Un système de dosage Free Cell Estimation de la capacité de neutralisation de GM-CSF recombinant soluble à l'aide d'anticorps GM-CSF récepteur

L'objectif général de cette expérience est d'établir un test in vitro permettant de quantifier la capacité neutralisante de l'auto-anticorps anti-G-M-C-S-F. Nous commençons par obtenir des vers à soie transgéniques. Nous introduisons le gène humain SGMR alpha afin de produire le SGMR alpha recombinant, puis nous marquons le G-M-C-S-F humain recombinant par bioTE.

Ensuite, nous évaluons la corrélation entre le système sans cellules et un bioessai classique au moyen d'une étude sur l'inhibition de la liaison du G-M-C-S-F au récepteur alpha SGMR par des autoanticorps anti-G-M-C-S-F. Les résultats obtenus démontrent une corrélation significative entre l'inhibition de la croissance dans le bioessai et l'inhibition de la liaison dans le système sans cellules par les fractions d'IgG sériques et les autoanticorps anti-G-M-C-S-F purifiés. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le bioessai TF-1, est que ce système permet une analyse élevée avec une bonne reproductibilité pour mesurer la capacité neutralisante des autoanticorps anti-GM-CSF.

Étant donné que l'auto-anticorps anti-GM-CSF provoque un pronostic global auto-immun primaire, les implications de cette technique s'étendent au diagnostic. Elle peut également être appliquée à des dosages compétitifs de liaison au tib utilisant des récepteurs cytokiniques recombinants, tels que les récepteurs du BEGF et du TNFA. La démonstration de la procédure sera présentée par ano, un étudiant au doctorat de mon laboratoire. Il a d'abord mis au point ce système indépendant du pH.

Ce vidéo montre le ver à soie utilisé pour la production de SGMR alpha recombinant. La première étape consiste à amplifier l'ADNc pour SGMR alpha à partir d'une bibliothèque d'ADNc de placenta humain par réaction en chaîne par polymérase avec l'amplicon PCR obtenu. Réalisez une seconde PCR pour ajouter une séquence de 50 bases de la région UTR cinq prime du polyhétron du virus ULA à l'extrémité cinq prime.

Et pour marquer un R RRGs, ajoutez son marqueur à l'extrémité trois prime, clonez le produit d'amplification PCR R dans le plasmide P MSG un un mg, co-injectez le construct PS GMR barre oblique M1 un un mg avec le vecteur auxiliaire PHA trois pig dans les œufs de bombyx de la souche PNDW un. Élevez les larves G zéro écloses en papillons à 25 degrés Celsius. Ensuite, analysez les embryons G un soit en croisant des individus frères et sœurs, soit avec PNDW un, par détection de l'expression de MG FP dans les yeux, indicative de bombyx transgéniques porteurs.

Le gène SGMR alpha permet d'extraire la SGMR alpha recombinante des cocons de vers à soie transgéniques à l'aide d'un tampon phosphate contenant 500 millimolaire de chlorure de sodium, puis agiter à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Centrifuger les échantillons à 20 000 ×g pendant 15 minutes. Pour éliminer les précipités, appliquer le liquide surnageant sur une colonne d'affinité au nickel.

Lavez la colonne et diluez les protéines à l’aide d’un gradient linéaire d’ole allant de 10 millimolaires à 250 millimolaires. Rassemblez les fractions contenant le SGMR alpha purifié et dialysez contre du tampon salin phosphate. Effectuez d’abord la dialyse des échantillons avec du PBS.

Pour éliminer le sorbitol de la préparation G-M-C-S-F, ajouter un millilitre de solution froide de méta-dates de sodium à 20 millimolaire et incuber l'échantillon pendant 30 minutes sur de la glace à l'abri de la lumière. Ajouter ensuite du glycérol pour obtenir une concentration finale de 15 millimolaire et dialyser contre un tampon d'acétate de sodium à 100 millimolaire. Puis ajouter de l'azoture de biotine à la solution pour atteindre une concentration finale de cinq millimolaire et mélanger pendant deux heures à température ambiante.

Enfin, éliminer le matériau non réactif par dialyse contre le PBS, puis recouvrir une plaque de microtitration avec 50 microlitres d'anticorps monoclonal anti-polyhis pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Laver cinq fois avec du PBST. Ajouter ensuite 100 microlitres d'une solution de blocage et incuber pendant trois heures à quatre degrés Celsius.

Une fois de plus, effectuez cinq lavages avec du PBST. Ajoutez 50 microlitres de SGMR alpha dans la solution de blocage et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius après cinq lavages avec du PBST. Ajoutez 25 microlitres des échantillons contenant l'auto-anticorps G-M-C-S-F, puis 25 microlitres de G-M-C-S-F biotinylé, et incubez pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Pour former le complexe SGMR alpha G-M-C-S-F. Poursuivre le lavage cinq fois avec du PBST, puis ajouter 50 microlitres de streptavidine phosphatase alcaline pendant une heure à quatre degrés Celsius afin de détecter le G-M-C-S-F biotinylé lié au SGMR alpha. Laver cinq fois avec du PBST, puis ajouter 50 microlitres d'un substrat de chimiluminescence à la solution, incuber pendant une heure à température ambiante et mesurer l'activité de chimiluminescence à l'aide d'un lecteur de plaques. Lors de l'analyse par électrophorèse SDS-PAGE, le SGMR alpha recombinant d'origine bombyx est présent sous forme monomérique et sous forme DME dans des conditions non réductrices, mais uniquement sous forme monomérique dans des conditions réductrices.

Ce mélange recombinant de monomères et de dimères liés par des ponts disulfure de SGMR alpha est fonctionnel dans un dosage de liaison compétitive. Le complexe de G-M-C-S-F biotinylée avec SGMR alpha présente une spécificité, car il peut être dissocié par l'ajout de diverses concentrations d'anticorps neutralisants, mais pas d'anticorps non neutralisants. De plus, des concentrations croissantes d'anticorps neutralisants dirigés contre le G-M-C-S-F sont corrélées positivement à un pourcentage accru d'inhibition de la liaison, de manière dépendante de la dose.

Comme prévu, l'inhibition de la liaison des anticorps non neutralisants de G-M-C-S-F n'était pas dépendante de la dose. Ce système sans cellules démontre une forte corrélation entre l'inhibition de la liaison de G-M-C-S-F au SGMR alpha par les autoanticorps anti-G-M-C-S-F et les valeurs calculées de r égale à 0,988 et de valeur P de 0,002. L'inhibition de la liaison augmentait de manière dépendante de la dose par les autoanticorps anti-G-M-C-S-F.

De même, l'inhibition de la liaison a significativement corrélaté avec l'inhibition de la croissance de l'importation. Ce dosage présente une utilité pour l'analyse des fractions IgG sériques provenant de patients atteints de PAP auto-immune, comme le démontre ici la relation entre la CI50 d'inhibition de la liaison en pourcentage et le pourcentage d'inhibition de la croissance induit par les fractions IgG sériques. En outre, le coefficient de variation entre les expériences indique un avantage du système dépourvu de cellules par rapport au test biologique d'inhibition de la croissance.

Une fois maîtrisée, cette analyse de liaison entre le récepteur GM GSF et son ligand, dépourvue de cellules, peut être réalisée avec succès en 38 heures. Il est important de veiller à maintenir les réactifs, la température et la durée d'incubation. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du criblage des activités biologiques des médicaments anticorps nobles, en remplacement des bioessais classiques.