Sept étapes pour Stellate Cellules

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les cellules étoilées hépatiques à partir du foie de souris. Cela est réalisé en effectuant d'abord une perfusion in situ du foie de souris avec des enzymes digestives. Après la perfusion, les foies sont découpés en petits morceaux afin d'augmenter l'efficacité de la digestion in vitro, qui est réalisée ensuite.

En dernière étape, les cellules étoilées hépatiques sont séparées des autres types cellulaires hépatiques par une centrifugation en gradient de densité. En fin de compte, les cellules étoilées hépatiques sont obtenues et leur pureté peut être évaluée par microscopie optique et microscopie à immunofluorescence. La procédure sera démontrée par Patrick Meyer, étudiant diplômé d'un laboratoire. En prévision de la perfusion NC2 des foies de souris, réchauffez d'abord les solutions de perfusion SC1 et enzymatique dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Ensuite, configurez la pompe péristaltique afin d'obtenir un écoulement laminaire de 6,5 millilitres par minute et équilibrez le tube en silicone de la pompe avec la solution SC un. Vérifiez maintenant, par la perte des réflexes, que la souris anesthésiée est profondément sédée. Puis fixez la souris en position dorsale sur une base appropriée.

Utilisez des ciseaux et une pince pour pratiquer une incision longitudinale dans la peau abdominale et exposez le péritoine. Ouvrez soigneusement le péritoine et déplacez les intestins hors de la cavité abdominale vers le côté gauche de l'animal afin d'exposer la veine porte. L'aspect le plus délicat de cette procédure est la perfusion zeto des foies avec des enzymes digestives, qui sera démontrée.

Ensuite, il est important d'utiliser un microscope stéréo lors de l'insertion de la canule et de surveiller attentivement les changements dans les structures du foie pendant la perfusion. En travaillant sous un microscope stéréo, insérez la canule du dispositif d'infusion dans la veine porte. Commencez la perfusion du foie avec 30 millilitres de solution SC un. Ouvrez immédiatement la veine cave inférieure juste après le début du flux.

Un lavage réussi du foie se manifeste par une perte de couleur du tissu hépatique. Ensuite, examinez le foie avec 30 millilitres de solution de pronase E. Les lobes hépatiques gonfleront et les lobules apparaîtront distincts à travers la capsule après perfusion avec la solution de pronase E, suivie d'une perfusion avec 30 millilitres de solution de collagénase P. Lorsque la perfusion avec la collagénase P est terminée, prélève le foie de la souris en le disséquant soigneusement du diaphragme et des organes environnants, puis stocke-le dans 70 millilitres de solution SC deux sur de la glace.

Le foie a perdu sa forme à ce stade et apparaît atonique et amorphe. La procédure de digestion des foies de souris doit être réalisée en conditions stériles. Dans une hotte à flux laminaire.

Utilisez des ciseaux bien aiguisés pour découper les foies en morceaux d’environ deux sur deux sur deux millimètres cubes. Ensuite, mélangez la suspension de 70 millilitres de SC deux et les morceaux de foie avec 50 millilitres de solution de protéase E collagénase P. Ajoutez un millilitre de solution d’ADN et digérez les foies pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius sous agitation.

Après la digestion enzymatique du tissu hépatique, les cellules étoilées sont séparées des autres types cellulaires hépatiques par une centrifugation en gradient de densité. Pour commencer cette procédure, filtrez la suspension cellulaire à travers des tamis cellulaires de 70 micromètres dans six tubes coniques de 50 millilitres et lavez les cellules avec le tampon E deux en centrifugeant pendant 10 minutes à 600 Gs et à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, aspirez soigneusement 40 millilitres du surnageant de chaque tube.

Ensuite, ajouter 150 microlitres de solution d'ADN, une solution par tube, et resuspendre les cellules. Rassembler les suspensions cellulaires dans quatre tubes Falcon de 50 millilitres et laver par centrifugation G-B-S-S-P pendant 10 minutes à 600 G et à 4 degrés Celsius. Aspirer soigneusement le plus possible du surnageant sans perturber le culot, puis ajouter 150 microlitres de solution d'ADN, une solution par tube.

Nous suspendons les culots cellulaires dans 10 millilitres de G-B-S-S-B par tube. Regrouper les cellules dans deux tubes Falcon de 50 millilitres et ajouter du G-B-S-S-B jusqu'à un volume total de 36 millilitres par tube. Ajouter 14 millilitres de solution dénaturante à chaque tube et mélanger soigneusement.

Ensuite, transférez 10 millilitres de la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation par gradient de 12 millilitres, pour un total de 10 tubes. Superposez délicatement 1,5 millilitre de G-B-S-S-B par tube sur la suspension cellulaire. Effectuez la centrifugation des gradients pendant 15 minutes à 1500 G et à 4 degrés Celsius sans frein.

Ensuite, les hépatocytes seront en pellet au fond du tube, tandis que les cellules étoilées se trouveront à l'interface sous forme d'un anneau blanc. À l'aide d'une pipette de cinq millilitres, prélevez soigneusement l'interface contenant les cellules étoilées et transférez-la dans un tube de 50 millilitres. Lavez les cellules en ajoutant du G-B-S-S-B et en centrifugeant pendant 10 minutes à 600 Gs et à quatre degrés Celsius.

Aspirez le surnageant et resuspendez les cellules dans 20 millilitres de DMEM avec suppléments. Après avoir dénombré les cellules, transférez-les dans des flacons de culture tissulaire à une concentration de deux fois 10 puissance quatre cellules par centimètre carré, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Environ deux heures après leur préparation, les cellules étoilées hépatiques doivent être adhérentes ; changez le milieu afin d'éliminer les cellules mortes et les débris cellulaires.

Remettre les cellules dans l’incubateur. Des résultats représentatifs de la préparation de cellules étoilées hépatiques à partir de foies de souris à l’aide de ce protocole sont présentés ici. Les cellules au jour un et au jour trois de culture in vitro montrent la morphologie caractéristique des cellules étoilées hépatiques. Elles ont une forme astrocytaire et présentent un stockage de vésicules lipidiques.

Au niveau des sites péri-nucléaires, la pureté des cellules étoilées hépatiques isolées peut également être vérifiée par l'expression de la protéine acide fibrillaire gliale, ou GFAP. Ces images montrent une coloration immunofluorescente représentative de la GFAP, en rouge, dans les cellules étoilées hépatiques, cultivées pendant trois jours après l'isolement cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des cellules étoilées hépatiques à partir de foie de rat afin d'obtenir un rendement adéquat de cellules étoilées pures.

Il est important de garantir une digestion efficace lors de la perfusion hépatique. Enfin, il est essentiel de déterminer l'entité adéquate des cellules isolées en évaluant la morphologie et le phénotype des cellules hépatiques dal.