20 degrés Celsius pour permettre à la progéniture de se développer jusqu’à la fin de L quatre jours et un stade adulte. Habituellement, cela prend trois jours pour N, deux vers de type sauvage à 20 degrés Celsius.

Pour l’analyse de la durée de vie. Transférez les vers adultes de 10 à 12 jours sur une plaque SDR pour initier la restriction alimentaire. Pour obtenir une puissance statistique suffisante, utilisez un total de 60 à 100 vers pour chaque condition SDR.

Évaluez la viabilité de chaque ver tous les deux à trois jours jusqu’à ce que tous les vers soient morts. Il est important de transférer les vers sur des plaques SDR neuves tous les deux jours pour éviter la famine. Cette courbe d’étalonnage trace la concentration d’OP 50 par rapport à OD 600.

L’équation générée par l’analyse de régression linéaire peut être utilisée pour tous les calculs futurs des concentrations de bactéries OP 50. Cette étude teste l’effet des traitements chroniques SDR sur la durée de vie moyenne de différentes souches de vers par rapport à une réponse dose-dépendante normale des vers sauvages à SDR. L’effet de durée de vie de la SDR est partiellement supprimé par la surexpression de DR 2, tandis que la mutation DAF 16 MU 86 n’a aucun effet sur l’allongement de la durée de vie induite par la SDR.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer Dian sur le jeu standard basé sur l’AGA dans l’élégance de la mer.