Name: Propension oligomérisation domaine transmembranaire déterminée par dosage ToxR (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Découvrez comment évaluer la propension à l'oligomérisation des domaines transmembranaires dans E. coli en utilisant le système rapporteur ToxR. Cette méthode quantifie l'activité bêta-galactosidase pour étudier les interactions protéiques membranaires.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous remercions les National Institutes of Health (1R21CA138373 et Stand Up to Cancer (SU2C) pour les supports financiers de ce travail. HY est reconnaissante pour le Prix 2009 Elion de l&#39;American Association of Cancer Research, une Scholar Award de la Fondation Kimmel Sidney Kimmel pour Recherche sur le Cancer (SKF-08-101), et la National Science Foundation Faculté de carrière Prix précoce (NSF0954819).

1. Considérations clonage <ol><li> Oligonucléotides préparés commercialement représentant le TMD d'intérêt flanqué Nhel et des sites de restriction BamHI et 5'-phosphorylés peuvent être ligaturés dans pTox7 (modifié dans notre laboratoire par insertion d'une paire de base directement après le site de restriction BamHI 14) (figure 3) digéré séquentiellement avec BamHI et Nhel. Un oligonucléotide exemple est illustré ci-dessous: 5'ctagcTMDSEQUENCEg3 ' 3 'gTMDSEQUENCEcctag5' </li></ol> La séquence TMD devrait être de 12 à 24 résidus (courtes séquences seront probablement allongée par des résidus hydrophobes vecteur codé). Afin d'étudier l'interface, quatre variantes de la conception TMD doivent être créés là où les insertions de résidus séquentiels et concomitants de résidus suppressions entraîner la rotation de la relative au TMD ToxR. 15,16 Enfin, la concentration d'arabinose doit être variée entre 0,001 et 0,01% (p / v) d'identifier les différences de concentration où maximale β-galactosidase signaux entre les différentes séquences de TMD sont observées; tests différents niveaux d'expression est recommandé d'identifier les conditions dans lesquelles des affinités différentes peuvent être distinguées meilleurs. En plus de l'arabinose et des antibiotiques, 0,4 mM d'IPTG peut être utilisé pour améliorer les différences d'affinités entre les différents TMD. La mesure doit être effectuée ToxR au moins en quatre exemplaires. Toute la procédure doit être répétée au moins trois fois avec différentes transformations plasmide. 2. Croissance de cultures bactériennes <ol><li> Doucement le dégel FHK12 cellules compétentes (200 pi) sur la glace et le transfert dans un tube de culture de 15 ml. Ajouter l'ADN plasmidique (200 ng) et incuber les cellules sur la glace pendant 30 min. </li><li> Choc thermique des cellules par incubation pendant 90 s à 42 ° C, suivie d'une incubation sur la glace pendant 2 min. </li><li> Ajouter SOC médias (800 pi) et incuber les échantillons à 37 ° C avec agitation (300 rpm) pendant une heure </li><li> Inoculer 5 ml avec du milieu LB chloramphénicol (30 pg / ml) et de l'arabinose (0,0025% p / v) avec 50 ul du mélange de transformation dans des tubes de 15 ml de culture en trois exemplaires. Incuber les échantillons à 37 ° C avec agitation (300 rpm) pendant 20 h. (Alternativement 5 ul de la culture peut être utilisée pour inoculer 100 pi de milieu dans une plaque de 96 puits. Cette méthode est utile lorsqu'il s'agit de grands nombres d'échantillons, bien que les erreurs seront légèrement plus élevés. Afin d'éviter l'évaporation, ce qui entraînerait à l'erreur, remplir les puits ultrapériphériques avec les médias, mais ne pas les utiliser pour des échantillons. Enfin, double-envelopper le joint entre le couvercle et la plaque avec du parafilm). </li></ol> 3. Mesure de la β-galactosidase <ol><li> Préchauffer le lecteur de plaques à 28 ° C. </li><li> Transférer le Z-buffer dans un réservoir avec une grande pointe de la pipette, en veillant à ne prendre jusqu'à la partie supérieure (aqueuse) couche. Transférer 100 ul d'Z-buffer/chloroform fraîchement préparés dans les puits d'une plaque de 96 puits. Transférer 5 ul de chaque culture dans les puits de la plaque en quatre exemplaires. Omettre la culture à partir de quatre puits qui servira de vide. </li><li> Mesurer la DO 595 de la plaque afin de déterminer la densité cellulaire. </li><li> Ajouter 50 ul d'Z-buffer/SDS à tous les puits de la plaque. Agiter la plaque dans le lecteur de plaques pendant 10 minutes pour lyser les cellules. Assurez-vous que les suspensions cellulaires sont claires après lyse et répétez l'étape secouer si nécessaire. Lyse incomplète suggère la Z-buffer/chloroform n'a pas été fraîchement préparés. </li><li> Ajouter 50 ul fraîchement préparés Z-buffer/ONPG à tous les puits et retourner la plaque pour le lecteur de plaque et de mesurer OD 405 toutes les 30 s pendant 20 min. </li><li> Calculer β-galactosidase en utilisant l'équation suivante (n'oubliez pas de soustraire le vide). Le ratio de 405 OD / min devrait être calculé en utilisant tous les points de données dans la DO 405 entre 0.0 et 1.0 en utilisant un ajustement du modèle linéaire. <img src="files/ftp_upload/2721/2721eq1.jpg" alt="L'équation 1"> Miller unités diffèrent parfois quand enregistrées sur plusieurs jours. Par conséquent, une construction de référence comme AMP devrait être mesuré dans chaque essai. Ses valeurs peuvent être utilisées pour la normalisation des valeurs ToxR. </li></ol> 4. Contrôle pour l'expression protéique <ol><li> Effectuer Western blot pour vérifier l'expression des protéines, même entre les constructions. Mélanger 50 pl de la cultures en triple et centrifuger (2000 rpm, 4 min) dans une microcentrifugeuse. Eliminer le surnageant par pipetage et resuspendre le culot dans 2 résiduelle de tampon de chargement x échantillon. </li><li> Charge 7,5 ul sur un gel de la norme de 8% et de réaliser les électrophorèses à 125 V pendant 1 heure 5 min. Après le transfert, incuber avec des anti-MBP HRP-anticorps conjugué et de visualiser, la protéine chimère est observée à environ 70 kDa avec certains produits de dégradation parfois vu environ 48 kDa. MBP endogène est également observée à 45 kDa (voir Figure 5). </li></ol>5. Contrôle d'insertion membranaire correcte Une lignée cellulaire déficiente en protéine de liaison du maltose est utilisé pour évaluer insertion membranaire correcte de la construction chimérique TMD. Lorsqu'il est cultivé sur un milieu minimal avec des maltose comme seule source de carbone, que les cellules exprimant une membrane intégrale produit d'expression avec le maltose binding protein correctement localisé dans le périplasme sont capables de croître. <ol><li> Transformez PD28 cellules (comme décrit pour FHK12 cellules) et inoculer 2 ml de milieu LB. Cultiver les cellules à 37 ° C avec agitation (300 rpm) pendant la nuit. </li><li> Pellet les cellules par centrifugation à 3500 rpm, 10 min, 4 ° C et laver à la remise en suspension dans du PBS (2 ml) par pipetage doux avec un gros pourboire ou vortex doux. Pellet les cellules (comme ci-dessus), laver avec du PBS pour une deuxième fois, granulés et finalement remettre en suspension dans du PBS (1 ml). </li><li> Utilisez 25 ul de cellules en suspension pour inoculer 5 ml de milieu minimum en trois exemplaires et incuber à 37 ° C avec agitation (300 rpm). Prenez OD 595 lectures entre 15-25 h, environ toutes les 2 heures en transférant 200 ul de chaque échantillon dans une plaque de 96 puits et de la lecture en utilisant le lecteur de plaques. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Un exemple de l'utilisation du dosage de journaliste transcriptionnelle ToxR d'analyser la propension oligomérisation des domaines transmembranaires dans la figure 4. Auparavant, nous avons étudié l'oligomérisation des domaines transmembranaires de la membrane multispanning intégrante de membrane latente protéines protein-1 (LMP-1) par diverses techniques, y compris ToxR 14 domaine transmembranaire cinq (TM5) a été montré à exposer une forte propension à oligomériser.; Cela est démontré par les unités de Miller élevés, comparables à du contrôle positif, GPA, une séquence bien établie dimérisation. Une mutation délétère dans TM5, D150A, réduit la capacité de la séquence à oligomériser. LMP-1 TM1 ne modifie pas significativement oligomériser et présente un signal d'unité très faible Miller, juste au-dessus du signal pour le blanc, non-transformé FHK12 cellules. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Cartoon Figure 1. Illustrant le dosage journaliste ToxR. Domaine transmembranaire (TMD) entraîné des résultats d'oligomérisation dans la dimérisation de ToxR et l'activation de la transcription de LacZ. Le produit du gène de LacZ, β-galactosidase peut être quantifiée comme une mesure de la propension d'un TMD pour oligomériser. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Le clivage hydrolytique d'ONPG par la β-galactosidase résultats dans la production de l'espèce absorbant la lumière o-nitrophénolate (ONP). <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Carte du plasmide pToxR7. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Représentant ToxR test journaliste de la transcription d'analyser la propension oligomérisation de la membrane protein-1 latente domaines transmembranaires. 5 domaine transmembranaire (TM5) oligomérise fortement, alors que 1 domaine transmembranaire (TM1) ne présente qu'une faible interaction. D150A mutation dans TM5 réduit considérablement sa capacité à oligomériser. GPA est inclus comme une séquence de contrôle positif pour la dimérisation forte. Blank représente non transformées FHK12 cellules. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Western blot pour l'expression des protéines. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig6.jpg" alt="Figure 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. PD28 test complémentation pour contrôler insertion membranaire correcte pour le périplasme. Contrôle négatif représente une construction déficiente en protéine de liaison du maltose.

<ol><li>Parker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+the+heptahelical+G+protein+coupling+receptors%3A+a+case+for+association+using+transmembrane+helices%5BTitle%5D)+AND+%22Mini+Rev+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).</li>
<li>Mo, W., Zhang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+human+ATP-binding+cassette+transporters+and+its+potential+significance+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).</li>
<li>von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+topology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein topology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).</li>
<li>Van Horn, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+nuclear+magnetic+resonance+structure+of+membrane-integral+diacylglycerol+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase.</a> Science. 324, 1726-1729 (2009).</li>
<li>Hattori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mg%282%2B%29-dependent+gating+of+bacterial+MgtE+channel+underlies+Mg%282%2B%29+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis.</a> Embo J. 28, 3602-3612 (2009).</li>
<li>Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+distributions+in+integral+membrane+protein+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Amino acid distributions in integral membrane protein structures.</a> Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).</li>
<li>Deber, C. M., Goto, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+proteins+into+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding proteins into membranes.</a> Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).</li>
<li>Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+detection+of+hetero-association+of+glycophorin-A+and+its+mutants+within+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane.</a> J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).</li>
<li>Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p, Fritz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerisation+of+the+glycophorin+A+transmembrane+segment+in+membranes+probed+with+the+ToxR+transcription+activator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator.</a> J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).</li>
<li>Russ, W. P., Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOXCAT%3A+a+measure+of+transmembrane+helix+association+in+a+biological+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).</li>
<li>Berger, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+motif+for+integrin+transmembrane+helix+association%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Consensus motif for integrin transmembrane helix association.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).</li>
<li>Oates, J., King, G., Dixon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+oligomerization+behavior+of+PDGFbeta+receptor+transmembrane+domain+and+its+regulation+by+the+juxtamembrane+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).</li>
<li>Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hetero-assembly+between+all-L-+and+all-D-amino+acid+transmembrane+domains%3A+forces+involved+and+implication+for+inactivation+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins.</a> J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).</li>
<li>Sammond, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+peptides+used+to+investigate+the+homo-oligomeric+interface+and+binding+hot-spot+of+the+oncogene%2C+latent+membrane+protein+1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1.</a> , Forthcoming (2010).</li>
<li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization+of+the+transmembrane+domain+of+Integrin+alphaIIb+subunit+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes.</a> J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).</li>
<li>Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interface+between+self-assembling+erythropoietin+receptor+transmembrane+segments+corresponds+to+a+membrane-spanning+leucine+zipper%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper.</a> J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).</li>
<li>Finger, C., Escher, C., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single+transmembrane+domains+of+human+receptor+tyrosine+kinases+encode+self-interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions.</a> Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).</li>
</ol>

Le dosage de ToxR journaliste de la transcription est un moyen aisé d&#39;identifier les séquences transmembranaires ayant le potentiel de oligomériser. Depuis les interactions se produisent dans la membrane bactérienne interne, ce test contourne les problèmes liés à la validité des systèmes d&#39;étudier dans la membrane-mimétiques environnements. Étant donné que le clonage des PTM multiples en un seul plasmide peut facilement être fait en parallèle et le dosage complet peut être réalisée en format 96 puits plaque, ce ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Enzyme de restriction BamHI </td><td> Invitrogen </td><td> 15201023 </td><td> Invitrogen enzymes ont été jugées plus efficaces que les fournisseurs alternatifs </td></tr><tr><td> Enzyme de restriction Nhel </td><td> Invitrogen </td><td> 15444011 </td><td> Invitrogen enzymes ont été jugées plus efficaces que les fournisseurs alternatifs </td></tr><tr><td> 15 tubes de culture ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 à 956-1J </td><td></td></tr><tr><td> SOC des médias </td><td> Teknova </td><td> S0225 </td><td> Constitué au volume approprié et stérilisé par autoclavage. </td></tr><tr><td> Milieu LB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L7275 </td><td> Constitué au volume approprié et stérilisé par autoclavage. </td></tr><tr><td> Le chloramphénicol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CO 3 78 </td><td> Solution mère de 30 mg / ml dans l&#39;éthanol stocké dans un congélateur </td></tr><tr><td> Arabinose </td><td> Fluka </td><td> 10839 </td><td> Solution mère de 2,5% (p / v) dans de l&#39;eau stockée dans un congélateur </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9390 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Produits chimiques Mallinckrodt </td><td> 6858-06 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 .7 H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 63138 </td><td></td></tr><tr><td> Dodécylsulfate de sodium (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 2-nitrophényl β-D-galactopyranoside (ONPG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 73660 </td><td></td></tr><tr><td> Z-buffer </td><td></td><td></td><td> 16,1 g de Na 2 HPO 4 5.5g de NaH 2 PO 4 0,75 g de KCl 0.246g MgSO 4 Compléter à 1 l, pH 7,0 </td></tr><tr><td> Z-buffer/chloroform </td><td></td><td></td><td> 200 ml β-mercaptoéthanol, 2 ml de chloroforme, faire jusqu&#39;à 20 mL avec du Z-buffer. Vortex pendant 1 min, centrifuger 1 min à 800 tpm. Faire frais pour chaque plaque. </td></tr><tr><td> Z-buffer/SDS </td><td></td><td></td><td> 160 mg de SDS dissout dans 10 ml de Z-buffer </td></tr><tr><td> Z-buffer/ONPG </td><td></td><td></td><td> 40 mg ONPG dans 10 ml de Z-buffer. Faire frais pour chaque plaque </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-MBP anticorps monoclonal (HRP conjugué) </td><td> ONE </td><td> E8038S </td><td></td></tr><tr><td> Milieu minimal avec le maltose </td><td></td><td></td><td> 1 x sels M9, le maltose de 0,4%, à 1 mg / ml de thiamine, de 2 mM MgSO 4 </td></tr><tr><td> Plaque de 96 puits à fond plat </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1835.300 </td><td></td></tr><tr><td> Plate-lecteur </td><td> Beckman Coulter </td><td> DTX880 détecteur multimode </td><td></td></tr><tr><td> Bain-marie </td><td> VWRI </td><td> 89032-204 </td><td></td></tr><tr><td> Incubateur agitateur </td><td> FormaScientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

propension oligomérisation domaine transmembranaire déterminée par dosage toxr

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

La conception simpliste des domaines transmembranaires des protéines comme de simples points d&#39;ancrage dans les bicouches phospholipidiques a depuis longtemps été réfuté. Dans de nombreux cas transmembranaire des protéines ont développé des mécanismes sophistiqués de l&#39;action. 1-3 Une façon dont les protéines membranaires peuvent moduler leurs structures et leurs fonctions se fait par contact direct et spécifique des hélices hydrophobes, formant des oligomères transmembranaire structuré. 4,5 récente grande travaux ont porté sur la répartition des acides aminés de préférence dans l&#39;environnement de membrane en comparaison à la solution aqueuse et les forces intermoléculaires différentes que l&#39;association de protéines disque 6,7. Néanmoins, les études de reconnaissance moléculaire à domaine transmembranaire des protéines est toujours en retard ceux de solubles dans l&#39;eau des régions. Un obstacle majeur demeure: malgré la spécificité remarquable et d&#39;affinité qui oligomérisation transmembranaire peut atteindre, 8 mesure directe de leur association est un défi. Méthodologies traditionnelles appliquées à l&#39;étude de la fonction des protéines membranaires intégrale peut être entravée par l&#39;insolubilité des séquences inhérentes à l&#39;étude. Aperçus tirés de l&#39;étude biophysique peptides synthétiques représentant domaines transmembranaires peuvent fournir un aperçu utile de structure. Toutefois, la pertinence biologique de la micellaire détergent ou systèmes liposomes utilisés dans ces études pour imiter les membranes cellulaires est souvent contestée, ne peptides adoptent une structure native-like dans ces conditions et leur comportement ne reflètent véritablement fonctionnelle du mode d&#39;action au sein d&#39;une membrane native ? Afin d&#39;étudier les interactions des séquences transmembranaires dans les bicouches de phospholipides naturels, le laboratoire Langosch au point des dosages ToxR journaliste de la transcription. 9 Le domaine transmembranaire d&#39;intérêt est exprimé comme une protéine chimérique avec protéine de liaison du maltose pour la localisation dans le périplasme et ToxR de fournir un rapport du niveau d&#39;oligomérisation (figure 1). Dans la dernière décennie, plusieurs autres groupes (par exemple Engelman, DeGrado, Shai) encore optimisé et appliqué ce test journaliste ToxR. 10-13 Les dosages différents ToxR sont devenus un standard en or pour tester les interactions entre protéines dans les membranes cellulaires. Nous présentes démontrent une opération typique expérimentales menées dans notre laboratoire que suit principalement les protocoles développés par Langosch. Cette méthode est généralement applicable utile pour l&#39;analyse de domaine transmembranaire auto-association dans E. coli, où β-galactosidase de production est utilisée pour évaluer la propension oligomérisation TMD. Sur TMD induite dimérisation, ToxR se lie au promoteur ctx provoquant une régulation positive du gène LacZ par β-galactosidase. Une lecture colorimétrique est obtenue par addition d&#39;ONPG à cellules lysées. Clivage hydrolytique d&#39;ONPG par la β-galactosidase résultats dans la production de l&#39;espèce absorbant la lumière o-nitrophénolate (ONP) (figure 2).

Une procédure efficace pour évaluer la propension d&#39;oligomérisation des domaines transmembranaires un seul passage (TMDS) est décrite. Des protéines chimères comprenant le TMD fusionnée à ToxR sont exprimés dans une souche E. coli journaliste. TMD induite oligomérisation provoque la dimérisation du ToxR, activation de la transcription et la production de la protéine rapporteur,-galactosidase.

Propension oligomérisation domaine transmembranaire déterminée par dosage ToxR

La vision simpliste consistant à considérer les domaines transmembranaires des protéines comme de simples ancres dans les bicouches phospholipidiques a été infirmée depuis longtemps. Dans de nombreux cas...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier les propensions à la ligamentisation des protéines, des domaines transmembranaires ou des T MDs dans un environnement membranaire naturel. Ceci est réalisé en exprimant le domaine transmembranaire d'intérêt dans e coli sous forme d'une protéine chimérique associée à la protéine de liaison au maltose pour une localisation dans le périplasme et à tox. R en tant que rapporteur transcriptionnel ; la ligamentisation induite par le domaine transmembranaire entraîne le dimérisation de tox R et l'activation de la transcription de LXi. Dans une deuxième étape, les cellules sont lysées puis traitées avec du ONPG, qui est hydrolysé par la bêta-galactosidase en espèce absorbant la lumière, le O-nitrophénolate ou ONP.Les niveaux suivants de ONP sont quantifiés en mesurant l'absorbance de la lumière à 405 nanomètres. Afin de déterminer les niveaux de domaine transmembranaire, les résultats de ligamentisation révèlent la propension à la ligamentisation des domaines transmembranaires selon un test rapporteur tox R. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes biophysiques existantes telles que l'électrophorèse sur gel S

transmembrane-domain-oligomerization-propensity-determined-toxr

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dans ce rapport, nous décrivons comment résonance plasmonique de surface est utilisé pour détecter l'entrée de toxine dans le cytosol hôte. Cette méthode très sensible peuvent fournir des données quantitatives sur la quantité de toxine cytosolique, et elle peut être appliquée à une gamme de toxines.

La détection des toxines translocation dans le cytosol hôte par résonance plasmonique de surface

L’oligomérisation du récepteur de la ryanodine, un canal ionique homo-tétramérique médiant la libération de Ca2+ à partir des réserves intracellulaires, est essentielle pour la contraction des muscles squelettiques et cardiaques. Ici, nous présentons des méthodes complémentaires in vivo et in vitro pour détecter l’auto-association des protéines et déterminer la stœchiométrie des homo-oligomères.

Approches génétiques et biochimiques pour<em&gt; In Vivo</em&gt; et<em&gt; In vitro</em&gt; Évaluation de Protein oligomérisation: Étude de cas Ryanodine Receptor

De nombreuses protéines remplissent leur fonction lorsqu’elles sont attachées à des surfaces membranaires. La liaison des protéines extrinsèques sur les membranes des nanodisques peut être imagée indirectement par microscopie électronique à transmission. Nous montrons que l’empilement caractéristique (rouleau) des nanodisques induit par la coloration négative phosphotungstate de sodium est empêché par la liaison de protéines extrinsèques.

Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

Ce protocole a été développé pour étudier la transition dimer-dodecamer de TmPep1050, un Aminopeptidase M42, au niveau structurel. Il s’agit d’un pipeline simple qui part de la purification des protéines au traitement des données aux rayons X. Crystallogenesis, indexation d’ensemble de données, et remplacement moléculaire ont été soulignés par un cas d’étude, TmPep1050H60A H307A variante.

Cristallographie aux rayons X pour étudier la transition oligomérique de l’État de la Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Nous présentons ici un protocole détaillé pour la reconstitution de l’activité d’extraction msp1 avec des composants entièrement purifiés dans des protéoliposomes définis.

Reconstitution de l’activité d’extraction Msp1 avec des composants entièrement purifiés

Ici, nous présentons un protocole pour utiliser la dernière version de l’outil SeqAPASS (Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility) de l’Environmental Protection Agency des États-Unis. Ce protocole démontre l’application de l’outil en ligne pour analyser rapidement la conservation des protéines et fournir des prédictions personnalisables et facilement interprétables de la sensibilité chimique entre les espèces.

Démonstration de l’alignement des séquences pour prédire l’outil de sensibilité entre espèces pour une évaluation rapide de la conservation des protéines

Un protocole utilisant des promastigotes majeurs de Leishmania est présenté ici pour déterminer la liaison, la cytotoxicité et la signalisation induites par les toxines formant des pores. Une preuve de concept avec la streptolysine O est fournie. D’autres toxines peuvent également être utilisées pour tirer parti des mutants génétiques disponibles chez L. major afin de définir de nouveaux mécanismes de résistance aux toxines.

Déchiffrer le mécanisme moléculaire et la fonction des toxines formant des pores à l’aide de Leishmania major

Ce protocole décrit comment utiliser la microscopie TIRF pour suivre les canaux ioniques individuels et déterminer leur activité dans les membranes lipidiques soutenues, définissant ainsi l’interaction entre le mouvement de la membrane latérale et la fonction des canaux. Il décrit comment préparer les membranes, enregistrer les données et analyser les résultats.

Imagerie à molécule unique de la mobilité latérale et de l’activité des canaux ioniques dans les bicouches lipidiques à l’aide de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)

Nous décrivons ici des protocoles pour la caractérisation biophysique de la formation de complexes ternaires induite par protéolyse ciblant les chimères (PROTACS) qui impliquent les ubiquitine ligases Von Hippel-Lindau, E3 ligase (VHL) et Cereblon (CRBN).  Les méthodes biophysiques illustrées ici comprennent la résonance plasmonique de surface (SPR), l’interférométrie de biocouche (BLI) et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC).

le développement et l’application de tests biophysiques pour l’évaluation de la formation de complexes ternaires induite par la protéolyse ciblant les chimères (PROTACS)

Les fonctions des protéines de la superfamille des dynamines dépendent des changements de conformation couplés à l’hydrolyse des GTP. Un système est décrit à l’aide de la technique FRET à molécule unique (smFRET) pour surveiller la dynamique conformationnelle de l’atlastine GTPase de type dynamine dans différents états de charge nucléotidique.

Imagerie FRET à molécule unique pour l’observation de la dynamique conformationnelle de l’atlastine GTPase de type dynamine

Découvrez comment évaluer la propension à l'oligomérisation des domaines transmembranaires dans E. coli en utilisant le système rapporteur ToxR. Cette méthode quantifie l'activité bêta-galactosidase pour étudier les interactions protéiques membranaires.

Propension oligomérisation domaine transmembranaire déterminée par dosage ToxR

Explorer plus de vidéos