Détection de l'oxyde nitrique et de l'anion superoxyde radical par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique à partir de cellules en utilisant des pièges de spin

Je suis Frederick Dina, et je suis professeur agrégé de pharmacologie à l'Université d'État de l'Ohio. Dans cette démonstration, nous allons montrer la détection du monoxyde d'azote et du superoxyde provenant de cellules à l'aide de la RPE, piègeage de spin.

Les espèces réactives de l'oxygène et de l'azote ont été impliquées dans le développement de diverses maladies, et leur détection dans les systèmes biologiques revêt donc une importance capitale. Peu de méthodes fiables pour la détection des espèces réactives ont été utilisées dans les systèmes biologiques, mais elles sont limitées par leur spécificité et leur sensibilité. La technique du piégeage de spin, en revanche, est couramment utilisée pour l'identification des radicaux libres et repose sur la réaction d'addition d'un radical à un piège à spin nitroso ou à des complexes métalliques, formant un adduit de spin persistant, détectable par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE). Les divers adduits radiculaires présentent des spectres distincts qui permettent d'identifier les radicaux générés et fournissent de nombreuses informations sur la nature et la cinétique de la production radicalaire.

La synthase de l'oxyde nitrique catalyse la conversion de la L-arginine en L-citrulline en utilisant du NADPH pour produire de l'oxyde nitrique. En cas de stress oxydatif, l'ENA peut passer de la production d'oxyde nitrique à celle de superoxyde, un processus appelé découplage, que l'on pense être causé par l'oxydation de l'hème ou du cofacteur hydroptérine. La régulation de l'oxyde nitrique dans les systèmes biologiques est importante car il joue un rôle crucial dans la signalisation cellulaire, entraînant des fonctions physiologiques bénéfiques telles que la vasodilatation, mais sa surproduction est souvent associée à des états inflammatoires. Par conséquent, la détection de l'oxyde nitrique dans les systèmes biologiques est essentielle.

Une autre classe importante de molécules de signalisation dans les systèmes biologiques est constituée des espèces réactives de l'oxygène telles que l'oxyde nitrique. À faible concentration, les espèces réactives de l'oxygène jouent un rôle crucial dans la régulation de la fonction cellulaire, la signalisation et la réponse immunitaire, mais à des concentrations non régulées, elles peuvent provoquer des dommages oxydatifs cellulaires menant au stress oxydatif. L'anion radical superoxyde est l'une des espèces réactives de l'oxygène les plus importantes et constitue le précurseur majeur de certaines des espèces les plus fortement oxydantes connues dans les systèmes biologiques, telles que le peroxyde de nitrite et le radical hydroxyle. La détection et/ou la séquestration de l'anion superoxyde dans les systèmes biologiques est donc essentielle, puisque sa production marque le premier signe d'un pic oxydatif avant le début.

Ce protocole utilise de la trypsine sur des cellules endothéliales aortiques bovines cultivées, comme décrit dans la procédure écrite. Transférez les cellules dans une plaque de six puits étiquetée et incubez-les toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 après l'incubation.

Retirer la plaque à six puits de l’incubateur et aspirer le milieu du premier puits. Laver les cellules deux fois avec un millilitre de solution tampon saline au phosphate Delcos ou DPBS. Préparer une solution de sulfate de fer heptahydraté à 1,9 millimolaire en ajoutant 0,8 milligramme de sulfate de fer à un millilitre de DPBS contenant du chlorure de calcium et du chlorure de magnésium.

Et préparez la solution de MGD en ajoutant 2,7 milligrammes d'ammonium MGD à 500 microlitres de DPBS contenant du chlorure de calcium et du chlorure de magnésium. Ajoutez 210 microlitres de sulfate de fer(II) heptahydraté fraîchement préparé à 1,9 millimolaire et 210 microlitres de MGD fraîchement préparé, en utilisant un rapport molaire de un à sept, puis mélangez la suspension obtenue. Ajoutez 4,6 microlitres d'ion calcium quatre et mélangez à nouveau la solution en aspirant et en expulsant plusieurs fois à l’aide d’une pipette.

Incubez ensuite l'échantillon à 37 degrés Celsius pendant 36 minutes. Recueillez le surnageant qui se dépose dans un tube Eppendorf. Saisissez les paramètres d'acquisition de la RPE : champ central à 34,27 gauss, amplitude de 6 gauss et fréquence de 9,8 gigahertz.

Étant donné que les paramètres varient selon les instruments et les conditions expérimentales, veuillez consulter le texte pour connaître les autres paramètres utilisés avec cet équipement. Transférez le surnageant dans une cellule plane EPR, scellez-la avec du paraffine et placez-la dans la cavité EPR. Enregistrez les spectres pendant environ 21 minutes, avec 121 balayages et 10,4 secondes par balayage, une fois l'expérience terminée.

Utilisez le traitement Bruker WIN EPR pour corriger la ligne de base et intégrer les spectres 2D, ce qui réduit le bruit de fond. Il convient de noter que le temps de balayage et le nombre de balayages peuvent varier d'une expérience à l'autre. De plus, les méthodes de correction de la ligne de base peuvent également varier d'un logiciel à l'autre.

Pour commencer la dissociation d'Enos, retirez le milieu du deuxième puits de la plaque six puits et lavez les cellules deux fois avec un millilitre de DPBS. Ajoutez ensuite 100 microlitres de la solution préparée de Syn un à 0,5 millimolaire et complétez le volume à deux millilitres avec du DPBS contenant 10 % de FBS. Incubez les cellules pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 après l'incubation.

Lavez les cellules deux fois avec du DPBS. Ajoutez ensuite 210 microlitres de sulfate de fer hétérahédraté fraîchement préparé à 2,8 millimolaire et 210 microlitres de MGD préparé fraîchement selon la procédure précédente. Ajoutez ensuite 4,6 microlitres de calcium ion quatre à 1,9 millimolaire, puis mélangez à nouveau la solution.

Comme précédemment, incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 36 minutes. Après 36 minutes, recueillir le surnageant qui se dépose dans un tube einor et le transférer dans une cellule aplatie EPR. Enregistrer les spectres EPR en utilisant les mêmes paramètres d'acquisition qu'auparavant, après l'acquisition.

Traitez les données de la même manière avant le début de ce protocole. Préparez une solution mère de DMPO un molaire dans du PBS contenant du DTPA à 0,1 millimolaire. Préparez ensuite une solution de quatre par 12 à une concentration de un milligramme par millilitre.

Myra État 13 acétate ou PMA dans du DMSO : préparer des aliquotes d'un millilitre de la solution mère de PMA en la diluant à 10 microgrammes par millilitre dans du PBS dans un tube einor contenant un milligramme par millilitre de D-glucose et un milligramme par millilitre d'albumine. Obtenir cinq à six millions de cellules PMN par millilitre en pipetant plusieurs fois de haut en bas dans un tube einor de 1,5 millilitre. Préparer un mélange d'un volume final de 60 microlitres contenant environ 1,6 × 10⁶ cellules de PMN, 10 millimolaire de DMPO et 0,2 microgramme par millilitre de PMA.

Dans cette expérience, nous utiliserons un spectromètre de bande X Bruker ESP 300. Transférez la solution dans une cellule plate pour RPE, puis placez la cellule plate dans la cavité de la RPE. Saisissez les paramètres d'acquisition de la RPE : champ central à 3 486 gauss, amplitude de modulation de 0,5 gauss et fréquence de 9,8 gigahertz.

Étant donné que les paramètres varient d'un instrument à l'autre et selon les conditions expérimentales, veuillez consulter le texte pour connaître les autres paramètres utilisés dans cette expérience afin d'acquérir les spectres. Dans cette démonstration, nous montrons la détection des radicaux monoxyde d'azote et des radicaux d'hydroperoxyde à l'aide de deux pièges à spin différents : le fer MGD et le DNPO.

Nous montrons que la stimulation de cellules endothéliales par l'ion calcium quatre produit de l'oxyde nitrique et que le traitement avec seen one. Un donneur de nitrite périmé peut réduire la production d'oxyde nitrique, une stimulation de neutrophiles, toutefois, avec le PMA en présence d'un piège à spin nitro donne un radical hydroxyle ADDA au lieu de l'oxyde S en raison de l'instabilité du composé adduit de superoxyde initialement formé. Bien que les mécanismes de piégeage de spin par les nitrosos de fer mg d soient fondamentalement identiques, l'addition d'oxyde nitrique au fer MGD implique une vitesse de réaction lente et que la forme adduit de fer MGD avec l'oxyde nitrique est très stable.

En fait, on peut congeler la solution à moins 80 degrés Celsius pour l'acquisition ultérieure du spectre de RPE sans diminution significative de l'intensité du signal de RPE. En revanche, la détection de l'oxyde à l'aide du piège à spin nitro est lente, nécessitant des concentrations plus élevées du piège à spin par rapport au piège à spin ferreux MGD utilisé pour la détection du monoxyde d'azote.

Plusieurs approches ont été utilisées pour détecter avec succès la forme d'adduit du superoxyde, que nous n'avons plus démontrée dans cette vidéo. L'utilisation d'une cellule plate, par exemple, peut fournir une intensité de signal d'adduit de superoxyde plus élevée en raison d'une densité cellulaire accrue. Je vous encourage à vous référer au texte sur cette question.

En outre, au lieu d'utiliser le DMPO, on peut employer un piège à spins certifié tel que le BMPO et le VMP ou le Nitro DAP MPO phosphorylé, qui peut produire des adduits plus persistants avec le superoxyde. L'utilisation de cyclodextrine a également été utilisée pour stabiliser les adduits de superoxyde lors de la détection par piégeage de spins. Il est fortement recommandé d'acquérir immédiatement le spectre de RE après la génération de superoxyde.

Par conséquent, la détection du monoxyde d'azote à l'aide du MGD ferreux est beaucoup plus efficace, et le principal défi actuel auquel fait face le piégeage de spin par PR pour le superoxyde est d'atteindre les caractéristiques observées lors de la formation de l'adduit du monoxyde d'azote avec le MGD ferreux, à savoir une réactivité rapide vis-à-vis du superoxyde et la formation d'adduits stables. Les efforts se concentrent désormais sur l'élaboration de pièges de spin présentant une réactivité rapide envers le superoxyde et conduisant à la formation d'adduits stables. Ces travaux de développement sont actuellement menés dans notre laboratoire ainsi que par d'autres équipes.