Propension oligomérisation domaine transmembranaire déterminée par dosage ToxR

L’objectif général de l’expérience suivante est d’étudier les propensions à la ligamentisation des protéines, des domaines transmembranaires ou des DM T dans un environnement membranaire naturel. Ceci est réalisé en exprimant le domaine transmembranaire d’intérêt chez e coli en tant que protéine chimérique avec la protéine de liaison au maltose pour la localisation dans le périplasme et la tox. R en tant que rapporteur transcriptionnel, la ligamentisation induite par le domaine transmembranaire entraîne la dimérisation de tox R et l’activation de la transcription LXi Dans un deuxième temps, les cellules sont lysées et traitées avec ONPG, qui est hydrolysé par bêta galacto en l’espèce absorbant la lumière O nitro pholate ou ONP.

Les niveaux ONP suivants sont quantifiés en mesurant l’absorbence de la lumière à 405 nanomètres. Afin de déterminer les niveaux de domaine transmembranaire, les résultats de ligamentisation révèlent la propension à ligamentisation des domaines transmembranaires sur la base d’un test de rapporteur de tox R. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes biophysiques existantes telles que la page SDS ou la fluorescence, est que le comportement du domaine transmembranaire est étudié dans une bicouche phospholipidique naturelle par expression dans e coli plutôt que dans un système mimétique membranaire tel qu’un détergent moi-même.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des protéines membranaires, telles que l’élucidation des principales caractéristiques structurelles impliquées dans l’association transmembranaire Helix Avant le début de ce protocole, sept plasmides exprimant la protéine chimérique requise sont préparés à partir d’oligonucléotides synthétisés commercialement, représentant le TDS d’intérêt flanqué de NHE un et BMH un. Les sites de restriction après la préparation des plasmides dégèlent doucement fhk 12 cellules compétentes sur la glace. Une fois décongelées, transférez les cellules dans des tubes de culture de 15 millilitres à 200 nanogrammes de chaque ADN plasmatique dans un tube séparé et incubez les cellules sur de la glace pendant 30 minutes.

Ensuite, choquez les cellules pendant 90 secondes à 42 degrés Celsius, puis incubez sur glace pendant deux minutes à 800 microlitres de milieu SOC et incubez les échantillons à 37 degrés Celsius en agitant pendant une heure après l’incubation, inoculez cinq millilitres de milieu LB contenant du chloramphénicol et de l’aose avec 50 microlitres du mélange de transformation en utilisant des tubes de culture de 15 millilitres en trois exemplaires pour chaque échantillon. Enfin, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius en secouant pendant 20 heures. Pour mesurer l’ensemble de la ligamentisation de l’activité de la bêta-galacto tase TDS, on détermine.

Tout d’abord, préchauffez le lecteur de plaques à 28 degrés Celsius. Utilisez du stock tampon Z pour préparer des solutions tampons Z fraîches comme décrit dans le protocole écrit. Transférez le chloroforme tampon Z du tube au réservoir, en veillant à ne canaliser que la couche aqueuse supérieure du chloroforme tampon Z.

Placez la plaque à 96 puits sur une feuille de papier avec une grille dessinée pour assurer un transfert de pipetage précis de 100 microlitres de chloroforme tampon Z dans chaque puits d’une plaque à 96 puits, suivi de cinq microlitres de chaque culture en quad. Dupliquer omettre la culture des quatre puits qui serviront de blancs. Mesurez la DO 5 95 de la plaque pour déterminer la densité cellulaire.

Ajoutez 50 microlitres de tampon Z SDS dans tous les puits de la plaque. Ensuite, agitez la plaque dans le lecteur de plaques pendant 10 minutes pour placer les cellules après la lyse cellulaire à 50 microlitres de ZPA pour ONPG vers tous les puits. Remettez la plaque dans le lecteur de plaques et mesurez OD 4 0 5 toutes les 30 secondes pendant 20 minutes.

Déterminez le niveau d’activité de la bêta-lacto-sase en calculant les unités de Miller normalisées à blanc. Le western blot est effectué pour vérifier l’expression équivalente des protéines entre les constructions. Tout d’abord, combinez 50 microlitres de cultures triplées, puis centrifugez les échantillons à l’aide d’une micro-centrifugeuse.

Retirer le surnageant par pipetage et réusation. Suspendez la pastille résiduelle dans deux tampons de chargement d’échantillons, chargez 7,5 microlitres de chaque échantillon sur un gel standard à 8 % et effectuez une électrophorèse à 125 volts pendant une heure et cinq minutes après le transfert. Incuber la membrane avec un anticorps conjugué anti M-V-P-H-R-P pour visualiser que la protéine chimérique est observée à environ 70 kilodaltons avec certains produits de dégradation parfois observés autour de 48 kilodaltons.

Une MVP endogène est également observée à 45 kilodaltons. Afin d’évaluer l’insertion membranaire correcte de la construction chimérique du TMD, la lignée cellulaire 28 déficiente en protéine de liaison au maltose est utilisée lorsqu’elle est cultivée dans un milieu minimal avec le maltose comme seule source de carbone, seules les cellules exprimant un produit d’expression intégrale membranaire avec la protéine de liaison au maltose correctement localisée dans le périplasme peuvent se développer. Transformez les cellules 28 comme décrit pour les cellules fhk 12 et inoculez deux millilitres de milieu LB.

Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius en les secouant à 300 tr/min pendant la nuit après l’incubation. Granuler les cellules par centrifugation et lavage par suspension Resus dans deux millilitres de PBS et pipetage doux avec une grande pointe. Après la granulation, les cellules sont à nouveau lavées avec du PBS pour la deuxième fois, puis effectuent une centrifugation finale et une suspension de réanimation dans un millilitre de PBS.

Utilisez 25 microlitres de cellules remises en suspension pour inoculer cinq millilitres de milieu minimal. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius en secouant pendant 15 heures. Transférez 200 microlitres de chaque échantillon dans une plaque de 96 puits et prenez la lecture OD 5 9 5 à l’aide du lecteur de plaque.

Répétez ce processus toutes les deux heures jusqu’à 25 heures. La propension à la ligamentisation de tous les domaines transmembranaires individuels de la protéine intégrale membranaire latente multiscouvrir a été analysée à l’aide du test rapporteur transcriptionnel tox R. Le domaine transmembranaire cinq présente une forte propension à l’élévation de liga, comme le démontrent les unités de Miller élevées, ce qui est comparable à la séquence de dimérisation bien établie de la GPAA de contrôle positif.

Une mutation délétère dans le domaine transmembranaire cinq D un 50 A réduit la capacité de la séquence à augmenter tous les liga LMP un, TM un ne fait pas significativement tous les liga augmenter et présente un signal d’unité de Miller très faible juste au-dessus du signal pour blank, qui est non transformé FHK 12 cellules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer si une hélice transmembranaire d’intérêt a la capacité de former des complexes d’ordre supérieur dans un environnement membranaire naturel. Lors de cette procédure, il est important de pipeter extrêmement soigneusement dans la plaque à 96 puits pour éviter les erreurs importantes et s’assurer qu’aucune bulle d’air n’est introduite.