Génération de cellules T spécifiques Multivirus pour prévenir / traiter les infections virales, après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques

L'objectif général de la procédure suivante est de générer rapidement des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques des virus, ou CTLs, dérivés du donneur, adaptés à un transfert adoptif chez des receveurs allogéniques de greffe de cellules souches hématopoïétiques ou HSCT. Cette étape est réalisée en transfectant d'abord des cellules dendritiques, ou DCs, avec des plasmides codant pour des antigènes viraux afin de préparer ces cellules à la présentation d'antigènes. Dans un deuxième temps, les DCs transfectées sont utilisées pour stimuler des lymphocytes T spécifiques de l'antigène, qui sont ensuite amplifiés en présence d'IL-4 et d'IL-7 dans un dispositif de culture perméable aux gaz appelé GRE.

Ensuite, après sept jours de culture, les cellules sont divisées et repiquées, et leur milieu est renouvelé afin de maintenir une expansion maximale des CTL in vitro. Enfin, au jour 12, les cellules sont récoltées et analysées pour leur pureté, leur puissance et leur sécurité, puis congelées pour une utilisation clinique ultérieure. En définitive, des lignées de CTL présentant une spécificité multivirale et une alloreactivité minimale peuvent être obtenues, comme en témoignent la coloration intracellulaire des cytokines, la production d'interféron gamma et la cytotoxicité.

La production de lignées de cellules T cytotoxiques spécifiques de plusieurs virus est longue et fastidieuse. Elle nécessite l'utilisation de lignées de cellules B transformées par le virus d'Epstein-Barr (EB) et de vecteurs adénoviraux, et la procédure prend environ trois mois. Notre nouvelle méthode n'utilise pas de vecteurs viraux.

Les cellules se développent de manière exponentielle en culture avec une perte cellulaire minimale, ce qui rend la procédure rapide et rentable. Cette procédure est démontrée par Eureka Gerdeman, fellow clinique au laboratoire Harvest, qui génère des DC dérivées de monocytes dans un milieu Cellgenic, supplémenté avec l'IL-4 et le G-M-CS-F, puis maturées pendant 24 heures en présence de cytokines de maturation par une resuspension douce à l’aide d’une pipette de transfert de trois millilitres. Utilisez le bleu de trypan pour compter les DC, puis transférez-les dans trois tubes de 15 millilitres contenant au moins 0,5 × 10⁶ et au plus 2 × 10⁶ cellules par tube.

Ensuite, centrifuger les DCS pendant 10 minutes à 200 fois G. Pendant ce temps, préparer six millilitres de milieu cellulaire Genix supplémenté avec le même cocktail de cytokines de maturation des DC qu'auparavant, et répartir deux millilitres dans trois puits d'une plaque de culture tissulaire 12 puits. Remplir les puits inutilisés avec deux millilitres d'eau stérile. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % CO2 pour la préchauffer.

Une fois la centrifugation des cellules terminée, aspirez les surnageants et ajoutez les plasmides d'ADN appropriés à chaque tube à une concentration finale de cinq microgrammes d'ADN par tube. Ici, le plasmide codant pour IE un PP 65 est ajouté au tube numéro un, heon penton au tube numéro deux, et E BNA un LMP deux BZ F1 au tube numéro trois reus. Suspendez les DCS et l'ADN dans 100 microlitres de solution de transfection nucléaire.

Mélanger soigneusement et transférer le mélange dans des cuvettes NU d'affection nucléaire. Placer les cuvettes dans l'effecteur nucléaire 4D. Sélectionner le programme CB150 et appuyer sur démarrer immédiatement après l'affection nucléaire.

Ajouter 500 microlitres du milieu de maturation PREWARM CELLGENIC DC à chaque échantillon, mélanger les cellules en pipetant doucement deux à trois fois vers le haut et vers le bas, puis transférer les DCS nucléofectées vers la plaque 12 puits préparée contenant les 1,5 millilitre restants de milieu de maturation DC préchauffé. Placer la plaque dans l’incubateur pendant 12 à 18 heures supplémentaires, récolter, compter, puis irradier les DCS nucléofectées. Laver les cellules une fois avec 10 millilitres de milieu CTL, puis les resuspendre à une concentration de 3 × 10⁵ DCS par millilitre de milieu. Rassembler un minimum de 7,5 × 10⁵ (soit 2,5 millilitres) à un maximum de 15 × 10⁵ (soit 5 millilitres) de DCS provenant des trois nucléofections, puis transférer les DCS transfectées par plasmide regroupées vers le dispositif G Rex.

Ensuite, placer l'appareil dans l'incubateur pour la préparation des cellules répondeuses. Utiliser les cellules mononucléées non adhérentes restantes après la sélection des cellules dendritiques. Transférer les cellules répondeuses dans la solution de culture pré-chauffée.

Les laver une fois avec le milieu CTL. Suspendre les cellules dans le milieu CTL. Compter les cellules et les ajuster à une concentration de deux fois 10 puissance six cellules par millilitre.

Prendre 15 fois 10 puissance 6 cellules ou 7,5 millilitres et compléter avec les cytokines IL-4 et IL-7. Transférer 7,5 millilitres de PBMC dans le G Rex et compléter le bioréacteur avec le milieu CTL jusqu'à un volume total de 30 millilitres. Enfin, placer le G Rex dans l'incubateur pendant six à sept jours ; aux jours six à sept, aspirer 10 millilitres du milieu.

Ensuite, mélangez les 20 millilitres restants de milieu à l’aide d’une pipette de 10 millilitres. Utilisez le bleu de trypan pour compter les cellules s’il y a moins de 50 fois 10 à la puissance six cellules. Renouvelez le milieu de culture avec du milieu frais et des cytokines.

S'il y a plus de 50 fois 10⁶ cellules, prélever 10 millilitres de la suspension cellulaire, transférer les cellules dans un nouveau G rex, puis alimenter les deux G rex avec du milieu CTL frais et des cytokines. Cultiver les cellules pendant quatre à six jours supplémentaires afin d'obtenir un nombre suffisant de cellules, puis récolter et compter les cellules. Ensuite, cryoconserver les cellules non utilisées pour des analyses phénotypiques ou fonctionnelles, en vue d'une utilisation ultérieure. Résultats représentatifs montrant que les plasmides ADN multicytoniques induisent des cellules T spécifiques de plusieurs virus, telles que mesurées par le test ELISpot interféron gamma, et que la fréquence des cellules réactives est supérieure à celle des lignées générées à l'aide de plasmides PHU conventionnels exprimant les mêmes antigènes.

Le ratio optimal entre les DC et les PBMC est important pour une stimulation puissante des lymphocytes T, comme le montre cette figure où un ratio de un à 50 produit une réactivation suboptimale par rapport à un ratio stimulateur-répondeur de un à 20. La culture CTL dans le G rex permet une expansion supérieure des lymphocytes T comparée aux plaques classiques de 24 puits. L'ajout d'IL-4 et d'IL-7 aux cultures augmente le répertoire et la spécificité des cellules expansées, comme illustré ici par la fréquence des lymphocytes T réagissant contre le peptide NLV, dérivé de la protéine PP65 du CMV et restreint par l'HLA-A2, dans des cultures générées en présence ou en absence d'IL-4 et/ou d'IL-7. Cette figure montre un échantillon représentatif du phénotype des lymphocytes T cytotoxiques multivirus rapidement expansés, qui sont polyclonaux et composés d’un mélange de lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs, dont la majorité expriment les marqueurs de mémoire CD45RO et CD62L. Les lymphocytes T cytotoxiques expansés sont spécifiques de tous les antigènes stimulateurs et sont polyfonctionnels, comme évalué ici par coloration intracellulaire des cytokines pour détecter la production d'interféron gamma et de TNF-alpha après stimulation par l'antigène, ainsi que par test de libération de chrome.

Les CTL amplifiés sont capables de tuer spécifiquement des cibles virales, mais ne présentent aucune activité non spécifique contre des cibles non virales avec incompatibilité HLA, un aspect crucial en matière de sécurité. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de produire rapidement des lignées de cellules T cytotoxiques spécifiques à plusieurs virus, compatibles avec les bonnes pratiques de production (GNP) et adaptées au transfert adoptif chez des patients atteints de maladies associées à des virus. La simplification de cette procédure devrait faciliter son extension au-delà des installations spécialisées de production et permettre que celle-ci devienne un standard de prise en charge pour les patients immunodéprimés et particulièrement sensibles aux maladies associées à des virus.