Name: Visualisation des cellules interstitielles de Cajal (CIC) Réseau Souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Apprenez à visualiser les réseaux de cellules interstitielles de Cajal chez la souris par immunofluorescence. Cette méthode permet d'étudier l'architecture des CIC et leur rôle dans la motilité gastro-intestinale.

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Ce travail a été soutenu par le National Cancer Institute (K08CA140946, au YC), (5F32CA130372, pour PC), (R01CA102774 et R01HL055748 à PB), le ministère de la Défense (PC094302 au YC), le Fonds de la famille Shuman de recherche GIST (pour PC), et le Cancer Consortium Starr (pour PC, YC, CLS et PB). Nous tenons à remercier Katia Manova, Fan Ning, et Mesurh Türkekul de l&#39;installation MSKCC Cytologie Moléculaire de base pour aider à cryosectioning et immunocoloration.

1. La dissection de la souris tractus gastro-intestinal <ol><li> Souris euthanasiés par les directives locales IUCAC </li><li> Pin chaque membre sur la surface de styromousse et rincer la surface abdominale avec 70% d'éthanol. Ouvrez cavité abdominale avec incision médiane à long du diaphragme au pubis. Faire une coupe à l'oesophage distal et une seconde coupe à l'intestin distal large et retirer le tube digestif de l'estomac à l'anus en bloc, bien couper les ligaments au niveau du duodénum et le caecum en utilisant de petits ciseaux. Placez tractus gastro-intestinal dans une boîte de Pétri avec du PBS. Disséquer loin mésentère utilisant une pince à épiler (figure 1). Pour séparer l'estomac, l'intestin grêle et le gros intestin, coupées à la jonction pylore et iléo-colique. Rincer la lumière de chaque partie du tractus gastro-intestinal avec PBS aide d'une seringue 5ml attaché à une aiguille d'alimentation (souris âgées) ou aiguille émoussée (jeunes souris). </li><li> Ouvrez l'estomac, l'intestin grêle et le gros intestin le long de la frontière mésentérique. Coupez deux morceaux pour chaque partie du tractus gastro-intestinal, l'un pour la visualisation monter ensemble et un pour cryosection. </li></ol> 2. Whole préparation des échantillons monter et immunomarquage <ol><li> Placer le morceau entier de chaque partie du tractus gastro-intestinal dans un tube de 1,5 cm microcentrifugeuse rempli de 1,0 ml d'acétone glacée et des échantillons de correctif pour au moins 1 heure à 4 ° C. Les échantillons peuvent être conservés jusqu'à 1 semaine à -20 ° C. Nous généralement conserver les échantillons dans de l'acétone et de commencer à préparer cyrosections. </li><li> Laver l'échantillon 2X avec du PBS. Placer l'échantillon dans la boîte de Pétri avec du PBS. Sous dissection miscroscope, soigneusement gratter la couche muqueuse avec un scalpel en tenant une extrémité avec une pince à épiler, laissant la musculeuse. </li><li> Musculaires peuvent être coupés en morceaux de 5 mm pour la coloration avec des anticorps différents. Ne pas stocker plus de deux jours dans du PBS avant coloration. </li><li> Étapes de bloc et d'incubation qui peut être fait dans un puits d'une plaque de 24 puits ou dans un tube de micro 1.5ml. Bloc avec 0,5 ml de tampon de blocage (sérum de chèvre 5%, 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 1 heure à 4 ° C). </li><li> Incuber avec l'anticorps primaire dilué dans du tampon de blocage et tourner la nuit à 4 ° C. Nous avons utilisé avec succès ACK-2 de rat anti-Kit, lapin anti-Ano1, et de lapin anti-PGP9.5 anticorps pour immunomarquage monter ensemble. </li><li> Laver pendant 5 min avec du PBS 2X sur les rotateurs à température ambiante. </li><li> Incuber avec l'anticorps secondaire dilué dans du tampon de blocage pendant 2 heures à température ambiante sur des rotateurs. Nous utilisons généralement Alexa Fluor 488 anti-lapin et Alexa Fluor 594 anticorps anti-rat. </li><li> Laver pendant 15 min avec du PBS 3X sur les rotateurs à température ambiante. </li><li> Mont sur la diapositive, côté séreux sur le dessus pour assurer l'orientation des tissus au cours de la microscopie. Cette orientation sera d'assurer la côté séreux faire face à la lamelle et être rencontrées d'abord comme on se concentre sur la diapositive sur un microscope. Nous faisons cela sur un microscope à dissection. Parfois, nous examinons brièvement les tissus sous microscope à fluorescence pour orienter correctement. Sous la microscopie par fluorescence pour visualiser Kit ou Ano1, on devrait rencontrer le CPI-MY premier réseau du côté de la lamelle. Ensuite, aspirez PBS autant que possible, sans séchage complet. Ajouter 50 ul de médias mis en dur de montage (nous utilisons Prolongez Gold) et placez doucement lamelle sur le dessus du tissu. Permet de définir de montage nuit à température ambiante et de diapositives conserver à -80 ° C. </li><li> Pour l'examen microscopique, nous avons utilisé un microscope à champ large avec un Z-drive. Nous avons utilisé soit un objectif de 20X air (NA 0,75, Plan Apochromat) ou l'objectif du pétrole 60X (NA 1,4, Plan Apochromat) et a pris 2 um um ou 1 Z-sections qui couvrent l'ensemble de la musculeuse. Les images ont ensuite été déconvolué en utilisant le logiciel de déconvolution Autoquant. Sinon, beaucoup d'autres ont utilisé la microscopie confocale à la place avec des résultats similaires. </li></ol> 3. La préparation et immunocoloration Cryosection <ol><li> Placer chaque partie du tractus gastro-intestinal, côté séreux vers le bas, à plat sur un papier filtre. Couper le papier filtre autour du tissu. Placer le tissu sur un papier filtre dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) dans du PBS (on dilue paraformaldéhyde 32% en flacon scellé dans du PBS juste avant utilisation) pendant 2 heures à température ambiante. La fixation peut se faire dans un 6 - ou à 12 puits Plaque selon la taille des tissus, ou dans un tube de 1,5 ml. Si c'est fait dans l'assiette, du parafilm pour minimiser l'exposition PFA. Temps de fixation plus longues peuvent entraîner masquage des antigènes, en particulier pour le ACK-2 anti-Kit anticorps. </li><li> Enlever les tissus de l'IFP et le lieu de saccharose à 30% dans le PBS. Autoriser les tissus à sombrer dans la nuit à 4 ° C. </li><li> Equilibrer les tissus avec 1:1 ratio de 30% de sucrose et PTOM pendant 1 heure. Montez ensuite le tissu verticalement dans cryomold rempli PTOM Le axe longitudinal du tube digestif doit être en parallèle avec le cyrosections. Lors de l'examen des souris avec des génotypes différents ou avec des traitements différents, il peut être utile pour monter des tissus de souris différents sur cryomold mêmes pour assurer le traitement en parallèle. Freeze sur la glace sèche et placer dans un congélateur à -80 ° C pour le stockage. </li><li> Couper 10 cryocoupes umsur la glissière et conserver à -80 ° C au congélateur. Nous habituellement coupé deux sections par diapositive. Nous avons également exécutent habituellement coloration H &amp; E d'une diapositive cryosection. </li><li> Pour l'immunofluorescence, d'abord d'équilibrer glisser à la température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, dessinez cercle autour du tissu en utilisant un stylo PAP. </li><li> Bloc avec 150 ul de tampon de blocage (le même que pour le montage immunomarquage entier) pendant 1 heure. </li><li> Aspirer le tampon de blocage et ajouter 150 ul d'anticorps primaire dilué dans du tampon de blocage et incuber une nuit à 4 ° C dans une chambre humidifiée. </li><li> Laver 5 min avec du PBS 2X. </li><li> Incuber avec l'anticorps secondaire dilué dans du tampon de blocage pendant 2 heures à température ambiante. Nous utilisons généralement Alexa 488 anti-lapin et Alexa 594 anticorps anti-rat. </li><li> Laver pendant 15 min avec du PBS 3X. </li><li> Aspirer glisser sans complètement sécher les tissus. Ajouter une goutte de jeu dure montage de médias au DAPI (nous utilisons Prolongez l'or) et la place # 1.5 lamelle. Placer la lame à température ambiante pendant une nuit de définir et de stocker dans -80 ° C au congélateur. </li><li> Acquérir des images de fluorescence en utilisant trois DAPI, FITC et au Texas Red jeux de filtres. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Ici, nous utilisons le gros intestin comme un exemple. H &amp; E tache d'une saccharose fixes protégés extemporané utilisés pour l'immunofluorescence montre des artefacts par rapport à une section de paraffine de référence (figure 2), où la ligne jaune demarks plexus myentérique entre les couches musculaires longitudinales et circulaires et le demarks ligne verte de la frontière entre le muqueuse et muscularlis. L'examen de la cryosection, à partir de la séreuse à la muqueuse, votre première rencontre avec le mince muscle longitudinal (LM) couche suivie par le plus épais du muscle (CM) La circulaire de la couche. La section doit être en parallèle avec le muscle longitudinal de sorte que le noyau des LM devrait être un peu allongé tandis que les noyaux de la CM doivent être petits et ronds. Entre le LM et CM sont plexi myentériques faite de neurones qui tache avec PGP9.5. PGP9.5 également les processus neuronaux taches tout au long du CM. Le réseau de la CPI myentérique (CCI-MA) entourent le plexus myentérique et sont faits de cellules multipolaires. Au sein de la couche musculaire longitudinale, il est rare CCI intramusculaire (CPI-IMS) qui sont des cellules bipolaires fonctionnant en parallèle avec le muscle. Au sein de la couche musculaire circulaire, il ya abondance de la CPI-IMS, qui sont aussi des cellules bipolaires qui fonctionnent en parallèle avec le muscle circulaire et sont à section avec cette coupe. À la jonction de la musculeuse et la sous-muqueuse, le réseau sous-muqueux de la CPI composée de CPI-PSM est un réseau des CCI plate multipolaire. Examiner le kit de montage toute immunomarquage du gros intestin, on doit s'attendre à rencontrer la CPI-MY premier réseau, puis de la CPI-IM de la CM et la CCI-SMP réseaux, comme on se concentre de la lamelle (Figure. 3) . Mesure volumétrique des réseaux de la CCI en utilisant la reconstruction 3D de l'ensemble de montage des images ont été décrits 10. L'utilisation à large champ de microscope, il est significatif hors-plan de fluorescence dans les images brutes qui peuvent être retirés après déconvolution (figure 3). Incomplet décapage de la muqueuse se traduira par la fluorescence de fond élevé. ANO1 est un autre marqueur de la CPI et co-immunomarquage du KIT et ANO1 montre chevauchement complet de la coloration de la CPI (figure 4). <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Représentant la figure 1. Disséqué tractus gastro-intestinal de souris, reproduit avec l'autorisation 13. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. A) Représentant coloration H &amp; E de l'intestin de souris grand cryocoupes préparé comme décrit et la paraffine de référence intégré coupe montrant des artefacts rétrécissement de cryocoupes. La ligne jaune demarks plexus myentérique et la ligne bleue sépare la muqueuse de la musculeuse. B) Représentant Kit (rouge, ACK-2) et PGP9.5 (vert) immunofluorescence double avec DAPI (bleu) contre-coloration de l'intestin de souris grand. LM: CM musculaires longitudinales: muscle circulaire. Barre d'échelle de 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Représentant Kit (rouge, ACK-2) l'ensemble de montage immunofluorescence du même champ à trois plans focaux, l'ICC mon avion à la frontière LM / CM, le plan de la CCI-IM dans le CM, et l'ICC- SMP avion à la frontière CM / sous-muqueuse. Les images brutes et les images déconvolué sont affichés. Barre d'échelle de 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Représentant double immunofluorescence de Ano1 (vert) et Kit (rouge, ACK-2) dans le gros intestin. Barre d'échelle de 20 um.

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</ol>

Les cellules interstitielles de Cajal ont été initialement caractérisées par Santiago Ramóón y Cajal exactement un siècle, il ya des taches à l&#39;aide de méthylène chromate bleu et argent de la musculeuse digestive. Cajal abord pensé CPI ont été neurones en fonction de leurs procédés qui rappellent des axones et des dendrites. Plus de nombreuses années qui ont suivi, l&#39;étude de la biologie de la CPI a été limitée par le manque de marqueurs spécifiques jusqu&#39;à la découverte de ce kit n&#39;est pas seulement exprimée dans la CPI, mais il est également nécessaire pour leur développement 6. Depuis lors, KIT immunofluorescence a été largement utilisé dans l&#39;étude de la biologie et la CPI a également conduit à l&#39;appréciation de la CPI dans d&#39;autres organes contractiles tels que la vessie. Récemment, ANO1 a été identifié comme un marqueur de la CPI seconde fiable. Il ya eu de nombreuses publications au cours des 15 dernières années par immunofluorescence pour identifier ICC en utilisant diverses techniques de fixation de montage. Dans nos mains &quot;fixe gelé&quot; cryocoupes qui ont été précédées de paraformaldéhyde et de saccharose, d&#39;œuvres protégées par rapport aux meilleures acétone ou paraformaldéhyde post-fixation après cryosectioning. Pour les montages ensemble, nous avons constaté que la fixation acétone suivie d&#39;une dissection muqueuse donne les résultats les plus robustes. Historiquement, le ACK-2 a été l&#39;anticorps Kit de choix pour les souris de la CPI d&#39;identification. Il est un rat monoclonal qui reconnaît le domaine extracellulaire et il est également un anticorps bloquant qui provoque un iléus lorsqu&#39;il est administré à la souris vivante. Cependant, l&#39;épitope ACK-2 est lentement détruite par la fixation de paraformaldéhyde et n&#39;est pas sauvé par des méthodes standard de récupération d&#39;antigène. Nous avons constaté que l&#39;épitope ACK-4 est plus résistant à la fixation de paraformaldéhyde. Par rapport à fixée blocs congelés et des sections, des blocs de paraffine et des sections préserve la morphologie mieux et est plus favorable à l&#39;archivage à long terme (figure 4). Ni ACK ACK-2 ni-4 ont été utilisés avec succès dans des coupes en paraffine. Nous avons caractérisé cette D13A2, un anticorps monoclonal nouveau lapin, fonctionne exceptionnellement bien dans les deux sections fixes gelés et la paraffine du tractus GI. Kit est exprimé dans plusieurs autres types cellulaires, y compris les mélanocytes, les cellules hématopoïétiques, les cellules germinales, et en particulier les mastocytes, qui sont également présents dans le tractus gastro-intestinal. Heureusement, la plupart des cellules de mât sont trouvé est la muqueuse et non pas dans la musculeuse. Double coloration de lapin anti-Ano1 et de rat anti-Kit permet d&#39;éliminer non spécifiques coloration de chaque anticorps (figure 4). Il est également intéressant de noter que l&#39;expression relative de Kit et Ano1 entre sous-classes de la CPI semble différent. Par exemple, dans le petit intestin, coloration Kit est beaucoup plus intense dans myentérique CPI par rapport à la CCI du muscle en profondeur du plexus alors Ano1 coloration est comparable.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Kit de rat anti-anticorps (clone ACK-2) </td><td> eBioscience </td><td> 14-1172 </td><td> Utilisez au 2μg/ml. Épitope est perdu avec overfixation. </td></tr><tr><td> Kit de rat anti-anticorps (clone ACK-4) </td><td> Cedarlane </td><td> CL8936AP </td><td> Utilisez au 2μg/ml. </td></tr><tr><td> lapin anti-KIT anticorps (clone D13A2) </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 3074 </td><td> Utilisation à dilution 1:100. Seuls les anticorps énumérés ici qui fonctionne bien dans les coupes à la paraffine. </td></tr><tr><td> lapin anti-anticorps PGP9.5 </td><td> Abcam </td><td> ab10404 </td><td> Étiquettes cytoplasme de cellules neuronales. Utiles pour le marquage des neurones du plexus myentérique. Utilisation à dilution de 1:1000. </td></tr><tr><td> lapin anti-anticorps Ano1 </td><td> Abcam </td><td> ab53212 </td><td> Utilisez au 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 de chèvre anti-IgG de rat </td><td> Invitrogen </td><td> A-11007 </td><td> Utilisez au 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 de chèvre anti-IgG de lapin </td><td> Invitrogen </td><td> A-11008 </td><td> Utilisez au 2μg/ml </td></tr><tr><td> Needle alimentation animale </td><td> Fisher </td><td> 01-208-87 </td><td> Silicon pointe d&#39;aiguille utiles pour le rinçage tractus gastro-intestinal de souris adultes </td></tr><tr><td> Aiguille émoussée </td><td> Becton Dickison </td><td> 305180 </td><td> Aiguille émoussée utiles pour le rinçage tractus gastro-intestinal de pré-petits sevrés </td></tr><tr><td> Prolongez réactif Antifade or avec DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td> Peuvent utiliser d&#39;autres difficiles réglage du support de montage avec DAPI </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Cryomold </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4557 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek octobre </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde 32% (10ml ampoule scellée) </td><td> EM Sciences </td><td> 15714 </td><td> Ouvrez ampoule scellée et diluer à 4% juste avant l&#39;utilisation </td></tr><tr><td> Blocage de tampon </td><td></td><td></td><td> Sérum de chèvre 5%, 0,1% de Triton X-100 dans du PBS </td></tr></tbody></table>

visualisation des cellules interstitielles de cajal (cic) réseau souris

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Les cellules interstitielles de Cajal (CIC) sont mésenchymateuses dérivées &quot;cellules pacemaker» de la gastro-intestinal (GI) qui génèrent des ondes lentes spontanées requis pour le péristaltisme et de médiation de l&#39;entrée neuronale system1 nerveux entérique. Différents sous-types de la CCI forment des réseaux distincts dans la musculeuse du tractus GI 2,3. Perte ou dommages à ces réseaux est associée à un certain nombre de troubles de la motilité 4. CPI cellules expriment la tyrosine kinase du récepteur KIT sur la membrane plasmique et KIT immunomarquage a été utilisé pour les 15 dernières années à l&#39;étiquette le réseau des CCI 5,6. Surtout, l&#39;activité normale KIT est requis pour le développement de la CPI 5,6. Transformation néoplasique des résultats des cellules de la CPI dans les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST), qui souvent le port de mutations KIT gain de fonction de 7,8. Nous avons récemment montré que ETV1 est un facteur de survie lignée spécifiques exprimées dans la lignée de la CPI / GIST et est un maître régulateur transcriptionnel nécessaire à la fois la formation normale du réseau de la CPI et pour la tumorigenèse de 9 GIST. Nous avons en outre démontrer qu&#39;il coopère avec des mutations activatrices KIT dans la tumorigenèse. Ici, nous décrivons les méthodes de visualisation des réseaux de la CPI sur des souris, largement basé sur les protocoles déjà publiés 10,11. Plus récemment, le canal chlorure anoctamin 1 (ANO1) a également été caractérisé comme un marqueur membranaire spécifique de la CPI 11,12. En raison de leur localisation membrane plasmique, immunofluorescence des deux protéines peut être utilisé pour visualiser les réseaux de la CPI. Ici, nous décrivons la visualisation de la CPI par les réseaux fixes et préparations surgelés cyrosections monter ensemble.

Les cellules interstitielles de Cajal (CIC) sont les cellules pacemaker de gastro-intestinal (GI). Ils forment des réseaux complexes entre les cellules musculaires lisses et de fibres post-ganglionnaires neuronales pour réguler la contractilité IG. Ici, nous présentons les méthodes d&#39;immunofluorescence transversale et l&#39;ensemble de montage de visualisation des réseaux de la CPI murin.

Visualisation des cellules interstitielles de Cajal (CIC) Réseau Souris

Les cellules interstitielles de Cajal (ICC) sont des « cellules pacemaker » d'origine mésenchymateuse du tractus gastro-intestinal (GI) qui génèrent des ondes lentes spontanées...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser les réseaux des CCI du tube digestif de la souris. Cette visualisation est réalisée en premier lieu par la dissection et l'isolement de l'ensemble du tube digestif, puis sa séparation en estomac, intestin grêle, caecum et gros intestin. Ensuite, chaque partie du tube digestif est fixée soit dans de l'acétone suivie d'une élimination de la muqueuse pour l'imagerie en montage complet, soit dans du formaldéhyde glacé, suivie d'un inclusion et d'une cryoséctionnement pour l'imagerie en coupe transversale.Les échantillons sont ensuite marqués par immunofluorescence contre Kit et d'autres épitopes afin de révéler les CCI et autres structures pertinentes. Enfin, des images sont acquises à l'aide d'un microscope à fluorescence. Au bout du compte, on peut obtenir des résultats montrant les effets de manipulations génétiques ou environnementales chez la souris sur l'architecture des CCI, grâce à la microscopie en immunofluorescence.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des CCI, comme la manière dont des réseaux de signalisation spécifiques et des facteurs de transcription influencent l'architecture des réseaux de CCI. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car un épluchage incorrect de la couche muqueuse et une orientation inadéquate de la préparation entière entraîneront une coloration de fond importante et une perte du signal spécifique. Pour commencer la dissection du tube digestif de la souris, fixez les membres d'une souris euthanasiée sur une surface en polystyrène et rincez la surface abdominale avec de l'éthanol à 70 %. Ouvrez la cavité abdominale à l'aide d'une longue incision médiane allant du diaphragme jusqu'au pubis.Effectuez une incision au niveau de l’œsophage distal et une deuxième au niveau de l’intestin grêle distal, puis retirez l’ensemble du tube digestif du ventricule à l’anus sur bloc. Coupez soigneusement les ligaments au niveau du duodénum et du jéjunum à l’aide de petites ciseaux. Placez le tube digestif dans une boîte de Pétri contenant du PBS.Disséquez le mésentère à l'aide de pinces pour séparer l'estomac, l'intestin grêle et le gros intestin. Effectuez une incision au niveau des jonctions pylorique et iléocæcale à l'aide d'une seringue de cinq millilitres munie d'une aiguille d'alimentation ou d'une aiguille émoussée. Rincez la lumière de chaque partie du tube digestif avec du PBS.Ouvrir l'estomac, l'intestin grêle et le gros intestin le long du bord mésentérique. Prélever deux morceaux pour chaque organe digestif : un pour la visualisation en montage complet et un pour les coupes cryogéniques. Fixer l'échantillon en montage complet dans l'acétone avant la cryocoupe afin de préparer l'échantillon pour la coloration immunohistochimique.Tout d'abord, laver l'échantillon deux fois dans du PBS. Ensuite, placer l'échantillon dans une boîte de Pétri contenant du PBS sous un microscope stéréoscopique. Gratter soigneusement la couche muqueuse à l’aide d’un scalpel en tenant une extrémité avec des pinces, puis couper la couche musculaire en morceaux de cinq millimètres pour la coloration avec différents anticorps.Ne conservez pas l'échantillon plus de deux jours avant la coloration dans un tube microfuge de 1,5 millilitre. Incubez l'échantillon dans du tampon de blocage pendant une heure à quatre degrés Celsius. Ensuite, incubez l'échantillon dans des anticorps primaires dilués dans le tampon de blocage, en agitant doucement toute la nuit à quatre degrés Celsius.Nous avons utilisé avec succès des anticorps CK deux rat anti-kitt lapin anti-a O un et lapin anti-PGP 9.5 pour la coloration en montage entier. Le lendemain matin, laver les échantillons deux fois pendant cinq minutes chacun dans du PBS en agitant doucement.Incubez ensuite les échantillons dans des anticorps secondaires dilués dans du tampon de blocage pendant deux heures. À température ambiante, nous utilisons généralement les anticorps Alexa Fluor 488 anti-lapin et Alexa 594 anti-rat. Lavez les échantillons dans du PBS trois fois pendant 15 minutes chacun.À l’aide d’un microscope stéréoscopique, monter les échantillons sur des lamelles côté séreuse vers le haut en éliminant autant que possible le PBS. Appliquer environ 50 microlitres de milieu de montage dur et poser une lamelle dessus. Laisser durcir le milieu de montage toute la nuit et conserver les lamelles à moins 80 degrés Celsius.Pour l'observation et l'acquisition d'images, utilisez un microscope à objectif grand champ. À l'aide d'un moteur Z, nous utilisons soit un objectif à air de 20 fois, soit un objectif à immersion huile de 60 fois, et nous acquérons des sections Z d'un ou deux micromètres couvrant toute la musculeuse. Les images sont ensuite déconvoluées à l'aide d'un logiciel de déconvolution automatique (auto quant).Alternativement, la microscopie confocale peut être utilisée pour préparer des coupes cryogéniques destinées à la coloration immunohistochimique. Placer chaque fragment du tube digestif, côté muqueux vers le bas, à plat sur du papier filtre. Découper le papier filtre autour du tissu.Placer le tissu sur le papier filtre dans du paraformaldéhyde 4 % dans du PBS pendant deux heures à température ambiante. Des durées de fixation plus longues peuvent entraîner un masquage de l'antigène, en particulier pour l'anticorps a K two anti kit. Transférer le tissu dans du saccharose 30 % dans du PBS et laisser le tissu couler toute la nuit à quatre degrés Celsius.Équilibrez le tissu avec un mélange équivalent de saccharose à 30 % et de OCT pendant une heure. Ensuite, montez le tissu verticalement dans un moule cryogénique rempli de OCT. L'axe longitudinal du tube digestif doit être parallèle aux coupes cryogéniques.Lorsqu'on examine des souris présentant des génotypes différents ou provenant de traitements différents, il peut être utile de monter les tissus provenant de différentes souris sur le même moule cryogénique. Pour assurer un traitement parallèle, congeler les moules sur de la glace sèche et les conserver à moins 80 degrés Celsius. Couper des sections cryogéniques de 10 micromètres sur des lames, en plaçant deux sections par lame, et conserver à moins 80 degrés Celsius.Nous réalisons habituellement la coloration H et D sur une lame destinée à l'immunofluorescence. Équilibrez d'abord les lames à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, dessinez un cercle autour du tissu à l'aide d'un stylo à pap.Incuber les sections dans 150 microlitres de tampon de blocage pendant une heure. Aspirer le tampon de blocage et ajouter 150 microlitres d'anticorps primaire dilué dans le tampon de blocage, puis incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius dans une chambre humide. Après deux lavages au PBS de cinq minutes chacun, incuber les échantillons avec les anticorps secondaires dilués dans le tampon de blocage pendant deux heures.À température ambiante, nous utilisons généralement des anticorps secondaires anti-lapin Alexa 488 et anti-rat Alexa 594. Lavez les sections dans du PBS trois fois pendant 15 minutes chacune, en pulvérisant les lames sans laisser complètement sécher le tissu. Ajoutez une goutte de milieu de montage durcissable avec DAPI et placez une lame de couverture numéro 1,5 par-dessus.Placer les lames à température ambiante toute la nuit pour observer les échantillons en utilisant des jeux de filtres dpi, fite et Texas red. Examiner l'intestin grêle depuis le cirr jusqu'à la muqueuse. La couche plus fine de muscle longitudinal ou LM est rencontrée en premier, suivie par le muscle circulaire plus épais ou cm.La section doit être parallèle au muscle longitudinal et perpendiculaire au muscle circulaire, de sorte que les noyaux du ML doivent être quelque peu allongés, tandis que les noyaux du MC doivent être petits et ronds. Entre le ML et le MC se trouvent les plexus myentériques, composés de neurones qui se colorent avec la PGP 9.5, PGP 9.5. Des prolongements neuronaux colorés sont également visibles dans tout le MC lors de l'examen du montage complet. En ajustant le focus depuis la lame, vous rencontrerez l'I-C-C-M-Y-I-C-C-I-M du MC et l'I-C-C-S-M-P.Le réseau des CCI myentériques entoure le plexus myentérique et est composé de cellules multipolaires situées dans la couche musculaire longitudinale. Il existe de rares CCI intramusculaires, qui sont des cellules bipolaires s'étendant parallèlement au muscle dans la couche musculaire circulaire. Il existe de nombreuses CCI ims, également des cellules bipolaires qui s'étendent parallèlement au muscle circulaire et sont observées en coupe transversale dans cette section au niveau de la jonction entre la musculeuse et la sous-muqueuse.Le réseau des CCI sous-muqueuses est un réseau plat de cellules multipolaires. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours si elle est effectuée correctement. Vous devez avoir une bonne compréhension de la dissection et de la coloration immuno-histochimique du tube digestif de la souris afin d'observer l'architecture des CCI.

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