Name: Test de dépistage du stress oxydatif dans une lignée dastrocytes féline, G355-5 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Découvrez un test de dépistage du stress oxydatif dans les astrocytes félins G355-5 utilisant CM-H2DCFDA et la cytométrie en flux. Cette méthode permet de quantifier les espèces réactives de l'oxygène pour la recherche en neuroprotection.

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1. La culture cellulaire d'astrocytes féline et le traitement par H 2 O 2 <ol><li> Lignée cellulaire Culture G355-5 dans un flacon de 75 cm2 avec les médias DMEM plus nutriments à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu'à confluence de 60% ​​(~ 5 jours). Remplacer les médias tous les 1-2 jours ou au besoin pour maintenir une culture saine. </li><li> Retirez le support et ajouter 2 ml de trypsine à 0,25%. Soulevez les cellules par pipetage pour 45 s - 1 min à température ambiante (RT). </li><li> Transférez rapidement la suspension d'un tube de 15 ml conique contenant 10 ml de médias. Mélanger délicatement. </li><li> Centrifuger à 300 xg, 23 ° C pendant 3 min pour obtenir un culot. Jeter le surnageant sans perturber le culot. </li><li> Ajouter ml 6-7 de milieux frais et de remettre en suspension les cellules. </li><li> Ajouter environ 1 ml de cellules dans chaque puits d'une plaque de 6 puits. Ajouter 2-3 ml de milieu dans chaque puits et incuber jusqu'au confluent de 80-90%. </li><li> Préparer une solution de peroxyde 100 microns (H 2 O 2) dans les médias. </li><li> Retirez le support de chaque puits et les remplacer avec soit 2 ml de milieu frais (contrôle), 2 ml de H 2 O 2 (traitement) ou 2 ml de DPBS. Incuber à 37 ° C CO, 5% 2 pour 3 h. </li><li> Retirer des solutions et ajouter 1 ml de trypsine à lever les cellules. Transfert des cellules dans un tube de 1,7 ml Eppendorf contenant 0,5 ml DPBS. Cette étape doit être effectuée sur chaque bien individuellement afin de prévenir la mort cellulaire à partir d'incubation prolongée trypsine. </li><li> Centrifuger à 300 xg pendant 3 minutes, jetez la. Surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de DPBS </li></ol> 2. Coloration pour ROS <ol><li> Toutes les étapes pour la coloration doit être effectuée avec exposition à la lumière minimale afin de prévenir le blanchiment. </li><li> Ajouter 1 ul de 50 mM à CCCP le contrôle positif. Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 5 min. </li><li> Ajouter 5 pi d'un 10 mm CM-H 2 solution DCFDA à l'H 2 O 2 du groupe. Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 15-30 min. Aucune tache est ajouté à l'échantillon une solution saline. </li><li> Lavez échantillons avec 2 ml de DPBS pour enlever taches résiduelles. </li><li> Centrifuger à 300 xg pendant 3 minutes pour obtenir un culot. </li><li> Resuspendre les cellules dans 0,5 ml de DPBS. Ajouter une PI ul à chaque échantillon, à l'exception de la saline. </li><li> Transfert des échantillons à un tube de 5ml cytomètre en flux. </li><li> Exécuter sur le cytomètre en flux. </li></ol> 3. La cytométrie en flux <ol><li> Exécuter des échantillons sur une FC500 Beckman Coulter (ou équivalent) équipé d'un laser à 488 nm argon et la bande de passe suivants: 525, 775 et 620 nm, tous les 20 ± nm. </li><li> Préparer les contrôles appropriés: cellules non colorées, CM-H 2 DCFDA taché seulement, seul IP, teinté double (témoin négatif). </li><li> Faire un protocole qui a le histoplots suivantes: FS vs SS, PI vs CM-H 2 DCFDA. Il devrait également avoir les histogrammes suivants: le nombre de cellules vs FL1, FL2 et FL3, ce qui correspond à la tache. </li><li> Avant d'exécuter les échantillons, vérifier l'équipement, des fluides et conteneur à déchets. Warm up de l'équipement pendant au moins 20 min. </li><li> Nettoyer l'équipement et effectuer un calibrage avec les perles appropriée selon les normes des fabricants. </li><li> Sélectionnez votre protocole et d'exécuter les échantillons. </li><li> Nettoyer le matériel comme précédemment. </li><li> Nettoyer la ligne de vide selon les normes des fabricants. </li><li> Eteignez le flux et nettoyer la ligne de tête / vide. </li><li> Eteignez le logiciel et l'ordinateur. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Résultats de cytométrie en flux ont été analysées à l'aide FlowJo 7.6 et les contrôles ont été utilisés pour tache de définir objectivement le fenêtrage électronique. Sur cette base, les cellules saines apparaissent sur la gauche de l'histogramme et les ROS (stress oxydatif) a été détecté comme un changement de cellules vers la droite. La figure 1 montre les résultats de l'effet du peroxyde d'hydrogène sur la santé des astrocytes félin. Les données de FL1 a été utilisé pour mesurer l'intensité de CM-H 2 DCFDA, qui indique la présence de ROS. Comme prévu, un montant plus élevé de ROS a été détectée dans l'échantillon traité avec H 2 O 2. Ceci est affichée sur l'histogramme comme un changement dans l'intensité de fluorescence de gauche à droite. Lorsque l'on compare les cellules saines traitées avec du DMEM par rapport DPBS, il n'y avait aucun changement significatif dans la quantité de ROS (Fig 2). <img src="/files/ftp_upload/2841/2841fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Les résultats de cytométrie en flux des niveaux de stress oxydatif dans les astrocytes sains féline et l'effet de H 2 O 2 sur les cellules saines. Les résultats indiquent que H 2 O 2 augmente les niveaux de ROS dans les cellules saines par rapport aux cellules sans traitement (DMEM). <img src="/files/ftp_upload/2841/2841fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Résultats cytométrie de flux de niveaux de ROS détecté dans les cellules saines incubés pendant 3h avec du DPBS.

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</ol>

Un mécanisme suggère souvent de virus induit des lésions neuronales est le stress oxydatif 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. Fondamentalement, il est proposé que l&#39;exposition virale de la glie (astrocytes et microglie) radicaux communiqué réactives de l&#39;oxygène tels que l&#39;hydroxyde, l&#39;anion superoxyde, l&#39;oxyde nitrique, et / ou le peroxyde d&#39;hydrogène, qui sont toxiques pour les neurones. De même, le stress oxydatif a également été suggéré comme un mécanisme majeur pathologique da...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15 à 013-CV </td><td></td></tr><tr><td> MEM Vitamines </td><td> Cellgro </td><td> 25 à 020 cl </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Hyclone </td><td> 17-605E </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Acides aminés non essentiels </td><td> Hyclone </td><td> 25 à 025 cl </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td> 20% (v / v) </td></tr><tr><td> Acides aminés essentiels </td><td> Cellgro </td><td> 25 à 030 cl </td><td> 0,2% (v / v) </td></tr><tr><td> 500ml système de filtration sous vide </td><td> VWR </td><td> 87006-076 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubes coniques </td><td> Falcon </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 75 culture de tissus cm 2 flacons </td><td> Falcon </td><td> 353136 </td><td></td></tr><tr><td> 6 plaque ainsi la culture de tissus </td><td> Falcon </td><td> 353224 </td><td></td></tr><tr><td> CM-H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C6827 </td><td></td></tr><tr><td> Iodure de propidium (PI) </td><td> Sigma </td><td> P4170-10mg </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Lonza </td><td> 17-160F </td><td></td></tr><tr><td> H 2 O 2 </td><td> Sigma </td><td> H6520 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotique HyQ </td><td> Hyclone </td><td> SV30079.01 </td><td> 0,1% (v / v) </td></tr><tr><td> G355-5 cellules </td><td> ATCC </td><td> LCR-2033 </td><td> Normal du cerveau féline </td></tr></tbody></table>

test de dépistage du stress oxydatif dans une lignée d&#39;astrocytes féline, g355-5

Screening Assay for Oxidative Stress in a Feline Astrocyte Cell Line, G355-5

Un mécanisme souvent suggéré de virus induit des lésions neuronales est le stress oxydatif. Les astrocytes ont un rôle important dans le contrôle du stress oxydatif du Système Nerveux Central (SNC). Les astrocytes aider à maintenir un environnement homéostatique des neurones ainsi que des neurones à partir de protéger les espèces réactives de l&#39;oxygène (ERO). CM-H2DCFDA est un indicateur de cellules perméables à la présence des ROS. CM-H 2 DCFDA pénètre dans la cellule comme un composé non fluorescent, et devient fluorescent après estérases cellulaires éliminer les groupes acétate, et le composé est oxydé. Le nombre de cellules, mesurée par cytométrie en flux, qui sont jugés fluorescent vert est une indication du nombre de cellules qui sont dans un état d&#39;oxydation. CM-H 2 DCFDA est sensible à l&#39;oxydation par un grand nombre de différents ROS. Ce manque de spécificité, au sujet desquels les ROS peuvent s&#39;oxyder CM-H 2 DCFDA, rend ce composé un régent précieux pour l&#39;utilisation dans les premiers stades d&#39;une enquête pathogenèse, comme ce test peut être utilisé pour dépister un environnement oxydatif cellulaire indépendamment de laquelle l&#39;oxygène radicale ou une combinaison de ROS sont responsables des conditions cellulaires. Une fois qu&#39;il a été établi que les ROS sont présents par oxydation du CM-H 2 DCFDA alors des expériences supplémentaires peuvent être effectuées pour déterminer les ROS ou combinaison de Ross sont impliqués dans le processus de pathogénie particulière. Les résultats de cette étude démontrent que grâce à l&#39;ajout de peroxyde d&#39;hydrogène une augmentation de la CM-H 2 DCFDA fluorescence n&#39;a été détectée par rapport aux contrôles saline, ce qui indique que ce test est un test utile pour détecter un environnement oxydatif dans les cellules G355-5, un féline lignée d&#39;astrocytes.

Une méthode de dépistage pour détecter des environnements cellulaires oxydatif est de mesurer l&#39;oxydation de la CM-H2DCFDA. Une fois oxydé dans une cellule, le CM-H2DCFDA changements de la non-fluorescente en un composé fluorescent. Ce changement de fluorescence est mesurée par cytométrie en flux et indique le nombre de cellules dans un milieu oxydant.

Test de dépistage du stress oxydatif dans une lignée d&#39;astrocytes féline, G355-5

Un mécanisme souvent suggéré pour expliquer les dommages neuronaux induits par les virus est le stress oxydatif. Les astrocytes jouent un rôle important dans le contrôle du stress oxydatif de...

Les astrocytes jouent un rôle important dans le contrôle du stress oxydatif du système nerveux central, contribuant à maintenir un environnement homéostatique pour les neurones, ainsi qu'à protéger les neurones contre les espèces réactives de l'oxygène. Une méthode permettant de doser le stress oxydatif dans les astrocytes est ici présentée. Pour illustrer le fonctionnement de ce dosage, du peroxyde d'hydrogène et des ERO, généralement produites lors du métabolisme cellulaire, sont appliqués à des astrocytes félin avant le dosage.Pour les espèces réactives de l'oxygène, l'indicateur perméable aux cellules CMH 2D CFDA est ajouté aux cellules. Le CMH 2D CFDA pénètre dans la cellule sous forme de composé non fluorescent, puis les estérases cellulaires éliminent les groupes acétate. Si des espèces réactives de l'oxygène sont présentes, le composé est oxydé et devient fluorescent.Les cellules sont ensuite récoltées et la fluorescence est analysée par cytométrie en flux. Le nombre de cellules fluorescentes indique le nombre de cellules se trouvant dans un état oxydatif. L'objectif est alors, bien sûr, de parvenir à détecter quels radicaux libres de l'oxygène spécifiques sont présents dan

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Cette vidéo décrit la technique de visualisation du stress oxydatif dans les organoïdes en culture. Ce travail aide à comprendre le niveau de stress oxydatif dû à l’accumulation de ROS dans les différents types de cellules présentes dans un organoïde après un traitement avec différents modulateurs de ROS.

Dosage par sonde fluorescente : une technique pour visualiser le stress oxydatif dans les cellules organoïdes intestinales en culture traitées par des inducteurs d’espèces réactives de l’oxygène

Cette vidéo démontre l’évaluation de la santé mitochondriale dans les astrocytes génétiquement modifiés, qui expriment une protéine fluorescente dans leurs mitochondries. La protéine aide à suivre les changements dans la santé mitochondriale lorsque sa fluorescence passe du vert au rouge, indiquant un stress ou des dommages. Les images sont capturées et analysées à l’aide de différents paramètres.

Surveillance par fluorescence du stress mitochondrial dans les astrocytes

Accident vasculaire cérébral ischémique est un événement complexe dans laquelle l’apport spécifique des astrocytes dans la région du cerveau touchée exposés au manque d’oxygène de glucose (AMG) est difficile à étudier. Cet article présente une méthode pour obtenir des astrocytes isolés et étudier leur réactivité et leur multiplication dans des conditions de ministères.

Surveillance des astrocytes réactivité et prolifération in Vitro dans des Conditions de type ischémique

Ce manuscrit décrit l’utilisation de reporters fluorogène génétiquement encodé dans une application de l’imagerie de cellules vivantes pour l’examen du stress oxydatif induit par les xénobiotiques. Cette approche expérimentale offre inégalée de résolution spatio-temporelle, sensibilité et spécificité tout en évitant beaucoup des défauts des méthodes conventionnelles utilisées pour la détection du stress oxydatif toxicologique.

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Nous présentons un protocole pour le développement et l’utilisation d’un modèle de stress oxydatif en traitant les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes avec H2O2, en analysant la morphologie cellulaire, la viabilité, la densité, le glutathion et le niveau UCP-2. C’est un modèle utile pour étudier l’effet antioxydant des protéines sécrétées par les cellules transfectées par transposon pour traiter la dégénérescence neurorétinienne.

Induction et analyse du stress oxydatif dans les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes transfectées par transposon de la belle endormie

Basée sur des expériences in vitro , cette étude a révélé le mécanisme de la crocétine dans la réparation des dommages causés par le stress oxydatif des cardiomyocytes en influençant la mitophagie, dans laquelle la voie de signalisation PINK1 / Parkin joue un rôle important.

Protection des cellules myocardiques H9c2 contre le stress oxydatif par la crocétine via la mitophagie médiée par la voie PINK1/Parkin

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour quantifier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires en utilisant le dihydroéthidium (DHE) comme sonde de colorant de fluorescence en utilisant une approche de criblage à haut débit. Le protocole décrit les méthodes d’évaluation quantitative des espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires dans les trois lignées cellulaires différentes de carcinome hépatocellulaire.

Évaluation préalable à haut débit de la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) à l’aide d’un colorant de fluorescence à base de dihydroéthidium (DHE)

La quantification des formes oxydées et réduites du glutathion (GSSG et GSH, respectivement) a été réalisée grâce à l’utilisation d’ortho-phtalaldéhyde (OPA). L’OPA devient très fluorescent une fois conjugué au GSH, mais il est incapable de conjuguer le GSSG jusqu’à ce qu’il soit réduit. Ici, nous décrivons un test multiparamétrique pour quantifier les deux en utilisant la quantification des protéines pour la normalisation.

Quantification rapide des formes oxydées et réduites de glutathion à l’aide de l’ortho-phtalaldéhyde dans des cellules de mammifères en culture in vitro

Nous décrivons ici un protocole qui facilite la différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines en astrocytes fonctionnels spécifiques du cerveau antérieur. Cela permet d’étudier le rôle des cellules gliales dans la pathogenèse des troubles neurodéveloppementaux, tels que le syndrome de l’X fragile, et de modéliser d’autres troubles cérébraux.

Génération et caractérisation d’astrocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines dépourvus de ribonucléoprotéine messagère X fragile

Ce protocole vidéo démontre une nouvelle méthode pour la génération et la purification ultérieure des cellules progénitrices neuronales à partir d'une source renouvelable de cellules souches neurales (CSN) en fonction de leur physique (taille et granularité interne) et les propriétés fluorescentes en utilisant la technologie de cytométrie en flux.

Le test neuroblaste: Un test pour la génération et l&#39;enrichissement des cellules souches neuronales à partir de différenciation des cellules souches neurales Progeny Par cytométrie en flux

Découvrez un test de dépistage du stress oxydatif dans les astrocytes félins G355-5 utilisant CM-H2DCFDA et la cytométrie en flux. Cette méthode permet de quantifier les espèces réactives de l'oxygène pour la recherche en neuroprotection.

Test de dépistage du stress oxydatif dans une lignée d'astrocytes féline, G355-5

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