La quantification des protéines à l'aide d'enrichissement d'immunoaffinité peptide couplé à la spectrométrie de masse

L’objectif général de la procédure suivante est d’isoler et de quantifier les peptides dans un mélange complexe qui agissent comme des substituts de leurs protéines respectives. Tout d’abord, les grandes protéines du mélange sont digérées en peptides constitutifs à l’aide d’une enzyme telle que la trypsine. Ensuite, les analytes peptidiques ciblés et un isotope stable enrichi marqué étalon interne sont enrichis à l’aide d’anticorps antipeptidiques, immobilisés sur des particules magnétiques codées en protéine G après isolement.

Les peptides ciblés sont extraits des particules magnétiques et analysés par spectrométrie de masse pour la quantification par rapport à l’étalon interne. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les immunoessais traditionnels est qu’elle est plus rapide et plus rentable pour construire un grand nombre de tests. Il a un taux de réussite élevé et il est facilement multiplexé, ce qui démontre que la procédure sera présentée.

Un technicien du laboratoire a déposé un Eloqua de plasma de 10 microlitres sur de la glace humide. Transférez l’échantillon dans une plaque à puits profonde de 1000 microlitres et recouvrez d’un film de parabole pour dénaturer les protéines à 20 microlitres d’urée fraîche à neuf molaires 30 millimolaires DTT à chaque échantillon et incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, ajoutez trois microlitres d’acétamide frais à 500 millimolaires d’oto acétamide à chaque échantillon et incubez pendant 30 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Maintenant, diluez l’urée à 0,6 molaire avec 100 millimolaires de tris pH huit, et ajoutez 10 microlitres d’un microgramme par microlitre de voyages et une solution mère pour un rapport enzyme/substrat de un à 50.

Après avoir incubé la réaction à 37 degrés Celsius pendant la nuit à trois microlitres d’acide formique pur jusqu’à une concentration finale de 1 %, continuez à ajouter l’étalon d’isotope stable ou plusieurs étalons. Si vous effectuez un test multiplex, lavez bien la plaque de la cartouche Oasis avec 500 microlitres d’acide formique à 0,1 % dans du nitrile à 80 % d’ECA, en jetant le flux. Ensuite, équilibrez la plaque de la cartouche en ajoutant 500 microlitres d’acide formique à 0,1 % dans de l’eau et jetez le flux.

Chargez les échantillons de digestion sur la plaque de la cartouche et ajustez le vide de manière à ce que le débit soit très lent. Laver trois fois avec 500 microlitres d’acide formique à 0,1 % dans de l’eau et jeter le flux à travers l’éluation des peptides deux fois avec 500 microlitres d’acide formique à 0,1 % dans un essai à 80 %, puis lyophiliser ou accélérer le retour à la siccité de l’éluat et reconstituer les peptides séchés dans 50 microlitres de PBS plus 0,03 % Chaps transfère les échantillons sur une plaque standard Kingfisher à 96 puits ajouter un microgramme d’anticorps et 1,5 microlitre de protéine G billes magnétiques codées par cible. Vortex les perles avant l’ajout.

Pour s’assurer que les billes sont bien suspendues. Couvrir la plaque de papier d’aluminium et incuber toute la nuit à l’aide d’une centrifugeuse à tambour doux. La plaque à 400 tr/min pendant 10 secondes pour éliminer tout liquide de la surface de la feuille.

Retirez le couvercle du film. La manipulation des échantillons s’effectue sur une plate-forme automatisée de martin-pêcheur sur la plate-forme Kingfisher. Lavez les billes deux fois avec 200 microlitres de PBS plus 0,03 % de chaps et une fois avec 200 microlitres d’une dilution de un à 10 de PBS plus 0,03 % de chaps : éliminez maintenant les peptides avec 25 microlitres d’acide acétique à 5 % plus 0,03 % de chaps.

Placez la plaque d’élution sur un aimant et transférez l’éluat dans une plaque à 96 puits en prenant soin de ne pas transférer les billes restantes. Couvrez la plaque avec le tapis de plafond, livrez cette plaque contenant l’éluat au spectromètre de masse triple, quadruple pour analyse. La méthode MRM est construite en obtenant un spectre de masse en tandem du peptide d’intérêt puis en choisissant et en optimisant les meilleurs ions de fragment de transition.

En règle générale, une configuration pour l’analyse MRM utilise un piège C 18 et des colonnes analytiques à deux phases mobiles. Chargez 10 microlitres de l’échantillon et éluez par un gradient linéaire. Intégrez des zones de pics pour les peptides légers et lourds, et calculez le rapport de surface de pic entre les peptides non marqués et marqués dans chaque échantillon.

Les peptides légers et lourds éluent en même temps et plusieurs transitions peuvent être surveillées pour chaque peptide. Pour confirmer l’identité, l’aire du pic du peptide endogène est mesurée par rapport à l’aire de l’étalon interne afin de fournir une mesure quantitative du peptide cible. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en œuvre cette technique dans votre laboratoire. Il peut être utilisé pour quantifier n’importe quelle protéine d’intérêt, ce qui le rend adapté à un large éventail d’applications dans la recherche biologique.