La quantification des protéines à l'aide d'enrichissement d'immunoaffinité peptide couplé à la spectrométrie de masse
31 juillet 2011
Normes des isotopes stables et capture par anticorps anti-peptide (SISCAPA) l'enrichissement affinités couples de peptides avec des isotopes stables de dilution spectrométrie de masse (MRM-MS) pour fournir une mesure quantitative des peptides comme substituts pour leurs protéines respectives. Nous décrivons ici le protocole en utilisant des particules magnétiques dans un format partiellement automatisés.
L’objectif général de la procédure suivante est d’isoler et de quantifier les peptides dans un mélange complexe qui agissent comme des substituts de leurs protéines respectives. Tout d’abord, les grandes protéines du mélange sont digérées en peptides constitutifs à l’aide d’une enzyme telle que la trypsine. Ensuite, les analytes peptidiques ciblés et un isotope stable enrichi marqué étalon interne sont enrichis à l’aide d’anticorps antipeptidiques, immobilisés sur des particules magnétiques codées en protéine G après isolement.
Les peptides ciblés sont extraits des particules magnétiques et analysés par spectrométrie de masse pour la quantification par rapport à l’étalon interne. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les immunoessais traditionnels est qu’elle est plus rapide et plus rentable pour construire un grand nombre de tests. Il a un taux de réussite élevé et il est facilement multiplexé, ce qui démontre que la procédure sera présentée.
Un technicien du laboratoire a déposé un Eloqua de plasma de 10 microlitres sur de la glace humide. Transférez l’échantillon dans une plaque à puits profonde de 1000 microlitres et recouvrez d’un film de parabole pour dénaturer les protéines à 20 microlitres d’urée fraîche à neuf molaires 30 millimolaires DTT à chaque échantillon et incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, ajoutez trois microlitres d’acétamide frais à 500 millimolaires d’oto acétamide à chaque échantillon et incubez pendant 30 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Maintenant, diluez l’urée à 0,6 molaire avec 100 millimolaires de tris pH huit, et ajoutez 10 microlitres d’un microgramme par microlitre de voyages et une solution mère pour un rapport enzyme/substrat de un à 50.
Après avoir incubé la réaction à 37 degrés Celsius pendant la nuit à trois microlitres d’acide formique pur jusqu’à une concentration finale de 1 %, continuez à ajouter l’étalon d’isotope stable ou plusieurs étalons. Si vous effectuez un test multiplex, lavez bien la plaque de la cartouche Oasis avec 500 microlitres d’acide formique à 0,1 % dans du nitrile à 80 % d’ECA, en jetant le flux. Ensuite, équilibrez la plaque de la cartouche en ajoutant 500 microlitres d’acide formique à 0,1 % dans de l’eau et jetez le flux.
Chargez les échantillons de digestion sur la plaque de la cartouche et ajustez le vide de manière à ce que le débit soit très lent. Laver trois fois avec 500 microlitres d’acide formique à 0,1 % dans de l’eau et jeter le flux à travers l’éluation des peptides deux fois avec 500 microlitres d’acide formique à 0,1 % dans un essai à 80 %, puis lyophiliser ou accélérer le retour à la siccité de l’éluat et reconstituer les peptides séchés dans 50 microlitres de PBS plus 0,03 % Chaps transfère les échantillons sur une plaque standard Kingfisher à 96 puits ajouter un microgramme d’anticorps et 1,5 microlitre de protéine G billes magnétiques codées par cible. Vortex les perles avant l’ajout.
Pour s’assurer que les billes sont bien suspendues. Couvrir la plaque de papier d’aluminium et incuber toute la nuit à l’aide d’une centrifugeuse à tambour doux. La plaque à 400 tr/min pendant 10 secondes pour éliminer tout liquide de la surface de la feuille.
Retirez le couvercle du film. La manipulation des échantillons s’effectue sur une plate-forme automatisée de martin-pêcheur sur la plate-forme Kingfisher. Lavez les billes deux fois avec 200 microlitres de PBS plus 0,03 % de chaps et une fois avec 200 microlitres d’une dilution de un à 10 de PBS plus 0,03 % de chaps : éliminez maintenant les peptides avec 25 microlitres d’acide acétique à 5 % plus 0,03 % de chaps.
Placez la plaque d’élution sur un aimant et transférez l’éluat dans une plaque à 96 puits en prenant soin de ne pas transférer les billes restantes. Couvrez la plaque avec le tapis de plafond, livrez cette plaque contenant l’éluat au spectromètre de masse triple, quadruple pour analyse. La méthode MRM est construite en obtenant un spectre de masse en tandem du peptide d’intérêt puis en choisissant et en optimisant les meilleurs ions de fragment de transition.
En règle générale, une configuration pour l’analyse MRM utilise un piège C 18 et des colonnes analytiques à deux phases mobiles. Chargez 10 microlitres de l’échantillon et éluez par un gradient linéaire. Intégrez des zones de pics pour les peptides légers et lourds, et calculez le rapport de surface de pic entre les peptides non marqués et marqués dans chaque échantillon.
Les peptides légers et lourds éluent en même temps et plusieurs transitions peuvent être surveillées pour chaque peptide. Pour confirmer l’identité, l’aire du pic du peptide endogène est mesurée par rapport à l’aire de l’étalon interne afin de fournir une mesure quantitative du peptide cible. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en œuvre cette technique dans votre laboratoire. Il peut être utilisé pour quantifier n’importe quelle protéine d’intérêt, ce qui le rend adapté à un large éventail d’applications dans la recherche biologique.
Aperçu
Cet article décrit la technique d'étalonnage par standards d'isotopes stables et capture par anticorps anti-peptides (SISCAPA), qui combine l'enrichissement par affinité des peptides à la spectrométrie de masse avec dilution par isotope stable pour la mesure quantitative des peptides. Le protocole utilise des particules magnétiques dans un format partiellement automatisé afin d'améliorer l'efficacité.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biochimie
- Spectrométrie de masse
Contexte
- La SISCAPA permet la quantification de peptides en tant que substituts de protéines.
- La méthode améliore les dosages immuno-enzymatiques traditionnels en termes de rapidité et de rentabilité.
- Elle convient aux dosages multiplexes, permettant l'analyse simultanée de plusieurs peptides.
- La technique consiste à digérer les protéines en peptides puis à les enrichir à l'aide d'anticorps spécifiques.
Objectif de l'étude
- Isoler et quantifier des peptides à partir de mélanges complexes.
- Présenter un protocole permettant d'améliorer l'efficacité de l'analyse des peptides.
- Fournir une méthode largement applicable en recherche biologique.
Méthodes utilisées
- Digestion des protéines à l'aide de la trypsine pour générer des peptides.
- Enrichissement des peptides ciblés à l'aide d'anticorps anti-peptides sur des particules magnétiques.
- Analyse par spectrométrie de masse pour la quantification des peptides.
- Mise en œuvre d'un flux de travail partiellement automatisé à l'aide de la plateforme Kingfisher.
Résultats principaux
- La méthode SISCAPA offre un taux de réussite élevé pour la quantification des peptides.
- Elle démontre une capacité à multiplexer efficacement les dosages.
- Des mesures quantitatives sont obtenues en comparant les rapports entre peptides légers et lourds.
- La technique est adaptable à diverses protéines d'intérêt.
Conclusions
- La SISCAPA est une méthode robuste pour la quantification de peptides dans des échantillons biologiques.
- Le protocole peut être mis en œuvre dans les laboratoires pour diverses applications.
- Elle présente des avantages par rapport aux méthodes traditionnelles, ce qui en fait un outil précieux en recherche.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La mesure quantitative des protéines reste un goulot d'étranglement critique dans la validation des cibles et la découverte de biomarqueurs, domaines dans lesquels les dosages immuno-enzymatiques traditionnels se heurtent à des limites de coût, de délais d'exécution et d'interférences. La méthode SISCAPA propose une alternative évolutible et multiplexable qui renforce la confiance prédictive en phase précoce de découverte, en permettant une quantification stœchiométrique et indépendante des anticorps des peptides protéotypiques. Cela soutient les décisions portant sur le portefeuille de projets, ajustées au risque, ainsi que la continuité translationnelle depuis l'hypothèse jusqu'aux modèles précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à une quantification précise des protéines cibles dans des matrices complexes.
- Valeur opérationnelle : Réduit l'ambiguïté mécanistique en utilisant des peptides protéotypiques comme substituts stœchiométriques de la concentration en protéine.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des portefeuilles en fournissant des données reproductibles et multiplexables pour la priorisation des cibles.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des protocoles de purification de peptides validés, compatibles avec la quantification par SRM/MRM-MS en aval.
- Valeur opérationnelle : Permet la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à des étalons internes isotopiquement marqués et à une purification par billes magnétiques.
- Extensibilité : Facilite le développement de tests multiplexés pour l'évaluation parallèle de cibles sans appauvrissement du plasma.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie les flux de travail de découverte et précliniques en fournissant des lectures quantitatives de peptides transposables entre différents types d'échantillons.
- Dérisquage mécanistique : Permet l'alignement de biomarqueurs grâce à une détection spécifique des peptides résistante aux interférences dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Confiance prédictive : Soutient les décisions d'avancement ajustées au risque par des mesures quantitatives des protéines sans anticorps.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La SISCAPA s'intègre dans le continuum de la découverte, de la validation de cibles à l'identification de composés d'intérêt, permettant la mesure quantitative des protéines comme base pour le développement de tests et les campagnes de criblage.
- Découverte en biologie : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en quantifiant les protéines cibles dans leurs contextes biologiques natifs.
- Écrans de composés : Offre une prête-à-l'emploi pour les tests grâce à un enrichissement reproductible des peptides et des lectures quantitatives par spectrométrie de masse afin d'évaluer les composés.
- Analytique : Fournit des rapports des aires des pics des peptides légers et lourds comme sorties quantitatives permettant de comparer différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Permet une continuité entre la phase de découverte et la validation préclinique grâce à une quantification standardisée des peptides.
- Réutilisation institutionnelle : Fonctionne comme une plateforme réutilisable pour la quantification multiplexée de cibles à travers différents projets et domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive, validation des cibles, réduction de l'ambiguïté mécanistique.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions d'aller/arrêt, efficacité du capital et réduction des risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et décisions d'avancement ajustées au risque.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en protéomique, en enrichissement basé sur les anticorps et en spectrométrie de masse.
- Dépend de l'accès à des spectromètres de masse compatibles SRM/MRM et à des plateformes de manipulation de billes magnétiques.
- Implique une standardisation inter-équipes des critères de validation des anticorps et de sélection des peptides.
- Implique des adaptations selon les types d'échantillons, notamment le plasma, les lysats cellulaires et les extraits tissulaires.
- Comporte des limitations pratiques liées à la disponibilité des anticorps pour des peptides spécifiques et à l'efficacité de la digestion par la trypsine.
