Name: Linfection ex vivo de tissus vivants avec des virus oncolytiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Découvrez l'infection ex vivo de tissus frais par le virus vaccinia oncolytique pour évaluer leur infectabilité. Cette méthode permet d'identifier les patients susceptibles de répondre aux thérapies virales anticancéreuses.

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Nous tenons à remercier le Dr Hesham Abdelbary pour fournir des spécimens humains chirurgicales pour les données présentées dans la figure 2.

1. Le traitement des tissus <ol><li> Pour de meilleurs résultats, ce protocole doit être effectuée à l'aide de tissus isolés fraîchement déposés dans des milieux DMEM contenant 10% de FBS, 1% Pennicilin / streptomycine solution, et de 0,1% Amphothericin solution B immédiatement après la chirurgie avant la transformation. Si cela n'est pas possible, les tissus peuvent être laissés la nuit dans ce milieu à 4 degrés avant la transformation. </li><li> Avant le traitement de l'échantillon, stériliser une pince en métal et des lames jetables en les déposant dans une solution d'éthanol à 70% pendant au moins 5 minutes. Aussi préparer une plaque de 24 puits avec 2 ml de milieu DMEM contenant 10% de FBS, 1% Pennicilin / streptomycine solution, et de 0,1% Amphothericin B. </li><li> Recueillir l'échantillon de tissu dans une hotte à flux laminaire de culture cellulaire à l'aide des pinces stérilisées et déposer le tissu dans un plat vide de 15 cm de Pétri, en gardant le couvercle sur le côté, côté stérile en place. </li><li> Dans la hotte de culture cellulaire, l'utilisation de 2 mm biopsie afin d'obtenir différents noyaux d'une variété de régions dans le tissu comme dans la Figure 1. Dépôt des carottes dans le couvercle de l'Pétri de 15 cm à l'aide d'une pince, en laissant assez d'espace entre chaque coeur afin qu'ils puissent être facilement coupé le long de l'axe horizontal. </li><li> Fendez chaque coeur en 4 quarts, même en utilisant une lame de rasoir stérilisée comme dans la Figure 1. </li><li> En utilisant une pipette, mettre chaque trimestre coeur d'un noyau donné dans un puits différent de A1 à A4 comme dans la figure 1, déjà contenant 1,5 ml de DMEM contenant 10% de FBS, 1% Pennicilin / streptomycine solution, et de 0,1% Amphothericin solution B . Répétez l'opération pour chaque core. Cela devrait permettre d'échantillonnage représentatif de la tumeur, tout en minimisant les biais dans un puits donné / état. Pour une meilleure représentation, d'augmenter le nombre de cœurs. </li></ol> 2. Évaluation de la viabilité des tissus <ol><li> Après le traitement des tissus, ajouter 25 pi bleu Alamar à bien # A1 et A2 # comme le montre la figure 1 et incuber pendant 1 heure à 37 degrés dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2. </li><li> Après incubation avec du bleu Alamar, enlever 3 fois 100 pi de chaque A1 et A2 ainsi et le transfert à 6 différents puits d'une plaque de 96 puits. Lire le signal en utilisant un lecteur de plaque à fluorescence (530 d'excitation, 590 émissions) et conserver les données pour vos dossiers. </li><li> Après le signal bleu Alamar a été lu, le transfert de tous les morceaux de tissu en utilisant un embout de la pipette, à partir de puits A1 à C1 qui contient du DMEM, 10% de FBS + PS + AmphoB. Soyez prudent de ne pas transférer une quantité excessive de médias de puits A1. </li><li> Infect godets A3 et A4 respectivement avec 10 6 pfu de la GFP et la luciférase exprimant exprimant virus de la vaccine dilué dans 25 ul de médias. Eh bien A2 peut être infecté par un virus qui exprime que toute transgène donnée, y compris rien du tout. </li><li> 72 heures plus tard, ajouter 25 ul bleu Alamar aux puits C1 et D1 et répétez l'étape 2.2 </li></ol> 3. Visualisation de l'expression du transgène GFP par microscopie de fluorescence <ol><li> Retirez tous les supports de culture de cellules couvrant les morceaux de tissu afin de prendre de bonnes photos de fluorescence. </li><li> En utilisant un microscope à fluorescence de dissection capables, d'abord prendre une image à contraste de phase à une résolution appropriée </li><li> Passer en mode fluorescence et prendre une photo en utilisant le filtre approprié pour visualiser le transgène d'intérêt, dans ce cas, la GFP. </li><li> Utilisez un filtre de fluorescence pour une autre longueur d'onde dans la mesure du possible, une de celle du transgène d'intérêt (comme DP) pour prendre une photo de fluorescence de fond </li></ol> 4. Visualisation d'expression luciférase utilisant un système d'imagerie in vivo (IVIS) <ol><li> Assurez-vous que l'IVIS est initialisé avant de commencer. </li><li> En format A4 et B4 puits, ajouter 5 ul de substrat luciférine 10 mg / ml, bien mélanger et laisser incuber pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Réglez le temps d'exposition IVIS à 5 secondes et prendre une photo de votre puits. Si l'image est saturée, répéter avec le temps faible exposition. S'il n'y a pas de signal, d'augmenter le temps d'exposition. </li><li> Utilisation du logiciel d'imagerie IVIS, vous pouvez retirer de fond en utilisant le signal de même B4 et sélectionnez la région d'intérêt pour quantifier le signal de luminescence. </li></ol> 5. Évaluation des titres viraux par dosage de plaque <ol><li> Avant de quantifier les titres viraux, les tissus doivent d'abord être homogénéisés pour la libération des particules virales. Cela peut être fait quelques mois plus tard dans les échantillons de tissus infectés sont stockés à -80 </li><li> Peser l'échantillon qui doit être homogénéisé en utilisant une échelle d'analyse. Dans ce cas, nous allons utiliser l'échantillon prélevé dans le godet A2. </li><li> Placer le tissu est dans un tube de 5 ml en polystyrène à fond rond faucon et ajouter 1 ml de PBS. Homogénéiser le tissu en utilisant un homogénéisateur de tissu. Si nécessaire, conserver l'homogénat à -80 pour l'évaluation des titres viraux à une date ultérieure. </li><li> Pour un titre virus de la vaccine, première plaque 1 million de cellules U2OS dans une plaque à 6 puits et incuber pendant la nuit dans un degré 37, 5% de CO 2 et humideified tels qu'ils ont atteint environ 95% de confluence le lendemain incubateur. </li><li> Utilisez milieux exempts de sérum pour faire des dilutions en série du virus, en veillant à changer trucs entre chaque étape de dilution. Généralement nous faisons 1 sur 10 dilutions et utiliser 100 ul de transférer dans 900 pi. Combien de dilutions sont faites dépend du rendement du virus prévu. </li><li> Suite à faire les dilutions, retirez le support couvrant les cellules U20S plaqués, puis ajouter 500 ul de stock de virus dilué (pour chaque dilution) pour infecter les cellules U2OS. Incuber les cellules pendant 1 minutes heures à 37 degrés Celsius dans un 5% de CO 2 incubateur humidifié. </li><li> Pendant ce temps, faites chauffer le X 2 concentrés DMEM contenant 20% de FBS, et la solution 3% de CMC dans un bain d'eau 37 degrés. </li><li> Après l'incubation de 1 heure, retirer le support couvrant les cellules infectées U2OS. Mélanger 01:01 volumes de 3% de CMC: 2X DMEM, 20% de FBS ensemble et utiliser 2 ml de ce mélange pour couvrir chaque puits des cellules infectées U2OS. </li><li> Mettez les cellules de retour dans un 37 degré 5% de CO 2 incubateur humidifié pour un autre 48 heures. </li><li> Après 48 heures, ajouter 2 ml de méthanol acide acétique fixatif sur le dessus de la superposition de CMC dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 10 minutes dans une hotte de culture cellulaire. </li><li> Jeter la superposition fixe et lavez restant hors des puits en utilisant l'eau du robinet. </li><li> Colorer les cellules fixées U2OS avec 2 ml d'une solution de bleu de Coomassie par puits et incuber pendant 30 minutes à température ambiante à basse vitesse sur un agitateur assiette. </li><li> Retirer la tache de Coomassie des puits et laver les plaques avec de l'eau du robinet. Laisser sécher avec Couvercle pendant environ une heure. </li><li> Les plaques résultant virale peut être facilement visualisés dans la figure 2C. Les plaques peuvent être stockées indéfiniment à ce stade. </li><li> Nombre de plaques à l'étape de dilution, où entre 10 et 100 plaques sont visibles. </li><li> Multiplier le nombre de plaques comptées par la dilution utilisée et multiplier le nombre obtenu par 2 pour donner un titre en PFU / ml. Par exemple, si 25 plaques sont comptées dans le puits où une dilution million de fois a été utilisé, le titre de l'échantillon initial non dilué est de 25 multiplié par 1 million multiplié par 2 ou 50 millions d'UFP / ml. En outre diviser ce nombre par le poids initialement mesure pour l'échantillon de rendre compte des titres en PFU / g </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Afin de déterminer avec précision si un échantillon de tissu obtenu chirurgicalement normale / tumeur est ou n'est pas infectables par un virus, il faut d'abord s'assurer que l'échantillon de tissu est moins viable. Figure 1A montre que la viabilité peut être évaluée en utilisant un colorant métaboliques (bleu Alamar) et que les tissus normaux et tumoraux peut rester métaboliquement active pendant une période d'au moins 72h. Ceci suggère que les tissus in vivo cultivées ex peut supporter la réplication virale. Un avantage significatif de virus oncolytiques est qu'elles peuvent être modifiées pour exprimer des transgènes thérapeutiques ou d'imagerie. Figure 2D-E montre que la GFP ou luciférase peut être détectée à partir des tissus infectés ex vivo, d'autres soutenant que ces tissus sont viables et aussi infectables. Bien que l'expression du transgène accrue est généralement associé à la réplication virale, il n'est pas nécessairement synonyme d'un cycle de vie virale productive qui conduit à l'auto-amplification et de propagation, ce qui est pensé pour être important pour l'activité thérapeutique. Pour cette raison, il est nécessaire de déterminer si davantage de virus est produit que ce qui était initialement utilisé pour infecter les tissus. Figure 2B montre que, lors de la quantification virale par dosage de plaque, plus le virus est obtenue après 72 heures, puis une infection des tissus prélevés immédiatement après l'infection. Globalement, ces données montrent que le tissu tumoral excisée chirurgicalement peuvent rester viables dans la culture cellulaire pour une période d'au moins 72 heures, au cours de laquelle la réplication virale du temps peut être pris en charge. <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Vue d'ensemble de l'échantillonnage des tissus / sectionnement protocole. Échantillon de tissu est traité par la suppression de plusieurs noyaux 2 mm qui sont ensuite divisés en quatre quartiers qui sont distribuées au hasard dans les puits A1 à A4. Les codes de couleur indiquent les réactifs utilisés dans chaque puits. Les carrés en gris dans le puits représentent chaque trimestre depuis le 6 cœurs individuels représentés. Le tissu dans le puits A1 est transféré à un nouveau puits (C1) avec les médias après la lecture initiale du bleu Alamar. Une seconde lecture est effectuée à la fin de l'incubation de 72 heures avec des virus. Wells A4 et B4 sont complétées par Luciférine après l'incubation 72 heures post-infection <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Viabilité et infectabilité des échantillons de tissus des patients. La viabilité des tissus A) telle que mesurée par Alamar Blue signal à 2 heures et 72 heures après la collecte. L'axe Y représente la vierge corrigées Alamar Blue signal. B) titrage de virus de la vaccinerecueillies par gramme d'échantillons de tissus 2 et 72 heures post-infection. C) Exemple de plaques virus de la vaccine sur les cellules après coloration coomassie U2OS. D) signal de luminescence obtenu à partir de patients VV-luciférase tissu infecté imagées par IVIS. E) photos microscopie à fluorescence d'échantillon de tissu du patient infecté par VV-GFP.

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<li>Kuip, H. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86-86 (2006).</li>
</ol>

Une des étapes cruciales dans ce protocole est d&#39;obtenir des échantillons de tissus frais. Si l&#39;échantillon est mis en culture cellulaire après une longue attente à la salle d&#39;opération dans un média approprié (par exemple PBS), cela peut compromettre la viabilité des tissus et prévenir infectabilité. Fait à noter, les tissus normaux est intrinsèquement plus enclins à ces effets que les tissus tumoraux. Un autre point critique est le nombre de cœurs utilisés pour échantillonner les tissus et la cohérence de leur taille. Incohérences dans la taille va entraîner une variabilité entre les échantillons des patients, car des facteurs tels que l&#39;hypoxie tissulaire et de la surface infectectable va fluctuer en fonction de la taille des noyaux et des quarts de base. Bien que cela puisse être partiellement résolu en utilisant des tissus trancheuses, un avantage de la méthode présentée ici est qu&#39;il est relativement facile, moins sujettes à la contamination, et largement applicable à une variété de types de tissus, y compris les tissus mous ou visqueux, qui ne sont pas facilement se prêtent pour les tissus de trancher. Notamment, le nombre de cœurs peut être augmentée afin d&#39;obtenir une meilleure représentation des tissus. En outre, les noyaux peuvent être coupées en plusieurs morceaux (ex. 5-8) pour accueillir d&#39;autres dosages potentiel d&#39;être fait en parallèle tels que ADN, ARN, ou l&#39;extraction des protéines. Toutefois, le nombre de pièces dans lesquelles les noyaux peuvent être coupés à la taille reproductibles dépendra de la taille réelle des cœurs, qui peut être modifié en utilisant différents carottiers entreprises. Optionnellement, une façon d&#39;aider à obtenir des morceaux de tissu de façon reproductible taille est d&#39;égaliser la longueur des carottes à l&#39;aide d&#39;une règle avant de poursuivre en les subdivisant en petits morceaux. Le protocole peut naturellement être modifiés pour tenir compte d&#39;autres virus et nous avons constaté que les tissus peuvent être viables et le soutien de réplication pour un maximum de 6 jours. Le protocole peut encore être étendu à d&#39;autres mesures viro-transgènes exprimés notamment cytrokines. Après l&#39;infection, les tissus peuvent également être inclus dans la paraffine pour les autres coupes et coloration par des méthodes immunohistochimiques, ce qui permet d&#39;affiner davantage de l&#39;histologie des tissus et comment il se rapporte à une infection virale 10-12.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> De glucose à haute DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> NorthBio Inc </td><td> NBSF-701 </td><td></td></tr><tr><td> Amphothericin solution B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2942 </td><td> Utilisez à 0,1% </td></tr><tr><td> Pennicilin-streptomycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333 </td><td> Utilisez moins de 1% </td></tr><tr><td> Alamar Blue </td><td> Invitrogen </td><td> DAL1025 </td><td></td></tr><tr><td> Sel de potassium D-luciférine </td><td> Produits d&#39;imagerie moléculaire </td><td> D-luciférine 1g de sel de potassium </td><td> Remettre en suspension dans du PBS à 10 mg / ml et filtrer sur filtre de 0,22 um </td></tr><tr><td> MEM en poudre </td><td> Gibco </td><td> # 41500018 </td><td> Faire de la moitié du volume proposé de faire 2X MEM et filtrer sur filtre de 0,22 um avant utilisation </td></tr><tr><td> Carboxyméthyl cellulose (CMC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C9481 </td><td> Faire une solution à 3% dans de l&#39;eau déminéralisée et autoclave. Notez que la poudre peut prendre un certain temps à remettre en suspension </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue R </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B7920 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mm biopsie </td><td> Miltex </td><td> MX-33-31 </td><td></td></tr><tr><td> Double Lames Prep Bord </td><td> Personna Medical Care </td><td> 74-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope de fluorescence dissection </td><td> Leica </td><td> le modèle M205 FA </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;imagerie in vivo du système (IVIS) </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> IVIS ® série 200 </td><td></td></tr><tr><td> Tearor tissus </td><td> Produits Biospec </td><td> modèle de 985370-395 </td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;infection ex vivo de tissus vivants avec des virus oncolytiques

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Virus oncolytiques (OVS) sont les nouvelles thérapeutiques qui reproduire sélectivement dans les cellules tumorales et tuer 1. Plusieurs essais cliniques évaluant l&#39;efficacité d&#39;une variété de plates-formes, y compris oncolytiques HSV, réovirus, et VO vaccine comme traitement pour le cancer sont actuellement en cours 2-5. Une caractéristique clé de virus oncolytiques est qu&#39;ils peuvent être génétiquement modifiées pour exprimer des transgènes journaliste qui permet de visualiser l&#39;infection des tissus par microscopie ou bio-luminescence imagerie 6,7. Cela offre un avantage unique car il est possible d&#39;infecter les tissus de l&#39;ex vivo les patients avant le traitement afin de déterminer la probabilité de succès virothérapie oncolytiques 8. À cette fin, il est essentiel d&#39;échantillon de tissu de façon appropriée pour compenser l&#39;hétérogénéité des tissus et d&#39;évaluer la viabilité des tissus, en particulier avant l&#39;infection 9. Il est également important de suivre la réplication virale utilisant des transgènes journaliste si elle est exprimée par la plateforme oncolytiques, ainsi que par titrage direct de tissus après homogénéisation afin de discriminer entre l&#39;infection abortive et productive. L&#39;objet de ce protocole est de répondre à ces questions et décrit aux présentes 1. Le prélèvement et la préparation des tissus tumoraux pour les deux cultures cellulaires. L&#39;évaluation de la viabilité des tissus en utilisant les colorants métaboliques Alamar Blue 3. Infection ex vivo des tissus cultivés avec des virus de la vaccine exprimant soit la GFP ou luciférase de luciole 4. La détection de l&#39;expression du transgène par microscopie à fluorescence ou en utilisant un système d&#39;imagerie in vivo (IVIS) 5. Quantification de virus par dosage de plaque. Cette méthode globale présente plusieurs avantages, notamment la facilité de traitement des tissus, la rémunération de l&#39;hétérogénéité des tissus, le contrôle de la viabilité des tissus, et la discrimination entre l&#39;infection abortive et les os réplication virale foi.

Les virus oncolytiques sont prometteurs pour traiter le cancer. La capacité de vérifier l&#39;infectabilité des échantillons de tissus provenant de patients vivent avant le traitement est un avantage unique de cette approche thérapeutique. Ce protocole décrit comment traiter les tissus pour les<em&gt; Ex vivo</emInfection&gt; un virus oncolytiques et la quantification ultérieure virale.

L&#39;infection ex vivo de tissus vivants avec des virus oncolytiques

Les virus oncolytiques (VO) sont de nouvelles thérapies qui se répliquent sélectivement dans les cellules tumorales pour les détruire1. Plusieurs essais cliniques évaluant l'efficacité...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer la réplication du virus de la vaccine oncolytique dans des tissus frais obtenus après une intervention chirurgicale. Cela est réalisé en prélevant des échantillons du tissu pour culture cellulaire afin de minimiser les biais dus à l'hétérogénéité tissulaire. Dans un deuxième temps, la viabilité du tissu est évaluée, ce qui garantit la qualité du matériel initial avant l'infection par le virus.L'expression du gène de la tendance virale suivante est surveillée et virale. Les titres sont déterminés. Afin d'évaluer si l'échantillon chirurgical vivant peut supporter une infection productive par la vaccine, des résultats sont obtenus qui montrent une réplication de la vaccine dans les tissus, basée sur l'observation de l'expression d'une protéine fluorescente ou d'un rapporteur bioluminescent et sur une augmentation du titre viral au fil du temps.Bonjour, je suis Jean Simone Diallo. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie du cancer, car elles peuvent permettre d'identifier les patients qui pourraient être particulièrement bien adaptés à un traitement par des virus oncolytiques. Bonjour, moi c'est Naomi, cependant.Cette méthode peut fournir des informations sur la capacité infectieuse des tissus tumoraux à l'aide du virus de la vaccine oncolytique. Elle peut également être appliquée à d'autres virus oncolytiques tels que le virus de la stomatite vésiculaire, et probablement à d'autres virus tels que le virus de l'herpès simplex, l'adénovirus et le virus Rio, avec de légères modifications. Bonjour, je suis Dominic.En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car les tissus peuvent être difficiles à carotter de manière reproductible et découper les carottes en petits morceaux uniformes peut s'avérer délicat. Bonjour, je suis John Bell, et la procédure d'aujourd'hui sera démontrée par deux brillants jeunes étudiants diplômés de mon laboratoire, Naomi DeSilva et Dominic Wa. Ils seront assistés par Derek Butterwick, un interne en chirurgie de l'Hôpital d'Ottawa, qui travaille sous la hotte à flux laminaire. Utilisez une poinçonneuse biopsique de deux millimètres pour prélever des échantillons de tissu à partir de différentes régions de l'échantillon tissulaire.Déposer chaque carotte dans le couvercle d'une boîte de Pétri renversée contenant du PBS à l'aide d'une pipette, en utilisant des pinces pour ajuster l'échantillon si nécessaire. Laisser suffisamment d'espace entre chaque carotte afin qu'elles puissent être facilement coupées selon l'axe horizontal. Utiliser une lame de rasoir stérilisée pour diviser chaque carotte de tissu en quatre quartiers égaux.Ensuite, utilisez une pipette pour placer chaque quartier dans quatre puits distincts d'une plaque 24 puits contenant deux millilitres de milieu. Répétez l'opération en utilisant chaque quartier d'un deuxième cylindre et en plaçant ces quartiers dans les mêmes quatre puits de la plaque 24 puits. Continuez de cette manière jusqu'à ce que tous les cylindres de tissu aient été ensemencés.Une fois que tous les échantillons de tissu ont été déposés dans les puits, ajouter 25 microlitres d'alamar blue dans l'un des puits contenant du tissu ainsi que dans un puit témoin, puis incuber pendant au moins une heure à 37 degrés dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone. Une fois le temps d'incubation écoulé, prélever trois aliquots de 100 microlitres dans chaque puit traité à l'alamar blue et les déposer dans des puits distincts d'une plaque de 96 puits. Répéter l'opération avec deux autres aliquots de 100 microlitres provenant des mêmes puits.Lisez le signal alamar blue à l'aide d'un lecteur de plaques à fluorescence et enregistrez les données. Utilisez une pipette pour transférer chaque morceau de tissu des puits traités avec l'alamar blue vers un puits propre contenant du milieu, sur une plaque 24 puits. Évitez de transférer de grandes quantités de milieu avec l'échantillon.Ensuite, infecter un des puits contenant le tissu avec six unités formant des plaques du virus vaccinia exprimant la GFP, diluées dans 25 microlitres de milieu. Puis infecter un autre puits avec six unités formant des plaques du virus vaccinia exprimant la luciférase. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 heures après l'infection.Ajoutez 25 microlitres d'alamar blue à l'échantillon précédemment analysé. Incubez pendant une heure à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié contenant 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, prélèvez trois échantillons de 100 microlitres et analysez-les dans un lecteur de plaques à fluorescence comme précédemment.Tout d'abord, aspirez le milieu de la cavité traitée au virus vaccinia exprimant la GFP et lavée deux fois au PBS directement dans la cavité. Ensuite, à l’aide d’un microscope stéréoscopique doté de la capacité de fluorescence, prenez une image en contraste de phase du fragment de tissu à une résolution appropriée de 40 fois.Ensuite, passez en mode fluorescent et utilisez un filtre compatible avec la GFP. Visualisez l'expression de la GFP dans le tissu transduit par la GFP. Enfin, utilisez un filtre fluorescent pour une autre longueur d'onde aussi éloignée que possible de celle du transgène d'intérêt.Et prendre une image de la fluorescence de fond. Ensuite, recueillir les fragments de tissu à l’aide de pipettes. Peser le tissu.Cette mesure sera utilisée pour calculer la titration du virus en unités formant des plaques par gramme à la fin de la procédure. Conserver le tissu à moins 80 degrés Celsius pour une titration ultérieure. Pipeter cinq microlitres d'un substrat Lucifer à 10 milligrammes par millilitre dans le puits qui a été transduit avec le virus vaccinia exprimant la luciférase et dans un puits contenant uniquement du milieu de culture tissulaire. Incuber le milieu pendant cinq minutes à température ambiante.Chargez la plaque dans le système d'imagerie in vivo et réglez le temps d'exposition sur cinq secondes. Prenez une image des puits transduits par le virus vaccinia exprimant la luciférase. Répétez la procédure avec un temps d'exposition plus court si l'image apparaît saturée, ou utilisez un temps d'exposition plus long si aucun signal n'est observé.Préparer une plaque à six puits contenant 1 million de cellules U2 OS vivantes par puits dans du milieu complet et incuber toute la nuit dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone afin que les puits atteignent une confluence de 95 % le lendemain. Récupérer les échantillons de tissu infectés précédemment pesés. Transférer les échantillons dans un tube de centrifugation conique en polystyrène de cinq millilitres et ajouter un millilitre de PBS.Utilisez un homogénéisateur de tissus pour homogénéiser le tissu et libérer les particules virales. Préparez ensuite des dilutions sérielles d’un facteur 10 de la suspension virale d’homogénat de tissu dans un milieu sans sérum en transférant 100 microlitres de la suspension virale d’homogénat de tissu dans 900 microlitres de milieu sans sérum, et répétez selon les besoins. Aspirez ensuite le milieu de la plaque à six puits contenant les cellules U2 OS.Introduisez 500 microlitres de chaque dilution sériée dans une cavité de la plaque. Replacez la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire pendant une heure, en agitant doucement les plaques toutes les 15 minutes pour éviter le dessèchement des cellules pendant leur incubation, et préchauffez un flacon plus grand contenant du DMEM double concentration avec 20 % de FBS ainsi qu’un aliquot de solution de CMC à 3 % dans un bain-marie à 37 degrés. Une fois préchauffé, préparez un mélange équivalent de CMC à 3 % et de DMEM double concentration plus 20 % de FBS afin d’obtenir une concentration finale de 1,5 % de CMC et de 10 % de FBS.Après l'incubation, aspirez le milieu des cellules U2 OS et remplacez-le par deux millilitres du mélange CMC 1,5 %, DMEM contenant 10 % de SBF par puits. Replacez la plaque dans l'incubateur de culture tissulaire pendant 48 heures supplémentaires. Après 48 heures, ajoutez deux millilitres de fixateur méthanol-acide acétique au mélange de milieu CMC dans chaque puits, puis incubez la plaque à température ambiante pendant 10 minutes dans la hotte de culture tissulaire.Une fois le temps d'incubation écoulé, aspirez la solution de chacun. Rincez chaque puits avec de l'eau du robinet pour éliminer tout fixatif résiduel. Ensuite, pipetez deux millilitres de solution bleue de Kumasi dans chacun.Placez ensuite la plaque sur une plateforme agitée et incubez à température ambiante pendant 30 minutes tout en agitant doucement. Aspirez la solution bleue de kumasi du puits et rincez à l’eau du robinet. Laissez la plaque découverte dans la hotte pour sécher environ une heure. Comptez les plaques virales à l’étape de dilution où entre 10 et 100 plaques sont visibles.Multiplier le nombre de plaques comptées par la dilution utilisée, puis multiplier le nombre obtenu par deux afin d'obtenir un titre en unités formant des plaques par millilitre. En outre, diviser ce nombre par le poids initialement mesuré pour l'échantillon afin d'exprimer le résultat en unités formant des plaques par gramme. Ce graphique illustre la viabilité tissulaire mesurée par l'intensité du signal d'Alma Blue deux heures et 72 heures après le prélèvement, et montre que les tissus normaux et tumoraux peuvent rester métaboliquement actifs pendant une période d'au moins 72 heures.Ces données représentatives montrent la charge de virus vaccinia recueillie par gramme d'échantillon tissulaire à 2 et 72 heures post-infection. Cela indique que le virus suit un cycle viral productif conduisant à son auto-amplification et à sa propagation. Cette image illustre un signal de luminescence typique obtenu à partir du virus vaccinia chez un patient.Échantillons de tissus infectés par la luciférase imagés à l’aide du système d’imagerie in vivo. Les régions de luminescence intense apparaissent en rouge selon l’échelle de luminescence indiquée à droite. La comparaison des images d’imagerie en microscopie à contraste de phase et en fluorescence du canal GFP démontre la proportion de tissu transduit par le virus vaccinia exprimant GFP. L’absence de signal dans le canal rouge indique la spécificité du signal de fluorescence.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser un tissu frais et d'échantillonner autant que possible des zones représentatives du tissu en suivant cette méthode. D'autres techniques, telles que la fixation des tissus, l'immunohistochimie ou les extractions d'ADN ou d'ARN, peuvent être effectuées à la place du titrage afin de répondre à des questions supplémentaires, comme : quelles structures tissulaires spécifiques le virus infecte-t-il, et quel est l'impact du virus sur l'expression génique ? Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière dont nous traitons les échantillons pour des infections ex vivo avec le virus de la vaccine, ainsi que de la façon dont nous suivons la propagation du virus grâce à l'expression de transgènes GFP ou luciférase.Et enfin, comment isoler un virus à partir d'échantillons par vaccination. N'oubliez pas que le travail avec des virus vivants peut présenter des risques selon la souche, et que des précautions, telles que le port de gants et la manipulation en flux laminaire approprié, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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