Détection de l'oxyde nitrique et de l'anion superoxyde radical par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique à partir de cellules en utilisant des pièges de spin

Je m’appelle Frederick Dina et je suis professeur agrégé de pharmacologie à l’Université d’État de l’Ohio. Dans cette démonstration, nous montrerons la détection de l’oxyde nitrique et du superoxyde dans les cellules à l’aide de l’EPR. Piégeage par rotation.

Les espèces réactives de l’oxygène et de l’azote ont été impliquées dans le développement de diverses maladies, et leur détection dans les systèmes biologiques est donc d’une importance capitale. Seules quelques méthodes fiables de détection des espèces réactives ont été employées dans les systèmes biologiques, mais elles sont limitées par leur spécificité et leur sensibilité. La chute de spin, cependant, est couramment utilisée pour l’identification de l’éros et implique la réaction d’addition de radicaux à un piège à spin nitro ou à des complexes métalliques formant une addition de spin persistante, qui peut être détectée par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique ou EPR, les différents conduits d’addition de radicaux présentent le spectre distinctif qui peut être utilisé pour identifier les radicaux générés et peuvent fournir une mine d’informations sur la nature et la cinétique des radicaux production.

L’oxyde nitrique syntase catalyse la conversion de la L-arginine en L citruline en utilisant N-A-D-P-H pour produire de l’oxyde nitrique. Dans des conditions de stress oxydatif, l’ENA peut passer de la production d’oxyde nitrique à la production de superoxyde dans un processus appelé découplage, que l’on pense être causé par l’oxydation de l’hème ou le facteur de toux que la régulation de l’oxyde nitrique hydrotérine dans le système biologique est importante car elle joue un rôle essentiel dans la signalisation cellulaire, ce qui entraîne des fonctions physiologiques bénéfiques telles que la dilatation vaso, Mais sa surproduction est souvent associée à des conditions inflammatoires. Par conséquent, la détection de l’oxyde nitrique dans le système biologique est importante.

Une autre classe importante de molécules de signalisation dans les systèmes biologiques sont les espèces réactives de l’oxygène comme l’oxyde nitrique, les espèces réactives de l’oxygène à de faibles concentrations jouent un rôle important dans la régulation de la fonction cellulaire, de la signalisation et de la réponse immunitaire, mais à des concentrations non régulées, elles peuvent entraîner des dommages oxydatifs cellulaires conduisant à un stress oxydatif. L’anion radical du peroxyde S est l’une des espèces réactives de l’oxygène les plus importantes et c’est le principal précurseur de certaines des espèces les plus oxydantes connues pour exister dans les systèmes biologiques tels que le nitrite de peroxyde S et la tige hydroxyle. La détection et/ou la séquestration du peroxyde de soufre dans le système biologique est donc importante car sa génération signale le premier signe d’explosion oxydée avant le départ.

Ce protocole trypsine yeux a cultivé des cellules endothéliales aortiques bovines comme décrit dans la procédure écrite. Transférez les cellules sur un six étiqueté. Plaquez et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 après l’incubation.

Retirez la plaque à six puits de l’incubateur et aspirez le milieu par le premier. Bien laver les cellules deux fois avec un millilitre de tampon phosphate delcos salin ou DPBS. Préparez une solution de sulfate de fer déshydraté de 1,9 millimolaire en ajoutant 0,8 milligramme de sulfate de fer à un millilitre de DPBS avec du chlorure de calcium et du chlorure de magnésium.

Et préparez la solution de MGD en ajoutant 2,7 milligrammes de MGD d’ammonium à 500 microlitres de DPBS avec du chlorure de calcium et du chlorure de magnésium. Ajoutez 210 microlitres de sulfate de fer de 1,9 millimolaire déshydraté fraîchement préparé et 210 microlitres de MGD fraîchement préparé en utilisant un rapport de molarité de un à sept et mélangeur de la suspension résultante. Ajoutez 4,6 microlitres d’ion calcium quatre et mélangez à nouveau la solution en pipetant de haut en bas.

Ensuite, incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 36 minutes. Recueillir le surnat qui se dépose dans un tube einor. Entrez les paramètres d’acquisition EPR champ central de 34 27 modulation goss, amplitude de six goss et fréquence de 9,8 gigahertz.

Étant donné que les paramètres varient d’un instrument et des conditions expérimentales à l’autre, veuillez consulter le texte pour les autres paramètres utilisés dans cet équipement. Transférez le super natin dans un joint à cellules plates EPR avec de la paraffine et placez-le dans la cavité EPR. Enregistrez les spectres pendant environ 21 minutes à 121 balayages et 10,4 secondes par balayage après le déroulement de l’expérience.

Utilisez le traitement brucker WIN EPR pour corriger la ligne de base et intégrer les spectres 2D, ce qui réduit le bruit de fond. Il convient de noter que le temps de balayage et le nombre de balayages peuvent varier d’une expérience à l’autre. Aussi, les méthodes pour corriger la ligne de base peuvent également varier d’un logiciel à l’autre.

Pour commencer le découplage d’Enos, retirez le milieu du deuxième puits des six. Bien placer et laver les cellules deux fois avec un Milliliter DPBS. Ajoutez ensuite 100 microlitres de la solution préparée de 0,5 millimolaire Syn one, et portez le volume à deux millilitres avec du DPBS contenant 10 % FBS incuber les cellules pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 après l’incubation.

Lavez les cellules avec du DPBS deux fois. Ajoutez ensuite 210 microlitres de sulfate de fer heta hydraté fraîchement préparé, 2,8 millimolaires de sulfate de fer hydraté et 210 microlitres de MGD 19,6 millimolaires fraîchement préparé selon la procédure précédente. Ensuite, ajoutez 4,6 microlitres d’ion calcium quatre millimolaires et mélangez à nouveau la solution.

Comme précédemment, incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 36 minutes. Après 36 minutes, récupérez le super natin qui se dépose dans un tube einor et transférez-le dans une cellule plate EPR. Enregistrez les spectres EPR en utilisant les mêmes paramètres d’acquisition qu’avant l’acquisition.

Traiter les données de la même manière avant le début du présent Protocole. Préparez une solution mère d’une molaire de DMPO et de PBS contenant 0,1 millimolaire de DTPA. Préparez ensuite une solution d’un milligramme par millilitre de quatre par 12.

L’acétate de Myra State 13 ou PMA dans le DMSO font des aliquotes d’un millilitre de la solution mère de PMA en la diluant à 10 microgrammes par millilitre dans du PBS dans un tube einor contenant un milligramme par millilitre de glucose D et un milligramme par millilitre. L’albumine produit cinq à 6 millions de cellules PMN par millilitre en pipetant de haut en bas dans un tube einor de 1,5 millilitre. Préparez un mélange d’un volume final de 60 microlitres contenant environ 1,6 fois 10 à six cellules de PMN, 10 millimolaires de DMPO et 0,2 microgramme par millilitre de PMA.

Dans cette expérience, nous utiliserons un spectromètre Bruker ESP 300 en bande X. Transférez la solution dans une cellule plate EPR, puis placez la cellule plate dans la cavité EPR. Entrez les paramètres d’acquisition EPR, le champ central de 3, l’amplitude de modulation 486 goss de 0,5 goss et la fréquence de 9,8 gigahertz.

Étant donné que les paramètres varient d’un instrument à l’autre et les conditions expérimentales à un autre, veuillez consulter le texte pour les autres paramètres utilisés dans cette expérience. Dans cette démonstration, nous montrons la détection des radicaux d’oxyde nitrique et de peroxyde SU à l’aide de deux pièges à spin différents. Le fer MGD et DNPO.

Nous montrons que la stimulation des cellules endothéliales avec l’ion calcium quatre produit de l’oxyde nitrique et le traitement avec l’ion un. Un donneur de nitrite de périne peut diminuer la production d’oxyde nitrique, une stimulation des neutrophiles, cependant, avec PMA en présence d’un piège à spin nitro donne un radical hydroxyle ADDA au lieu de l’oxyde S en raison de l’instabilité du superoxyde adda initialement formé. Alors que les mécanismes de piégeage de spin par le fer mg d nitros sont fondamentalement les mêmes, l’ajout d’oxyde nitrique au fer MGD implique un taux de réussite de réaction et la forme d’ajout d’oxyde nitrique de fer MGD est très stable.

Qu’en fait, on peut congeler la solution à moins 80 degrés centigrades pour une acquisition ultérieure du spectre EPR sans diminution significative de l’intensité de son signal EPR. D’autre part, la détection de l’oxyde à l’aide du piège à spin nitro est lente. Cela nécessite des concentrations plus élevées du piège à spin par rapport à la détection de l’oxyde nitrique MGD 4 de fer.

Plusieurs approches ont été employées pour détecter avec succès la forme de l’adduit superoxyde, ce que nous n’avons plus démontré dans cette vidéo. L’utilisation de cellules plates, par exemple, peut donner une meilleure intensité de signal en raison d’une densité cellulaire plus élevée. Je vous encourage à vous référer au texte à ce sujet.

De plus, au lieu d’utiliser du DMPO, on peut utiliser un piège à spin certifié tel que le BMPO et le VMP ou le Nitro DAP MPO phosphorylé, qui peut produire un addax de peroxyde SU plus persistant. L’utilisation de la cyclodextrine a également été utilisée pour stabiliser le peroxyde de SU lors de l’utilisation du piégeage de spin pour la détection US. L’acquisition immédiate du spectre EP après la génération de superoxyde SU est fortement recommandée.

Par conséquent, la détection de l’oxyde nitrique à l’aide du MGD de fer est beaucoup plus efficace et le principal défi auquel est confronté un piégeage du spin PR du superoxyde est d’atteindre les caractéristiques observées pour la formation de l’oxyde nitrique de fer MGD. C’est-à-dire rapide, la réactivité superoxyde et la stabilité ajoutent des efforts dans le développement de pièges de spin avec une réactivité rapide à la superoxyde et la formation d’un spin stable. L’ADD est actuellement réalisée dans notre laboratoire et par d’autres groupes.