Name: Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo des cellules souches hématopoïétiques humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Découvrez la différenciation ex vivo de cellules souches hématopoïétiques humaines en érythrocytes matures et l'invalidation du facteur de transcription TAL1 par vecteurs lentiviraux. Cette méthode permet d'étudier l'érythropoïèse et la régulation génique.

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Nous remercions L. Douay et MC Giarratana (Université Paris VI, France) pour des conseils sur la différenciation érythroïde ex vivo, D. Allan et H. Atkins (IRSO, Canada) pour fournir des échantillons de sang (obtenues sous l&#39;Hôpital d&#39;Ottawa Research Ethics Board # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne) pour fournir les vecteurs lentiviraux et FJ Dilworth (IRSO, Canada) pour la lecture critique du manuscrit. Ce projet a été financé par une subvention des IRSC (MOP-82813) pour MBCGP est récipiendaire d&#39;une recherche en Ontario Fonds Regulomics bourse de formation postdoctorale calcul. MB titulaire de la Chaire de recherche du Canada dans la régulation de l&#39;expression génique.

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<li>Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+human+red+blood+cell+production+from+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 91, 2664-2671 (1998).</li>
<li>Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3+has+a+nonapoptotic+function+in+erythroid+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation.</a> Blood. 103, 4310-4316 (2004).</li>
<li>Mazurier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+and+efficient+selection+of+human+transduced+primitive+hematopoietic+cells+using+the+humanized+S65T+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein.</a> Gene Ther. 5, 556-562 (1998).</li>
<li>Salmon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+transgene+expression+in+human+hematopoietic+progenitors+and+differentiated+blood+lineages+after+transduction+with+improved+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors.</a> Blood. 96, 3392-3398 (2000).</li>
</ol>

Un certain nombre de méthodes ont été utilisées précédemment pour différencier les cellules érythroïdes en culture avec des degrés variables de succès. Par exemple, certains protocoles sans co-culture sur MS-5 permet l&#39;expansion des cellules érythroïdes, mais ne sont pas efficaces dans la production à pleine maturité globules rouges énucléés 12-17. Alors que d&#39;autres méthodes permettant l&#39;énucléation efficace, il est à la charge de la prolifération 18,19. La méthode que nous avons utili...

lentiviraux médiée knockdown cours ex vivo</emÉrythropoïèse> des cellules souches hématopoïétiques humaines

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

L&#39;érythropoïèse est un système modèle couramment utilisé pour étudier la différenciation cellulaire. Pendant l&#39;érythropoïèse, pluripotentes humain adulte des cellules souches hématopoïétiques (CSH) se différencient en progéniteurs oligopotent, précurseurs engagés et des globules rouges matures 1. Ce processus est régi en grande partie au niveau de l&#39;expression des gènes, par lequel les facteurs de transcription spécifiques d&#39;activer des gènes spécifiques de lignée tout en réprimant de façon concomitante des gènes qui sont spécifiques à d&#39;autres types cellulaires 2. Les études sur les facteurs de transcription réglementant l&#39;érythropoïèse sont souvent réalisées en utilisant des lignées cellulaires humaines et murines qui représentent, dans une certaine mesure, les cellules érythroïdes à des stades donnés de différenciation 3-5. Cependant lignées cellulaires transformées ne peut que partiellement imitent les cellules érythroïdes et surtout ils ne permettent pas d&#39;étudier les changements de manière compréhensible dynamiques qui se produisent que les progrès des cellules par de nombreuses étapes vers leur destin final érythroïdes. Par conséquent, un défi actuel reste le développement d&#39;un protocole d&#39;obtenir une population relativement homogène de CSH primaires et les cellules érythroïdes à différents stades de la différenciation dans des quantités qui sont suffisantes pour effectuer la génomique et la protéomique expériences. Nous décrivons ici un protocole ex vivo de cellules de culture pour induire la différenciation érythroïde des humains hématopoïétiques cellules souches / progénitrices qui ont été isolées du sang de cordon soit, la moelle osseuse ou du sang périphérique adulte mobilisé par G-CSF (cytaphérèses). Ce système de culture, initialement développé par le laboratoire Douay 6, utilise les cytokines et de co-culture de cellules mésenchymateuses d&#39;imiter le microenvironnement médullaire. En utilisant ce protocole ex vivo la différenciation, on observe une forte amplification des progéniteurs érythroïdes, une induction de la différenciation exclusivement vers la lignée érythroïde et une maturation complète du stade de globules rouges énucléés. Ainsi, ce système fournit une occasion d&#39;étudier le mécanisme moléculaire de régulation transcriptionnelle de cellules souches progresser sur la lignée érythroïde hématopoïétiques. Etudier l&#39;érythropoïèse au niveau transcriptionnel nécessite également la capacité de sur-exprimer ou knockdown facteurs spécifiques dans les cellules érythroïdes primaires. Pour ce faire, nous utilisons un système de lentivirus médiation du gène qui permet la livraison de l&#39;infection efficace de diviser et de deux cellules ne se divisant 7. Ici, nous montrons que nous sommes en mesure de l&#39;efficacité knockdown TAL1 facteur de transcription dans les cellules érythroïdes primaires humains. En outre, l&#39;expression de la GFP démontre une efficacité d&#39;infection lentiviraux près de 90%. Ainsi, notre protocole fournit un système très utile pour la caractérisation du réseau de régulation des facteurs de transcription de contrôle qui l&#39;érythropoïèse.

Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Protocole de générer maturité des globules rouges humains à partir souches hématopoïétiques / progéniteurs est décrite. De plus, nous décrivons un système efficace de prestation de lentiviraux méthode pour knockdown l&#39;TAL1 facteur de transcription dans les cellules érythroïdes primaires. L&#39;efficacité de la livraison de gènes médiée lentivirus est démontré en utilisant des virus GFP exprimer.

Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo</emÉrythropoïèse> des cellules souches hématopoïétiques humaines

L'érythropoïèse est un système modèle couramment utilisé pour étudier la différenciation cellulaire. Au cours de l'érythropoïèse, les cellules souches hématopoïétiques adultes humaines pluripotentes...

Le but global de cette procédure est de différencier les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques humaines selon la lignée érythroïde et d'induire l'extinction d'un facteur de transcription particulier durant l'érythropoïèse ex vivo. Ceci est réalisé en isolant tout d'abord les cellules souches et progénitrices humaines positives pour le CD34 à partir de sang de cordon, de moelle osseuse ou de sang périphérique mobilisé avec du GCSF. La deuxième étape de la procédure consiste à différencier ces cellules souches hématopoïétiques selon la lignée érythroïde à l'aide d'une procédure de culture cellulaire en quatre étapes, combinant des cytokines spécifiques et une co-culture sur une couche de cellules stromales afin de reproduire le microenvironnement de la moelle osseuse.Ensuite, préparez des particules de vecteurs rétroviraux exprimant une molécule HRNA ciblant le facteur de transcription d'intérêt, une molécule HRA aléatoire comme témoin négatif et la protéine GFP pour contrôler l'efficacité de l'infection virale. La dernière étape de la procédure consiste à infecter des cellules érythroïdes humaines primaires à un stade donné de différenciation avec des particules lentivi

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Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour effectuer la transduction de vecteurs lentiviraux shRNA afin d’obtenir des lignées cellulaires inactivées stables dans des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques immortalisées (iHSPC).

Inactivation d’un gène médié par l’ARN en épingle à cheveux dans les iHSPC in vitro : un système d’expression shRNA basé sur le lentivirus Livraison dans les iHSPC pour l’inactivation de l’expression génique spécifique

Nous présentons un système in vitro de culture de fœtus de souris des érythroblastes de foie qui dissèque les stades précoces et tardifs de l'érythropoïèse terminale. Ce système facilite l'analyse fonctionnelle des gènes spécifiques à différents stades de développement.

Souris foie fœtal Système de culture à disséquer les fonctions du gène cible dans les stades précoces et tardifs de l&#39;aérogare de l&#39;érythropoïèse

La manipulation de l’expression temporelle des gènes dans les cellules souches embryonnaires (CSE) en différenciation peut être réalisée à l’aide de systèmes de gènes inductibles. Cependant, la génération de ces lignées cellulaires est coûteuse et prend du temps. Ce protocole permet l’expression rapide d’un transgène dans la différenciation des cellules dérivées de l’ES et l’analyse ultérieure de la différenciation hématopoïétique en aval.

Rétroviral infection de cellules souches embryonnaires murines dérivées de cellules du corps embryoïdes pour l&#39;analyse de la différenciation hématopoïétique

Ce protocole décrit l’induction efficace de l’endothélium hémogène et des progéniteurs hématopoïétiques multipotentiels à partir de cellules souches pluripotentes humaines via l’expression forcée de facteurs de transcription.

Induction directe de Hemogenic endothélium et le sang par la surexpression de facteurs de transcription dans pluripotentes humaines Cellules souches

Nous présentons notre protocole pour produire induit progéniteurs érythroïdes (PFE) de fibroblastes adultes de souris à l’aide axée sur le facteur de transcription directement lignée reprogrammation (DLR).

Diriger la lignée reprogrammation de fibroblastes de souris adulte de progéniteurs érythroïdes

Les protocoles décrits pour l'édition génomique très efficace des cellules hématopoïétiques et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) par le système CRISPR/Cas9 pour développer rapidement des systèmes de modèle de souris avec des modifications génétiques hématopoïétiques spécifiques au système.

Modification du génome de Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated pour l'étude des cellules hématopoïétiques dans les modèles de maladie

Ce protocole démontre l'induction d'un programme hémogène dans les fibroblastes dermiques humains par l'expression forcée des facteurs de transcription GATA2, GFI1B et FOS pour produire des cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre.

Reprogrammation hémogénique des fibroblastes humains par expression forcée des facteurs de transcription

Nous fournissons ici un protocole pour le dépistage des facteurs de transcription potentiels impliqués dans le développement de cellules dendritiques (DC) en utilisant la transduction lentivirale de l’ARNh pour obtenir des lignées cellulaires knockdown stables pour la différenciation DC in vitro .

Étude du développement de cellules dendritiques par knockdown de gènes médiés par l’ARN en épingle à cheveux court dans une lignée cellulaire hématopoïétique et progénitrice in vitro

En utilisant le polymère cationique à faible coût polyéthylénimine (PEI), nous avons produit des particules lentivirales pour l’expression stable des shRNA dans les cellules souches embryonnaires humaines H9 (CSEh) et les cellules progénitrices neurales (NPC) dérivées de H9 transduites transitoirement à haute efficacité.

Administration par médiation lentivirale d’ARNs aux CSEh et aux PNJ à l’aide de polyéthylénimine polymère cationique à faible coût (PEI)

Le présent protocole décrit une procédure optimisée de culture de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) pour la greffe robuste de cellules génétiquement modifiées in vivo.

Édition génique CRISPR/Cas9 de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques pour des applications de thérapie génique

La modélisation de l’érythropoïèse offre une occasion précieuse de comprendre l’importance biologique des acteurs de ce processus et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles d’atténuer les défauts de différenciation. Nous décrivons ici une méthode simple et fiable pour différencier efficacement les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices CD34+ ex vivo.

Un pipeline complet pour évaluer l’efficacité de l’érythropoïèse humaine in vitro et ex vivo

Découvrez la différenciation ex vivo de cellules souches hématopoïétiques humaines en érythrocytes matures et l'invalidation du facteur de transcription TAL1 par vecteurs lentiviraux. Cette méthode permet d'étudier l'érythropoïèse et la régulation génique.

Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo des cellules souches hématopoïétiques humaines

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