Name: Sept étapes pour Stellate Cellules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Apprenez à isoler les cellules stellaires hépatiques de foie de souris par perfusion enzymatique et centrifugation en gradient de densité. Cette méthode fournit une haute pureté cellulaire pour la recherche en biologie cellulaire hépatique.

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Ce travail a été financé par le Prix de la famille Smith pour l&#39;excellence en recherche biomédicale et les NIH RO1 AI083426-01 (FW). Patrick Maschmeyer et Melanie Flach sont soutenus par des bourses de doctorat de la Fondation de Boehringer Ingelheim.

Souris C57BL / 6 doit être utilisé à ~ 20 semaines d'âge ou plus âgés. L'utilisation de souris mâles pesant 25-30g est recommandée. Le rendement des cellules étoilées peut être augmentée par l'alimentation des souris de la vitamine A régime enrichi pour 2 mois avant l'isolement de cellules étoilées. Environ 2x10 5 cellules étoilées du foie peut être purifié à partir du foie d'un C57BL / 6 de la souris, alors que le rendement des cellules étoilées du souris Balb / c est considérablement plus élevé. Le protocole suivant est ajusté à 5 souris. Et soins des animaux d'expérimentation ont été effectuées en conformité avec soin des animaux et des protocoles approuvés institutionnels Comité utilisation. 1. En perfusion in situ du foie de souris avec des enzymes digestives <ol><li> Chauffer le tampon SC1 et solutions pour perfusions d'enzymes dans un bain d'eau à 37 ° C. </li><li> Monter une perfusion ailée mis sur le tube de silicone d'une pompe péristaltique. </li><li> Calibrer la pompe avec du PBS pour obtenir un écoulement laminaire de 6.5ml/min, qui est le débit qui sera utilisé pour la perfusion in situ dans le foie. Equilibrer le tube en silicone avec SC1 solution. </li><li> Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de kétamine (90 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) de solution et de test pour la perte des réflexes pour assurer narcotisation profonde. </li><li> Fixer la souris en position couchée sur un support adapté. </li><li> Utilisez des ciseaux et des pinces à effectuer une incision longitudinale dans la peau de l'abdomen et d'exposer le péritoine. </li><li> Ouvrez soigneusement le péritoine et déplacer les intestins hors de la cavité abdominale sur le côté gauche de l'animal afin d'exposer la veine porte. </li><li> Insérer la canule de l'ensemble de perfusion dans la veine porte. Pour cette étape, l'utilisation d'un stéréomicroscope est recommandée. </li><li> Démarrer la perfusion du foie avec la solution SC1 30ml. Ouvrez la veine cave inférieure immédiatement après l'ouverture de la circulation. Succès de rinçage du foie est indiquée par une perte de couleur du tissu hépatique. </li><li> Perfuser le foie avec la solution E Pronase 30ml. Lors de la digestion réussie, les lobes du foie se gonflent, et les lobules apparaissent distincts à travers la capsule. </li><li> Perfuser le foie avec une solution collagénase P 30ml. Le foie à ce point a perdu sa forme et regarde atone et amorphe. </li><li> Soigneusement séparés du foie au diaphragme et les organes environnants et le stocker dans 70ml SC2 solution sur la glace. </li><li> Répétez la procédure pour les souris supplémentaires. </li></ol> 2. Dans la digestion in vitro de foies de souris Toutes les autres étapes de travail devrait être effectué dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. <ol><li> Couper les foies en morceaux d'environ 3 2x2x2mm l'aide de ciseaux pointus. </li><li> Combinez la suspension de 70ml SC2 y compris les morceaux de foie avec 50 ml de pronase E-collagénase solution P et ajouter 1 ml de solution de DNase I. </li><li> Recueil des foies pendant 20min à 37 ° C tout en remuant. </li></ol> 3. Centrifugation en gradient de densité <ol><li> Filtrer la suspension des cellules à travers les tamis cellulaire 70μm dans des tubes Falcon 50 ml et 6 ajouter jusqu'à 50ml avec SC2 tampon. Centrifuger pendant 10 minutes à 600g à 4 ° C. </li><li> Aspirer délicatement 40ml de surnageant, puis ajouter 150μl de DNase I solution à chaque tube et remettre les cellules. </li><li> Piscine des suspensions cellulaires en tubes 50ml Falcon 4 et lavez avec GBSS-B, centrifugeuse pour 10min à 600 g et 4 ° C. </li><li> Aspirer délicatement autant que possible le surnageant sans perturber le culot et ajouter 150μl de DNase I solution à chaque tube. Resuspendre les culots cellulaires dans 10 ml GBSS-B par tube. </li><li> Piscine des cellules dans des tubes Falcon 50 ml et ajouter 2 GBSS-B pour un volume total de 36ml par tube. Ajouter 14ml Nycodenz solution à chaque tube et bien mélanger. </li><li> Transfert de 10ml de la suspension de cellules dans un tube de centrifugation en gradient de 12ml, résultant en 10 tubes au total. Doucement superposition de la suspension cellulaire avec 1.5ml GBSS-B par tube. </li><li> Centrifuger les gradients pour 15min à 1500g et 4 ° C sans frein. Par la suite, les hépatocytes sera granulés au fond du tube tandis que les cellules étoilées sont trouvés dans l'interphase comme un anneau blanc. </li><li> Soigneusement la récolte de l'interphase contenant les cellules étoilées et les laver avec GBSS-B; centrifugeuse pendant 10 minutes à 600g à 4 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 20 ml de DMEM complété avec inactivé à la chaleur 10% de FBS, HEPES 1% de pénicilline / streptomycine, 2 mM L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, et 10mm. Transférer les cellules dans des flacons de culture de tissu avec une concentration de 2x10 4 cellules / cm 2. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Changer les médias dès que les cellules étoilées du foie sont adhérentes (environ 2h après la préparation) pour laver les cellules mortes et les débris cellulaires. </li><li> Le jour suivant, la cellule stellaires devraient développer leur caractéristique en forme d'étoile avec la morphologie des vésicules périnucléaires vitamine lipide A-stockage. </li><li> Pour les expériences ultérieures, les cellules étoilées du foie peut être facilement détaché de surfaces en plastique non revêtus en utilisant des solutions douces enzymatiques tels que Accutase, par exemple </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Suite à la préparation des cellules étoilées du foie en utilisant le protocole fourni, la pureté de la population isolée peut être testé considérer trois caractéristiques majeures de ce type cellulaire, comme ressemblant à une étoile forme, gouttelettes lipidiques périnucléaire, et l'expression de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP ). Images représentant pour l'aspect caractéristique des cellules étoilées hépatiques 2h après l'isolement cellulaire, ainsi que le jour 1 et 3 de la culture in vitro sont représentés dans la figure 1. La figure 2 montre une coloration représentative d'immunofluorescence pour la GFAP dans les cellules étoilées du foie, qui ont été cultivées pendant 3 jours suivant l'isolement cellulaire. Cellules étoilées du foie se différencier en cellules myofibroblastique au cours de culture in vitro. Une caractéristique caractéristique de ces cellules étoilées activées est l'expression de l'alpha actine musculaire lisse (αSMA). La figure 3 montre immunofluorescence pour la ZGSA et la myosine IIA dans les cellules étoilées activées au jour 7 de la culture in vitro. <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Morphologie caractéristique des cellules étoilées du foie. Cellules étoilées ont été isolés à partir de foies de souris en utilisant le protocole fourni. Les images dépeignent étoilées 2h cellules après l'isolement cellulaire (a, b), ainsi que le jour 1 (c) et le jour 3 (d) de la culture in vitro. Cellules étoilées hépatiques présentent des quantités élevées de vésicules lipidiques sur les sites périnucléaire et acquièrent leur distinctifs astral, comme la morphologie pendant les premiers jours de culture in vitro (grossissement 200x). <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 cellules. Étoilées du foie expriment spécifiquement la GFAP dans le foie. Cellules étoilées ont été isolés et immunofluorescently colorées pour la GFAP (en rouge) au jour 3 de culture in vitro. Noyaux cellulaires sont représentées en bleu (Hoechst tache). <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 cellules. Étoilées du foie différencient en myofibroblastes. Cellules étoilées hépatiques isolées de souris C57BL / 6 ont été cultivés pendant 7 jours. Par la suite, ils ont été transférés aux diapositives de chambre et colorées pour Asma (en rouge) et la myosine IIA (représentée en vert). Les noyaux des cellules ont été contre avec Hoechst (bleu). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> SC1 Tampon </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 190mg </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> 900mg </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 ml de solution stock 1M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 400mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 151mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 x H 2 O </td><td> 78mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 350mg </td></tr><tr><td> Rouge de phénol </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> remplir jusqu'à 1l </td></tr><tr><td colspan="2"> SC2 Tampon </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2 H 2 O </td><td> 560mg </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10ml de solution stock 1M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 400mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 151mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 x H 2 O </td><td> 78mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 350mg </td></tr><tr><td> Rouge de phénol </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> remplir jusqu'à 1l </td></tr><tr><td colspan="2"> GBSS-A Tampon </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 370mg </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2 H 2 O </td><td> 225mg </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> 991mg </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 30mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6 H 2 O </td><td> 210mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7 H 2 O </td><td> 70mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 75mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 227mg </td></tr><tr><td> Rouge de phénol </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> remplir jusqu'à 1l </td></tr><tr><td colspan="2">GBSS-tampon B </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2 H 2 O </td><td> 225mg </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> 991mg </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 370mg </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 30mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6 H 2 O </td><td> 210mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7 H 2 O </td><td> 70mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 75mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 227mg </td></tr><tr><td> Rouge de phénol </td><td> 6mg </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> remplir jusqu'à 1l </td></tr><tr><td colspan="2"> Solution pronase E perfusion </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> 100mg (4000 PU / mg min) </td></tr><tr><td> SC2 Tampon </td><td> 200ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Solution de collagénase perfusion P </td></tr><tr><td> Collagénase P </td><td> 85 mg (1,78 U / mg lyo) </td></tr><tr><td> SC2 Tampon </td><td> 200ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Pronase E-collagénase solution p </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> 50mg (4000 PU / mg min) </td></tr><tr><td> Collagénase P </td><td> 85 mg (1,78 U / mg lyo) </td></tr><tr><td> SC2 Tampon </td><td> 50ml </td></tr><tr><td colspan="2"> DNase I Solution </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 6mg (ca. 2000U/mg) </td></tr><tr><td> GBSS-B </td><td> 3ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Solution Nycodenz </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> 8g </td></tr><tr><td> GBSS-A </td><td> 28ml </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Tampons et solutions enzyme nécessaire pour l'isolement de cellules étoilées du foie. Le pH de tous les tampons doit être ajustée à 7.3 à 7.4. Par ailleurs, la filtration stérile de tous les tampons est recommandée. Il est important d'adapter la quantité d'enzyme utilisée en fonction de l'activité enzymatique donnée.

<ol><li>Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+protean%2C+multifunctional%2C+and+enigmatic+cells+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver.</a> Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).</li>
<li>Geerts, A. H. istory <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heterogeneity%2C+developmental+biology%2C+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).</li>
<li>Gressner, A. M. &amp, Weiskirchen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+pathogenetic+concepts+of+liver+fibrosis+suggest+stellate+cells+and+TGF-beta+as+major+players+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets.</a> J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).</li>
<li>Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+role+in+microcirculation+and+pathophysiology+of+portal+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension.</a> Gut. 50, 571-581 (2002).</li>
<li>Winau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ito+cells+are+liver-resident+antigen-presenting+cells+for+activating+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses.</a> Immunity. 26, 117-129 (2007).</li>
<li>Minicis, S. D. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+during+hepatic+stellate+cell+activation+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo.</a> Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).</li>
<li>Knittel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+liver+myofibroblasts+and+hepatic+stellate+cells+in+normal+and+diseased+rat+livers%3A+distinct+roles+of+%28myo-%29fibroblast+subpopulations+in+hepatic+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair.</a> Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).</li>
</ol>

Cellules étoilées du foie réguler essentielles des processus physiologiques et physiopathologiques dans le foie. Par ailleurs, les cellules étoilées possèdent des propriétés présentant un antigène, les rendant une composante importante de la réponse immunitaire hépatique. Bien que les cellules étoilées hépatiques comprennent 10-15% du nombre total de cellules dans le foie, l&#39;isolement de ces cellules est difficile en raison de leur localisation dans l&#39;espace de Disse périsinusoïdales. <p class="jove_content"...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom de réactif </th><th> Société </th><th> Catalogue No. </th></tr><tr><td> Passoire cellulaire 70μm </td><td> BD </td><td> 352350 </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2 H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> Collagénase P </td><td> Roche </td><td> 11249002001 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11960 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21 à 031 cv- </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Fluka </td><td> 3777 </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td></tr><tr><td> Tubes centrifugation en gradient </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 163160 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6 H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 63068 </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 O x </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2773 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71643 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 x H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71507 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71628 </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> Accudenz AG </td><td> AN7050/BLK </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> Pompe péristaltique </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-7523-70 </td></tr><tr><td> Rouge de phénol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4633 </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> Calbiochem </td><td> 7433-2 </td></tr><tr><td> Tube de silicone </td><td> Masterflex </td><td> HV-96440-14 </td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> Flacon de culture tissulaire (25cm 2) </td><td> BD </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> Ensemble de perfusion Winged </td><td> Terumo </td><td> 1SV27EL </td></tr></tbody></table>

sept étapes pour stellate cellules

Seven Steps to Stellate Cells

Cellules étoilées du foie sont le foie-résident des cellules de morphologie en forme d&#39;étoile et sont situés dans l&#39;espace de Disse entre les cellules endothéliales sinusoïdales du foie et de 1,2 hépatocytes. Cellules étoilées sont dérivées à partir de précurseurs de moelle osseuse et de stocker jusqu&#39;à 80% de la vitamine A totale du corps 1, 2. Lors de l&#39;activation des cellules étoilées se différencier en myofibroblastes pour produire la matrice extracellulaire, contribuant ainsi à 3 fibrose hépatique. Basé sur leur capacité à se contracter, les cellules étoilées myofibroblastique peut réguler le tonus vasculaire associée à l&#39;hypertension portale 4. Récemment, nous avons démontré que les cellules étoilées du foie sont des cellules présentant l&#39;antigène puissants et peuvent activer les cellules NKT ainsi que les lymphocytes T conventionnels 5. Nous présentons ici une méthode pour la préparation efficace des cellules étoilées du foie à partir du foie de souris. En raison de leur localisation périsinusoïdales, l&#39;isolement de cellules étoilées du foie est un processus multi-étapes. Afin de rendre accessibles les cellules étoilées à l&#39;isolement de l&#39;espace de Disse, foies de souris sont perfusées in situ avec le E enzymes digestives pronase et la collagénase P. perfusion Après, le tissu hépatique est soumis à un traitement enzymatique supplémentaire avec pronase E et P dans la collagénase vitro. Par la suite, la méthode tire parti de l&#39;énorme quantité de gouttelettes lipidiques de vitamine A-stockage dans les cellules étoilées du foie. Cette fonctionnalité permet la séparation des cellules étoilées du foie d&#39;autres types de cellules par centrifugation sur un gradient de 8% Nycodenz. Le protocole décrit ici donne une population très pure et homogène de cellules étoilées. Pureté de la préparation peut être évaluée par coloration de la molécule marqueur protéique fibrillaire gliale acide (GFAP), avant l&#39;analyse par microscopie à fluorescence ou cytométrie en flux. En outre, la microscopie optique révèle l&#39;aspect unique de la forme d&#39;étoile cellules étoilées du foie qui abritent de grandes quantités de gouttelettes lipidiques. Pris ensemble, nous présentons un protocole détaillé pour l&#39;isolement efficace des cellules étoilées du foie, y compris des images représentatives de leur aspect morphologique et d&#39;expression GFAP qui aident à définir l&#39;entité de cellules étoilées.

Nous décrivons ici une méthode pour l&#39;isolement de cellules étoilées du foie à partir du foie de souris. Pour la purification de cellules étoilées, les foies de souris sont digérés<em&gt; In situ</em&gt; Et<em&gt; In vitro</em&gt; Par la pronase-collagénase traitement préalable à la centrifugation en gradient de densité. Cette technique rendements très pure cellules étoilées du foie.

Sept étapes pour Stellate Cellules

Les cellules stellaires hépatiques sont des cellules résidentes du foie de morphologie étoilée, situées dans l'espace de Disse entre les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les cellules étoilées hépatiques à partir du foie de souris. Cela est réalisé en effectuant d'abord une perfusion in situ du foie de souris avec des enzymes digestives. Après la perfusion, les foies sont découpés en petits morceaux afin d'augmenter l'efficacité de la digestion in vitro, qui est réalisée ensuite.En dernière étape, les cellules étoilées hépatiques sont séparées des autres types cellulaires hépatiques par une centrifugation en gradient de densité. En fin de compte, les cellules étoilées hépatiques sont obtenues et leur pureté peut être évaluée par microscopie optique et microscopie à immunofluorescence. La procédure sera démontrée par Patrick Meyer, étudiant diplômé d'un laboratoire. En prévision de la perfusion NC2 des foies de souris, réchauffez d'abord les solutions de perfusion SC1 et enzymatique dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.Ensuite, configurez la pompe péristaltique afin d'obtenir un écoulement laminaire de 6,5 millilitres par minute et équilibrez le tube en silicone de la pompe avec la solution SC un. Vérifiez maintenant, par la perte des réflexes, que la souris anesthésiée est profondément sédée. Puis fixez la souris en position dorsale sur une base appropriée.Utilisez des ciseaux et une pince pour pratiquer une incision longitudinale dans la peau abdominale et exposez le péritoine. Ouvrez soigneusement le péritoine et déplacez les intestins hors de la cavité abdominale vers le côté gauche de l'animal afin d'exposer la veine porte. L'aspect le plus délicat de cette procédure est la perfusion zeto des foies avec des enzymes digestives, qui sera démontrée.Ensuite, il est important d'utiliser un microscope stéréo lors de l'insertion de la canule et de surveiller attentivement les changements dans les structures du foie pendant la perfusion. En travaillant sous un microscope stéréo, insérez la canule du dispositif d'infusion dans la veine porte. Commencez la perfusion du foie avec 30 millilitres de solution SC un. Ouvrez immédiatement la veine cave inférieure juste après le début du flux.Un lavage réussi du foie se manifeste par une perte de couleur du tissu hépatique. Ensuite, examinez le foie avec 30 millilitres de solution de pronase E. Les lobes hépatiques gonfleront et les lobules apparaîtront distincts à travers la capsule après perfusion avec la solution de pronase E, suivie d'une perfusion avec 30 millilitres de solution de collagénase P. Lorsque la perfusion avec la collagénase P est terminée, prélève le foie de la souris en le disséquant soigneusement du diaphragme et des organes environnants, puis stocke-le dans 70 millilitres de solution SC deux sur de la glace.Le foie a perdu sa forme à ce stade et apparaît atonique et amorphe. La procédure de digestion des foies de souris doit être réalisée en conditions stériles. Dans une hotte à flux laminaire.Utilisez des ciseaux bien aiguisés pour découper les foies en morceaux d’environ deux sur deux sur deux millimètres cubes. Ensuite, mélangez la suspension de 70 millilitres de SC deux et les morceaux de foie avec 50 millilitres de solution de protéase E collagénase P. Ajoutez un millilitre de solution d’ADN et digérez les foies pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius sous agitation.Après la digestion enzymatique du tissu hépatique, les cellules étoilées sont séparées des autres types cellulaires hépatiques par une centrifugation en gradient de densité. Pour commencer cette procédure, filtrez la suspension cellulaire à travers des tamis cellulaires de 70 micromètres dans six tubes coniques de 50 millilitres et lavez les cellules avec le tampon E deux en centrifugeant pendant 10 minutes à 600 Gs et à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, aspirez soigneusement 40 millilitres du surnageant de chaque tube.Ensuite, ajouter 150 microlitres de solution d'ADN, une solution par tube, et resuspendre les cellules. Rassembler les suspensions cellulaires dans quatre tubes Falcon de 50 millilitres et laver par centrifugation G-B-S-S-P pendant 10 minutes à 600 G et à 4 degrés Celsius. Aspirer soigneusement le plus possible du surnageant sans perturber le culot, puis ajouter 150 microlitres de solution d'ADN, une solution par tube.Nous suspendons les culots cellulaires dans 10 millilitres de G-B-S-S-B par tube. Regrouper les cellules dans deux tubes Falcon de 50 millilitres et ajouter du G-B-S-S-B jusqu'à un volume total de 36 millilitres par tube. Ajouter 14 millilitres de solution dénaturante à chaque tube et mélanger soigneusement.Ensuite, transférez 10 millilitres de la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation par gradient de 12 millilitres, pour un total de 10 tubes. Superposez délicatement 1,5 millilitre de G-B-S-S-B par tube sur la suspension cellulaire. Effectuez la centrifugation des gradients pendant 15 minutes à 1500 G et à 4 degrés Celsius sans frein.Ensuite, les hépatocytes seront en pellet au fond du tube, tandis que les cellules étoilées se trouveront à l'interface sous forme d'un anneau blanc. À l'aide d'une pipette de cinq millilitres, prélevez soigneusement l'interface contenant les cellules étoilées et transférez-la dans un tube de 50 millilitres. Lavez les cellules en ajoutant du G-B-S-S-B et en centrifugeant pendant 10 minutes à 600 Gs et à quatre degrés Celsius.Aspirez le surnageant et resuspendez les cellules dans 20 millilitres de DMEM avec suppléments. Après avoir dénombré les cellules, transférez-les dans des flacons de culture tissulaire à une concentration de deux fois 10 puissance quatre cellules par centimètre carré, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Environ deux heures après leur préparation, les cellules étoilées hépatiques doivent être adhérentes ; changez le milieu afin d'éliminer les cellules mortes et les débris cellulaires.Remettre les cellules dans l’incubateur. Des résultats représentatifs de la préparation de cellules étoilées hépatiques à partir de foies de souris à l’aide de ce protocole sont présentés ici. Les cellules au jour un et au jour trois de culture in vitro montrent la morphologie caractéristique des cellules étoilées hépatiques. Elles ont une forme astrocytaire et présentent un stockage de vésicules lipidiques.Au niveau des sites péri-nucléaires, la pureté des cellules étoilées hépatiques isolées peut également être vérifiée par l'expression de la protéine acide fibrillaire gliale, ou GFAP. Ces images montrent une coloration immunofluorescente représentative de la GFAP, en rouge, dans les cellules étoilées hépatiques, cultivées pendant trois jours après l'isolement cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des cellules étoilées hépatiques à partir de foie de rat afin d'obtenir un rendement adéquat de cellules étoilées pures.Il est important de garantir une digestion efficace lors de la perfusion hépatique. Enfin, il est essentiel de déterminer l'entité adéquate des cellules isolées en évaluant la morphologie et le phénotype des cellules hépatiques dal.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dérivation de précurseurs d'neuroépithéliales souches embryonnaires (ES), les cellules stromales en utilisant l'activité induisant des cellules dérivées (SDIA).

ES Cell dérivé des cultures cellulaires neuroépithéliales

Cette vidéo démontre un protocole de différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines en progéniteurs cérébelleux. Il s’agit de transférer des colonies de cellules souches sur une plaque de fixation ultra-faible pour former des corps embryoïdes, favorisant la différenciation avec des facteurs de croissance, puis de transférer les corps embryoïdes sur une plaque recouverte de matrice pour l’adhésion. Les étapes suivantes consistent à induire la migration cellulaire et à...

Technique de génération d’une monocouche 2D de cellules cérébelleuses à partir de cellules souches pluripotentes induites

Le Stentor coeruleus cilié géant est un système classique pour l’étude de la régénération et de la cicatrisation des plaies dans des cellules uniques. En imageant simultanément les cellules de Stentor à faible et à fort grossissement, il est possible de mesurer les flux cytoplasmiques avant, pendant et après la blessure.

Visualisation du flux cytoplasmique pendant la cicatrisation d’une plaie unicellulaire chez Stentor coeruleus

Cet article fournit des méthodologies détaillées pour l'utilisation de trois dimensions (3D) des essais pour quantifier l'invasion des cellules du cancer du sein. Plus précisément, nous discutons les procédures nécessaires pour mettre en place de tels essais, la quantification et l'analyse des données, ainsi que des méthodes pour examiner la perte de l'intégrité de la membrane qui se produit lorsque les cellules envahissent.

Quantification du cancer du sein cellulaire envahissement aide d&#39;un (3D) du modèle en trois dimensions

L’hétérogénéité transcriptionnelle au sein des cellules stromales dérivées du tissu adipeux humain peut être définie au niveau de la cellule unique à l’aide de marqueurs de surface cellulaire et de gènes ostéogéniques.  Nous décrivons un protocole utilisant la cytométrie en flux pour l’isolement de sous-populations cellulaires ayant un potentiel ostéogénique accru, qui peut être utilisé pour améliorer la reconstruction du squelette craniofacial.

Isolement et enrichissement du tissu adipeux humain cellules stromales pour ostéogenèse accrue

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) ont la capacité intrinsèque de différencier et d'auto-organisation dans des modèles de tissus distincts; bien que cela nécessite la présentation des gradients environnementaux spatiales. Nous présentons stencil micromodelage comme une méthode simple et robuste pour générer des gradients biochimiques et mécaniques pour le contrôle des motifs de différenciation HPSC.

Stencil micromodelage des pluripotentes humaines Cellules souches pour Probing Organisation spatiale des Différenciation Fates

Nous présentons un protocole pour microscopie STED simultanément les structures image actine, microtubules et protéines microtubule bout plus contraignantes dans les cellules de B qui se sont propagés sur lamelles recouvertes d’anticorps dirigés contre le récepteur des cellules B, un modèle pour la phase initiale de formation de la synapse immunitaire.

Visualisation de l’actine et microtubules cytosquelettes à la Synapse immunitaire de B-cellule émission stimulée par épuisement (STED) microscopie

Ce protocole présente un système original, robuste, et reproductible de culture pour générer et faire croître les sphéroïdes tridimensionnels des cellules caco2 d’adénocarcinome de deux points. Les résultats fournissent la première preuve de concept de la pertinence de cette approche pour étudier la biologie des cellules souches cancéreuses, y compris la réponse à la chimiothérapie.

Un modèle tridimensionnel des sphéroïdes pour étudier les cellules souches du cancer du côlon

Les changements pathophysiologiques du système nerveux autonome cardiaque, particulièrement dans sa branche sympathique, contribuent au début et à l’entretien des arythmies ventriculaires. Dans le protocole actuel, nous montrons comment caractériser les ganglions radiés murins pour améliorer la compréhension des processus moléculaires et cellulaires sous-jacents.

Emplacement, dissection et analyse du ganglion radié murin

Ici, nous décrivons un protocole simple pour l’isolement et la coloration des cellules de moelle osseuse murine en cellules souches et progénitrices hématopoïétiques phénotypiques ainsi que les cellules souches endothéliales et mésenchymateuses de niche. Une méthode d’enrichissement des cellules situées dans les zones endostéales et centrales de la moelle osseuse est également incluse.

Analyse par cytométrie en flux de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques de moelle osseuse murine et de cellules de niche stromale

Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement, la purification et la culture des cellules marginales primaires à partir de la strie vasculaire de la souris, ainsi que pour établir des modèles in vitro du stress oxydatif et de la sénescence cellulaire afin d’étudier les troubles de la paroi latérale cochléaire.

Isolement et culture des cellules marginales primaires de la strie vasculaire à partir de souris néonatales

Apprenez à isoler les cellules stellaires hépatiques de foie de souris par perfusion enzymatique et centrifugation en gradient de densité. Cette méthode fournit une haute pureté cellulaire pour la recherche en biologie cellulaire hépatique.

Sept étapes pour Stellate Cellules

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