Name: Méthodes dévaluation bêta Mediated la mort cellulaire par les lymphocytes T cytotoxiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Apprenez deux méthodes d'évaluation de la cytotoxicité médiée par les lymphocytes T CD8+ sur les cellules bêta pancréatiques : l'essai de libération du chrome 51 et l'imagerie en temps réel du potentiel mitochondrial. Ces techniques permettent d'étudier les mécanismes de destruction cellulaire dans le diabète de type 1.

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Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health et de DK074656 AI56374 (CEM), ainsi que la Juvenile Diabetes Foundation Research.

1. Préparation des cellules <ol><li> Culture de cellules cibles: la culture de lignées de souris des cellules bêta, NIT-1-4 et aux NTIC, a été un 1,2 précédemment décrit dans DMEM supplémenté avec 10% de FBS, BSA 0,02%, non-acides aminés essentiels, 15mm HEPES, 16.5mm Glocose et pénicilline / streptomycine. Pour 51 d'étiquetage Cr, les cellules des graines dans un fond plat plaque de 96 puits de culture au 5X10 4 cellules / puits dans 200 ul milieu de culture. Pour des expériences de microscopie, les cellules des graines dans un 8-même Lab-Tak lamelle II chambrés à 5x10 4 par chambre dans un milieu de culture 500 ul, et permettre de croître pendant 48 heures avant d'utiliser dans les expériences de cytotoxicité. </li><li> Contrôle de la culture lignée cellulaire T: Utilisez la lignée cellulaire Jurkat (ATCC, CD3 + humaines lignée cellulaire des lymphocytes) comme contrôle négatif. Cellules Jurkat Culture en RPMI1640 complété avec 10% de FBS, 2 mM L-glutamine, le bicarbonate de sodium 1,5 g / L, 10 mM d'HEPES et 1,0 mM pyruvate de sodium. </li></ol> 2. Collecte et l'activation des effecteurs autoréactifs des cellules T CD8 + NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] et NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] ont été achetés auprès de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) et élevés dans notre installation de la souris. F1 descendance hybride de croisements de souris NOD-AI4a avec NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] développent un diabète à 3-5 semaines d'âge. Toutes les souris ont été logés dans des installations exemptes d'agents pathogènes et approuvé par les soins des animaux de l'institution concernée et le Comité d'utilisation. <ol><li> Euthanasier 3-4 semaines vieilles NOD-AI4a / b des souris en utilisant du CO 2. </li><li> Recueillir les rates de souris. Souris euthanasiés sont préparés par pulvérisation d'éthanol et ouvert sous le capot chirurgicale. Rates sont prélevées et mises en tampon glacé HBSS immédiatement. </li><li> Recueillir les cellules spléniques en utilisant un verre de 7 ml homogénéisateur. Deux à trois rate chacun sont mis en 5 ml de HBSS froid et homogénéisé avec un homogénéiseur 7 ml en verre. Homogénat est recueilli et centrifugé à 1200rpm pendant 5 minutes à 4 ° C en utilisant une centrifugeuse Sorvall RT7 +. Les culots cellulaires sont collectées. </li><li> Enlever les globules rouges en utilisant un traitement solution hypotonique. Les pellets sont traités par 5 ml de solution hypotonique / rate sur la glace pendant 5 minutes, puis neutralisé par addition d'un volume égal de HBSS. Recueillir les cellules par centrifugation, comme ci-dessus, et remettre en suspension dans 50 ml de HBSS. Passez les cellules en suspension grâce à la crépine de cellule et de compter à l'aide d'un hémocytomètre avec coloration TrypanBlue. </li><li> Activer les cellules. Resuspendre les cellules à 5x10 6 / ml et activer à l'aide d'une culture de 3 jours avec 0,1 pM AI4 mimotopes (amino YFIENYLEL séquence d'acides) et 25 U / ml d'IL-2 dans RPMI1640 complété avec 10% de FBS, 2 mM L-glutamine, 1,5 g / bicarbonate de sodium L, HEPES 10 mM et 1,0 mM pyruvate de sodium. </li></ol> 3. 51 test de libération de Cr pour examiner la LMC <ol><li> Cellules cibles Label: Ajouter 51 Cr pour cibler les cellules à 1 pCi / puits et la culture pendant 3 heures, et laver 3 fois avec un milieu de culture. </li><li> Suspendre les cellules effectrices en milieu RPMI 1640 tel que mentionné dans l'étape 2.5 de sorte que le volume final ajouté à chaque puits est de 200 pi. </li><li> Après le lavage final des cellules cibles marquées, ajouter activé des cellules effectrices aux cultures de cellules cibles à effecteur souhaitées à la cible (E: T) des ratios. Nous utilisons habituellement E: ratios T à 0,4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 et 50:1. </li><li> Ajouter frais de modification du milieu RPMI 1640 (voir étape 2.5) à 6 puits de cellules cibles à agir comme un contrôle lyse spontanée. </li><li> Co-culture des cellules effectrices et cibles pendant 16 heures. </li><li> Recueillir le surnageant dans des tubes de verre 6x50 mm Lime </li><li> Lyse des cellules en ajoutant 100 ul de 2% de SDS et de pipetage plusieurs fois délicatement. </li><li> Recueillir lysat cellulaire dans un autre ensemble de tubes de verre 6x50 mm Lime. </li><li> Laver les puits une fois avec nettoyage H 2 O et ajouter le lavage pour les tubes lysat cellulaire. </li><li> Compter les surnageants et les lysats cellulaires en utilisant un compteur gamma. </li><li> Calculer lyse spécifique comme suit: <img src="files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="L'équation 1"></li></ol> 4. Coloration des cellules pour l'imagerie de cellules vivantes Parmi les plus couramment utilisés colorants membrane mitochondriale potentiels, TMRM expositions de la toxicité mitochondriale au moins 3. Par conséquent, nous choisissons TMRM pour ces études d'imagerie des cellules vivantes. <ol><li> Préparer une solution à 40 mM dans le DMSO TMRM et conserver à -20 ° C. Faites un [25 nM] une nouvelle solution de travail dans le rouge de phénol libre DMEM avec tous les suppléments pour NTI une culture cellulaire 1. </li><li> Tache cibles NIT-1 des cellules avec TMRM 25 nM pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Remplacez le support du milieu frais contenant 5 nM TMRM de maintenir la distribution d'équilibre des 4 colorant. </li><li> Comptez effectrices activées AI4 cellules T utilisant un hématocytomètre. </li><li> Tache effectrices activées AI4 cellules T avec 1 pl / ml pour les Picogreen5 minutes à température ambiante et laver avec du rouge de phénol libre milieu de culture 3 fois. </li></ol> 5. Évaluation des lymphocytes T médiée par la mort des cellules bêta en utilisant l'imagerie de cellules vivantes <ol><li> Montez la lamelle chambré avec des cellules NIT taché sur la scène d'un Zeiss LSM 510 microscope confocal. Retirez la languette avec un dremmel gaz et de stériliser les chambrés en verre à l'oxyde Etheline. Le stade est équipé d'une chambre de l'imagerie des cellules vivantes qui a contrôlé la température à 37 ° C et 5% de CO 2 avec l'humidité. </li><li> Ajouter activé et colorées des cellules T à des chambres désignées à E différents: les ratios T. </li><li> Ajouté le même nombre de cellules Jurkat tachés aux chambres de contrôle. </li></ol> 6. Obtenir des images de cellules vivantes Le microscope est équipé d'une platine motorisée, qui nous a permis d'acquérir des images à plusieurs reprises à différents endroits des chambres identiques ou différents automatiquement au cours du temps de l'expérience. <ol><li> L'utilisation d'un objectif 63x du pétrole, de prendre des images à un intervalle de toutes les 3 minutes pour un total de 300 images par emplacement. </li><li> Détecter coloration TMRM utilisant une longueur d'onde d'excitation de 543 nm et ensemble de filtres pour l'émission de 565 à 619 nm </li><li> Détecter coloration Picogreen utilisant une excitation à 488 nm et un ensemble de filtres pour l'émission de 500 à 630 nm. La vidéo a été créé en utilisant le logiciel LSM Zeiss. </li></ol> 7. Conversion vidéo pour la publication <ol><li> Utilisation du logiciel LSM Zeiss, créer un fichier vidéo compressé au format AVI. </li><li> Pour convertir la vidéo au format publié, importer la vidéo dans le logiciel FIDJI ( <a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a> ), une ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info. nih.gov / ij /</a> ) de la distribution, en utilisant le plugin Bioformats de loci ( <a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a> ). </li><li> Réglez les paramètres de luminosité et le contraste pour équilibrer les signaux verts et rouges et le taux de trame a été fixé à 2 images / seconde en utilisant le menu des options animation. </li><li> Recadrer la vidéo à 512 x 512 pixels et d'exporter dans un fichier AVI non compressé. </li><li> Ouvrir ce fichier AVI dans le logiciel QuickTime 7 (ordinateur Apple, à Cupertino, Californie) et de compresser et d'exportation dans le format de fichier vidéo ouvert H264/MPEG-4 à 1200 kbs / seconde. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs: <ol><li> Un résultat représentatif de 51 Cr CML dosage. La figure 1 montre un résultat représentatif d'un dosage de la LMC, où lyse pour cent spécifiques (axe Y) augmente à mesure que l'effecteur: ratio cible (axe X) augmente. Les cellules cibles sont des îlots isolés de souris NOD primaires immunodéficientes Rag1-/ -. Souris et marquées au 51Cr. Splénocytes de NOD.AI4α / β souris transgéniques sont isolés et activés comme décrit dans l'étape 2 ci-dessus. Les cibles et les effecteurs ont été co-cultivées pendant 16 heures. Lyse spécifique est calculé pour cent tel que décrit à l'étape 3.11 ci-dessus. </li><li> Deux représentant (positives et négatives) des résultats d'une médiation cellulaire T dissipation de cellules bêta membrane mitochondriale potentiels sont présentés. Les cellules sont colorées et les réactions sont enregistrées comme décrit dans les étapes 4, 5 et 6 ci-dessus, les fichiers vidéo sont créés comme à l'étape 7. Vidéo 1: La lignée de cellules de souris beta-1 NIT était tachée du potentiel de membrane mitochondriale colorant TMRM (Rouge). Activé, autoréactifs lymphocytes T CD8 + AI4 (vert souillé avec Picogreen) ont été co-cultivées avec ces NIT-1 des cellules à un rapport E: T de 50:1. NTI-1 potentiel de membrane mitochondriale dissipée progressivement pendant une durée de 400 minutes, mais seulement dans les clusters qui ont été en interaction avec les cellules T AI4. Vidéo 2: Comme une expérience de contrôle, NIT-1 cellules ont été colorées avec TMRM et co-cultivées avec des cellules Jurkat Picogreen taché à un rapport E: T de 50:1. Les cellules Jurkat sont une lignée de cellules T humaines qui est MHC incompatibles. NTI-1 cellules maintenues potentiel de membrane mitochondriale pendant toute la durée de l'400 minutes co-incubation période. Cellules Jurkat ne pas interagir avec NTI-1 grappes et donc, ne pas faire tuer. </li></ol><img src="files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="Figure 1"> Figure 1 résultat représentatif de la LMC utilisant comme cellules cibles primaires îlots isolés de immunodéficientes NOD.Rag1-/ -. Splénocytes des souris et des NOD.AI4α / β de souris transgéniques. Les cibles et les effecteurs ont été co-cultivées pendant 16 heures. Lyse pour cent spécifiques augmente à mesure que l'effecteur: augmente ratio cible. Vidéo 1. Lignée de souris des cellules bêta NIT-1 a été taché le potentiel de membrane mitochondriale colorant TMRM (Rouge). Activé autoréactifs lymphocytes T CD8 + AI4 (vert souillé avec Picogreen) ont été co-cultivées avec ces NIT-1 cellules au rapport E: T de 50:1. NTI-1 potentiel de membrane mitochondriale dissipationTed progressivement pendant une durée de 400 minutes, mais seulement dans les clusters qui ont été en interaction avec les cellules vertes T AI4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">Cliquez ici pour visionner la vidéo</a> . Vidéo 2. NIT-1 cellules ont été colorées comme décrit dans la vidéo 1 et co-cultivées avec Picogreen Jurkat T teinté lignée cellulaire humaine. NTI-1 cellules ont été capables de maintenir le potentiel de membrane mitochondriale pensé toute la durée de 400 minutes. Cellules Jurkat ne pas interagir avec NTI-1 grappes et donc ne pas faire tuer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">Cliquez ici pour visionner la vidéo</a> .

<ol><li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIT-1%2C+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD%2FLt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li>
<li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li>
<li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+immune-mediated+%28type+1%29+diabetes+mellitus%3A+potential+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li>
<li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+resistance+of+ALR%2FLt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction%3A+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li>
<li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li>
<li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+membrane+potential+%28deltapsi%28m%29%29+in+apoptosis%3B+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li>
<li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li>
<li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li>
</ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l&#39;Université de Floride, les soins des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation.

Lymphocyte T cytotoxique médiée la mort des cellules bêta est la principale physiopathologie du DT1 5. Dosages de LMC en utilisant 51 Cr communiqué nous permettre d&#39;étudier le degré d&#39;effecteur-cible de réponse 6. Cependant, le processus détaillé et les voies de lymphocytes T de mort des cellules bêta n&#39;est pas encore pleinement comprise. Depuis les mitochondries sont critiques pour la fonction des cellules bêta et la mort 7, nous nous sommes concentrés sur les cha...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Cr-51 </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tétraméthyl rhodamine ester méthylique (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td> séquence d&#39;acides aminés: YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> R &amp; D </td><td> 485-MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060-Cl </td><td></td></tr><tr><td> MEM non-acides aminés essentiels </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Gemini </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> Le rouge de phénol DMEM sans </td><td> Sigma </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> Incubateur de CO2 </td><td> Thermo Fisher </td><td> HERAcell 150i </td><td> Maintenu stérile pour la culture cellulaire </td></tr><tr><td> Enceinte de sécurité biologique </td><td> Thermo Fisher </td><td> Forma 1440 </td><td></td></tr><tr><td> Des tubes de culture jetables, 6x50 mm verre à la chaux </td><td> Fisher </td><td> 14 à 958-A </td><td></td></tr><tr><td> Compteur gamma </td><td> Perkin Elmer </td><td> Assistant 1470 compteur gamma automatique </td><td></td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 Meta confocale </td><td> Avec platine motorisée et la chambre de cellules vivantes </td></tr><tr><td> Pipette (1ml, 200 pl, 20 pi, 10 pi, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubes (Ambre) </td><td> Fisher </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse </td><td> Sorvall Legend RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Hémacytomètre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope droit </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ Souris </td><td> Le Laboratoire Jackson </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ Souris </td><td> Le Laboratoire Jackson </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD-AI4α / β souris F1 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Elevé en animalerie UF </td></tr></tbody></table>

méthodes d&#39;évaluation bêta mediated la mort cellulaire par les lymphocytes t cytotoxiques

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune cellulaire T. Pendant la pathogenèse, les patients deviennent progressivement plus insulinopenic que la production d&#39;insuline est perdu, sans doute cela résulte de la destruction des cellules bêta du pancréas par les lymphocytes T. Comprendre les mécanismes de la mort des cellules bêta au cours du développement du DT1 donneront un aperçu de générer un remède efficace contre cette maladie. À médiation cellulaire lymphocytotoxicité (LMC) dosages ont toujours utilisé le radionucléide chrome 51 (51 Cr) pour marquer les cellules cibles. Ces objectifs sont ensuite exposés à des cellules effectrices et la libération de 51 Cr par les cellules cibles est lu comme une indication de la mort cellulaire médiée par les lymphocytes. Les inhibiteurs de la mort cellulaire résulte de la libération diminué de 51 Cr. Comme les cellules effectrices, nous avons utilisé une population active autoréactifs clonale de cellules CD8 + lymphocytes T cytotoxiques (CTL) isolés à partir d&#39;un stock de souris transgéniques pour les deux chaînes alpha et bêta du récepteur AI4 cellules T (TCR). Activé AI4 cellules T ont été co-cultivées avec des cellules marquées au 51 Cr NIT cible pendant 16 heures, la libération de 51 Cr a été enregistré pour calculer lyse spécifique Les mitochondries participent à de nombreux événements importants physiologiques, tels que la production d&#39;énergie, la régulation de la signalisation de transduction, et l&#39;apoptose. L&#39;étude des cellules bêta mitochondriale changements fonctionnels pendant le développement du DT1 est un nouveau domaine de recherche. Utiliser le potentiel de membrane mitochondriale colorant rhodamine tétraméthyl ester méthylique (TMRM) et l&#39;imagerie confocale de cellules vivantes microscopiques, nous avons suivi le potentiel de membrane mitochondriale au cours du temps dans la ligne de la cellule bêta-1 NIT. Pour les études d&#39;imagerie, d&#39;effecteur AI4 cellules T ont été marqués avec fluorescent nucléaire coloration colorants Picogreen. NTI-1 et les cellules T ont été co-cultivées en chambrée lamelle et monté sur la platine du microscope équipé d&#39;une chambre de cellules vivantes, contrôlée à 37 ° C, avec 5% de CO 2, et humidifié. Lors de ces expériences images ont été prises de chaque cluster toutes les 3 minutes pour 400 minutes. Pendant une période de 400 minutes, nous avons observé la dissipation du potentiel de membrane mitochondriale dans NIT-1 grappes cellule où AI4 cellules T ont été attachés. Dans l&#39;expérience, où le contrôle simultané NIT-1 cellules ont été co-cultivées avec CMH dépareillés humaine cellules Jurkat lymphocytes, le potentiel de membrane mitochondriale est resté intact. Cette technique peut être utilisée pour observer en temps réel des changements dans le potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules de l&#39;attaque des lymphocytes cytotoxiques, des cytokines, ou d&#39;autres réactifs cytotoxiques.

À médiation cellulaire lymphocytotoxicité (LMC) dosages peuvent être utilisés pour tester les réponses autoréactifs et étudier les mécanismes de mort cellulaire in vitro. Cependant, en utilisant des cellules vivantes techniques d&#39;imagerie microscopique confocale avec des colorants fluorescents, le type et la cinétique de la mort cellulaire ainsi que les voies utilisées peuvent être étudiés plus en détail.

Méthodes d&#39;évaluation bêta Mediated la mort cellulaire par les lymphocytes T cytotoxiques

Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune médiée par les lymphocytes T. Au cours de la pathogenèse, les patients deviennent progressivement plus insulinopéniques à mesure que l'insuline...

Le diabète de type un est une maladie auto-immune dans laquelle les cellules bêta pancréatiques productrices d'insuline sont détruites par des lymphocytes T autoréactifs. Comprendre les mécanismes impliqués permettra d'obtenir des informations essentielles pour élaborer un traitement efficace contre cette maladie. Deux méthodes permettant d'observer in vitro la destruction spécifique des cellules bêta pancréatiques par des lymphocytes T CD8 positifs sont ici présentées : un dosage de cytotoxicité lymphocytaire médiée par cellules, ou test CML, basé sur le chrome 51, et un test CML visuel, pour les deux méthodes.Les cellules T effectrices CD8 positives sont d'abord préparées à partir de rate de souris afin de réaliser un test de LMC. Une ou quatre populations cibles de cellules bêta sont marquées au chrome 51 et mises en co-culture avec les cellules effectrices. Lorsque les cellules bêta cibles sont détruites, le chrome 51 est libéré. Les surnageants et les lysats cellulaires sont ensuite recueillis, et les niveaux de radioactivité, qui indiquent l'importance de la mort cellulaire, sont mesurés à l'aide d'un compteur à scintillations gamma afin de réaliser un test de LMC visuel. Une et quatre populations cibles de cellules bêta sont marquées avec le colorant de potentiel mitochondrial TM RM, tandis que les cellules effectrices sont marquées au pico vert.Les cellules sont combinées et une imagerie de cellules vivantes est réalisée afin d'examiner le taux de mort cellulaire indiqué par la dissipation du potentiel membranaire mitochondrial. Le principal avantage de ce dosage par rapport aux dosages traditionnels, tels que le test de libération de chrome, est que nous pouvons observer la mort des cellules bêta en temps réel. Parmi les autres avantages figurent la possibilité de déterminer si la mort des cellules bêta induite par les lymphocytes T CD8 dépend du contact, ainsi que la possibilité d'étendre ce dosage à l'aide d'indicateurs fluorescents pour cartographier les voies de la mort des cellules bêta.Cette méthode peut répondre à des questions clés concernant la pathogénie de toute maladie dans laquelle les lymphocytes T cytotoxiques jouent un rôle. Les implications de cette technique s'étendent vers la thérapie et éventuellement le diagnostic, car la fonction mitochondriale est essentielle à la fois pour la survie et la physiologie des cellules bêta. Jing Chen et moi allons démontrer cette procédure.Les cellules cibles utilisées dans cette démonstration sont les lignées de cellules bêta murines, knit one et knit four, ainsi que la lignée cellulaire de lymphocytes humains CD trois plus, qui ne reconnaît pas et n'attaque pas les cellules bêta murines, utilisée comme témoin négatif pour les cellules effectrices. Ces dernières sont des lymphocytes T autoréactifs CD huit positifs obtenus à partir des spléens de souris nod AI quatre alpha bêta F1 âgées de trois à quatre semaines. Pour obtenir ces cellules, commencez par placer les spléens dans un homogénéisateur en verre de sept millilitres contenant cinq millilitres de HBSS glacé. Homogénéisez les spléens à l’aide d’un homogénéisateur de Dounce, puis transférez la suspension cellulaire dans un tube conique et centrifugez à 250 ×g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, jetez le surnageant. Ensuite, pour éliminer les globules rouges, remettez en suspension le culot dans cinq millilitres de solution hypotonique par spléen. Incubez pendant cinq minutes sur de la glace.Après l'incubation, laver le culot cellulaire deux fois avec 10 millilitres de HBSS glacé par centrifugation. Entre chaque lavage, resuspendre le culot cellulaire dans 10 millilitres de HBSS glacé. Ensuite, à l’aide d’un hémocytomètre, dénombrer les cellules une fois les concentrations cellulaires déterminées.Centrifuger à nouveau, puis resuspendre les cellules dans du RPMI 1640 complété à une densité de cinq fois 10 à la puissance six cellules par millilitre ; semer les cellules à une densité de cinq fois 10 à la puissance six par millilitre dans un flacon T 75. Enfin, pour activer les cellules, ajouter de l'AI four myope et de l'IL deux au flacon à des concentrations finales respectives de 0,1 micromolaire et de 25 unités par millilitre, puis incuber le flacon dans une étuve à 5 % de CO2 à 37 degrés Celsius pendant trois jours. Les cellules activées peuvent désormais être utilisées soit pour un test CML basé sur le CROMIUM 51, soit pour un test CML visuel.Le dosage de la cytotoxicité lymphocytaire médiée par les cellules, ou test CML, utilise ici la libération de chrome 51 à partir de cellules cibles comme indicateur de la mort des cellules bêta médiée par les CD8. Pour marquer les cellules bêta cibles NIT-1 ou NIT-4 avec du chrome 51, commencez par les ensemencer à une densité de 5 × 10⁴ cellules par puits dans une plaque de 96 puits, en 200 microlitres de DMEM supplémenté, puis incubez à 37 °C sous 5 % CO₂ pendant 24 heures. Le jour suivant, diluez le chrome 51 dans du DMEM supplémenté pour obtenir une concentration d'un microcurie par 20 microlitres.Ensuite, ajoutez 20 microlitres du chrome 51 dilué dans chaque puits contenant les cellules bêta cibles afin d'obtenir un microcurie par puits. Placez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 et incubez pendant trois heures après l'incubation. Aspirez le milieu et lavez les cellules trois fois avec du milieu de culture frais.Ensuite, ajoutez du milieu aux cellules effectrices activées CD8 positives de manière à ce que le volume final ajouté à chaque puits soit de 200 microlitres. Associez les cellules effectrices aux cultures de cellules bêta cibles selon les rapports E/T souhaités ici ; des rapports de 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1 et 0,25:1 sont utilisés pour préparer les témoins de lyse spontanée. Ajoutez du milieu frais à six puits des cellules bêta cibles.Ensuite, placez la plaque dans l'incubateur et co-cultivez les cellules effectrices et cibles pendant 16 heures. Le jour suivant, utilisez une pipette multipuits pour transférer le surnageant dans six tubes en verre de 50 millimètres. Ajoutez ensuite au plateau cent microlitres de SDS à 2 % pour lyser les cellules et pipetez doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas.Transférez le lysat cellulaire dans un nouveau jeu de six tubes en verre calcaire de 50 millimètres. Ensuite, afin de s'assurer que tout le lysat cellulaire est récupéré, ajoutez cent microlitres d'eau stérile dans chaque puits, pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas, puis ajoutez le liquide aux tubes de lysat cellulaire pour déterminer le degré de destruction des cellules bêta. Mesurez la radioactivité dans le surnageant et le lysat à l'aide d'un compteur à scintillations gamma une fois les comptages effectués.Déterminez la lyse spécifique en soustrayant le pourcentage de comptes dans les surnageants du contrôle de lyse spontanée du pourcentage de comptes dans les surnageants expérimentaux, comme indiqué dans cette équation. Pour examiner la mort des cellules bêta médiée par les lymphocytes T en temps réel. Le potentiel de la membrane mitochondriale est surveillé par imagerie en direct des cocultures cibles et effectrices.Pour la préparation à la microscopie, observez les cellules bêta cibles sur un verre de couverture stérilisé modifié à huit puits, avec une densité de cinq fois dix puissance quatre cellules par puits. Placez ensuite les lamelles dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % CO2, et laissez les cellules croître pendant 48 heures. Le jour de l'expérience, ajoutez le colorant de potentiel membranaire mitochondrial, le tétraéthylrhodamine méthyle ester (TMRM), à 25 nanomolaire, ainsi qu'un milieu DMEM supplémenté sans rouge de phénol, et incubez pendant 30 minutes.Une fois les cellules marquées au TMRM, remplacez le milieu par un milieu frais contenant cinq nanomolaires de TM RM afin de maintenir la distribution à l'équilibre du colorant. Ensuite, comptez les lymphocytes T effecteurs activés AI quatre ou les cellules témoins jerk it à l’aide d’un hémocytomètre, puis remettez en suspension les cellules dans du DMEM complété sans rouge de phénol, dans des tubes coniques de 15 millilitres, à la concentration appropriée. Ensuite, ajoutez du Pico Green aux cellules effectrices activées ou aux cellules témoins jerk it jusqu’à une concentration finale d’un microlitre par millilitre.Enveloppez le tube dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière, puis incubez pendant cinq minutes à température ambiante après l’incubation. Lavez les cellules trois fois en ajoutant du DMEM sans rouge de phénol, en mélangeant brièvement et en centrifugeant à 250 ×g pendant cinq minutes. Pour recueillir les cellules en vue de l’imagerie, placez la lamelle-chambre sur la platine d’un microscope confocal équipé d’une platine motorisée et d’une chambre d’imagerie de cellules vivantes humidifiée à 37 degrés Celsius et 5 %CO2.Ajoutez les cellules effectrices activées marquées au Pico Green dans les chambres selon le rapport effecteur-cible à évaluer ici. Le rapport EC imagé sera de 50:1. Configurez le logiciel d'acquisition pour recueillir des images dans quatre puits, avec trois positions chacun, toutes les trois minutes, avec 300 images par position et excitation en utilisant les jeux de filtres appropriés pour le TMRM et le Pico Green. Une fois toutes les images recueillies, elles doivent être converties pour publication ici.Fiji et ImageJ sont utilisés avec un greffon de formats bio provenant de loci. Des détails supplémentaires concernant la conversion vidéo sont disponibles dans le texte écrit accompagnant. Un test de cytotoxicité lymphocytaire médiée par cellules, ou test CML, a été réalisé en utilisant du chrome 51, comme décrit dans cette vidéo.Comme indiqué ici, le pourcentage de lyse spécifique indiqué sur l'axe des Y augmente lorsque le rapport effecteur-cible indiqué sur l'axe des X augmente. Pour évaluer la mort cellulaire par imagerie de cellules vivantes, la lignée de cellules bêta murines Knit-1 a été marquée avec un colorant de potentiel membranaire mitochondrial, le TMRM, représenté en rouge. Les lymphocytes T CD8 positifs autoréactifs I4 activés ont été colorés en vert avec le Pico Green, et les deux types cellulaires ont été co-cultivés à un rapport E:T de 50:1, comme on peut le voir ici. Le potentiel membranaire mitochondrial des cellules Knit-1 s'est progressivement dissipé au cours d'une période de 400 minutes, mais uniquement dans les agrégats interagissant avec les lymphocytes T I4 verts. Dans une expérience contrôle, les cellules Knit-1 marquées ont été cultivées avec des lymphocytes T humains Jerk présentant un désappariement du CMH, eux-mêmes colorés au Pico Green, comme illustré ici.Les cellules de type « knit one » ont été capables de maintenir le potentiel de membrane mitochondrial pendant toute la durée de 400 minutes. Les cellules de type « circuit » n'ont pas interagi avec les agrégats de cellules « knit one » et n'ont donc pas induit de mort cellulaire. Une fois maîtrisé.Cette technique prend environ cinq jours, préparation des cellules incluse. Une fois que vous aurez visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment le potentiel membranaire des cellules bêta évolue lorsqu'elles sont attaquées par des lymphocytes T autoréactifs. N'oubliez pas que le travail avec des radioisotopes peut présenter des dangers, et qu'une formation appropriée doit être suivie et des précautions prises lors de l'exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Détermination de l&#39;activité cytotoxique CD8 spécifiques optimale des cellules T humaines Her2neu en comparant les Cr51 Essai de libération dans le système de xCELLigence

La vidéo présente un test basé sur la cytométrie en flux pour mesurer l’immunodominance dans les lymphocytes T cytotoxiques ou les réponses CTL. Les cellules cibles fluorescentes injectées présentent une fluorescence variable correspondant aux épitopes immunogènes. La collecte et le tri post-spléen révèlent une réduction des cellules fluorescentes de haute intensité, confirmant l’immunodominance dans les réponses CTL.

Un test pour évaluer l’immunodominance dans les réponses des lymphocytes T cytotoxiques

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Détection en temps réel de dans l’apoptose des cellules tumorales in Vitro induite par CD8+ T Cells pour étudier les fonctions immunitaires de suppresseurs de tumeur-infiltration de cellules myéloïdes

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