Écrans concurrentiel des bibliothèques génomiques de levure Barcoded

L’objectif global de l’expérience suivante est d’utiliser des collections de microbes à code-barres à l’échelle du génome pour comprendre les interactions gène-médicament et gène-environnement de manière très parallèle. Ceci est réalisé en criblant la collection de microbes pour cinq à 20 générations de croissance en présence d’un médicament en utilisant la robotique pour maintenir les cellules en croissance exponentielle. Dans un deuxième temps, des cellules sont collectées, ce qui nous permet d’extraire l’ADN génomique de 4 000 à 6 000 individus simultanément.

Ensuite, les produits PCR comprenant les codes-barres amplifiés sont quantifiés à l’aide de l’hybridation de microréseaux ou du séquençage des codes-barres afin de quantifier les codes-barres, et ainsi déterminer l’abondance de chaque souche dans un pool complexe. En fin de compte, des résultats sont obtenus qui montrent quels mutants à code-barres sont sensibles aux traitements et sont donc épuisés du pool au cours de l’expérience. Le principal avantage de la technique que nous allons voir aujourd’hui est que, plutôt que de traiter les souches individuellement comme des colonies sur des plaques ou une culture liquide individuelle ici, nous pouvons extraire des dizaines ou des centaines de milliers de souches différentes et les analyser comme un seul bassin.

Donc, une fois que nous avons réalisé la puissance de ce test, nous avons dû l’automatiser, et heureusement, je travaillais au capteur de la technologie génomique de Stanford et j’étais entouré d’ingénieurs qui m’ont permis d’accomplir cela, La démonstration du protocole aujourd’hui sera Andrew Smith, un étudiant diplômé senior dans mon laboratoire qui passera en revue tous les protocoles et procédures associées, ainsi que Tanya Durick, qui nous montrera comment faire les aspects de séquençage du protocole. Ce protocole utilise une bibliothèque de mutants de Canada albicans générés par transposition sur la mutagénèse, où chaque mutant porte une étiquette de code-barres pour combiner des mutants individuels en un seul groupe. Une copie de la bibliothèque est reproduite sur 3 84.

Les plaques de puits contenant edia font pousser les colonies à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours jusqu’à ce qu’elles atteignent leur taille maximale. Ensuite, en travaillant dans un environnement microbiologique avec une flamme et des ustensiles de laboratoire stériles, inondez chaque plateau de cinq à 10 millilitres de milieu et laissez tremper pendant cinq minutes. Resus, suspendez les colonies avec un épandeur de cellules et versez le liquide plus les cellules dans un tube à centrifuger conique de 50 millilitres.

Ajouter du DMSO à 7 %Ajustez les cellules à une concentration finale de 600 OD de 50 par millilitre avec des milieux contenant 7 % de DMSO, puis des volumes aliquotes et 40 microlitres dans des tubes de bandelettes PCR, les aliquotes de cellules regroupées peuvent être stockées indéfiniment à moins 80 degrés Celsius. Pour commencer cette procédure, décongelez les aliquotes cellulaires regroupées sur de la glace, diluez immédiatement la mare doucement dans un milieu avec un médicament ou une affection de choix, en inoculant à une OD 600 de 0,0625 dans un volume total de 700 microlitres par puits dans une plaque de 48 puits. Pour les besoins de cette vidéo, des triplés de deux conditions seront préparés.

Inclure au moins un contrôle de solvant approprié sur la plaque. Scellez la plaque avec un sceau en plastique, cultivez les cellules dans un spectrophotomètre ou un agitateur à température contrôlée en secouant à 30 degrés Celsius avec un régime d’agitation déterminé expérimentalement. Par exemple, secouez pendant 14 minutes, lisez bien pendant une minute, puis reprenez l’agitation.

Une partie de la suspension de la cellule peut être récoltée par le robot et stockée sur une plaque de charbon sur le pont robotisé. À des points de génération définis par l’utilisateur, généralement 5, 10, 15 et 20 générations de croissance. Récoltez au moins deux sur 600 cellules pour chaque échantillon et point temporel.

Transférez les échantillons de cellules récoltés dans des micro-tubes à centrifuger à verrouillage sûr. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées pour l’extraction de l’ADN génomique, qui sera montré ensuite pour commencer cette procédure. ADN génomique purifié à partir de cellules récoltées à différents moments avec un kit d’étoiles de levure.

Selon les instructions du fabricant, avec une modification éluée, l’ADN avec 300 microlitres de 0,1 XTE. Ensuite, configurez deux réactions PCR pour chaque échantillon. Un pour les balises UPT et un pour les balises descendantes.

Vérifiez les produits PCR résultants sur un gel. On s’attend à ce qu’un produit de 60 paires de bases pour les deux PCR soit utilisé pour l’hybridation, comme le montrent les voies un et trois. Dans cet exemple, un produit de 130 paires de bases est attendu pour les amplicons pour le séquençage des codes-barres, comme indiqué dans les couloirs cinq et sept.

À ce stade, les produits PCR peuvent être utilisés soit pour l’analyse de microréseaux, soit pour le séquençage direct de codes-barres en fonction du produit PCR généré. Pour vous préparer à l’analyse des microréseaux, préchauffez la température du four d’hybridation à 42 degrés Celsius et installez un bain d’eau bouillante et un seau à glace contenant une boue d’eau glacée. Pré-mouillez les panneaux en les remplissant lentement de 120 microlitres d’hybridation one x. Tampon.

Incuber les matrices dans le tampon d’hybridation à 42 degrés Celsius et 20 tr/min pendant 10 minutes pendant l’incubation, préparer des tubes de 0,5 millilitre avec 120 microlitres d’hybridation. Mélangez par échantillon plus un tampon supplémentaire pour chaque tube. Ajoutez 30 microlitres de PCR d’absorption et 30 microlitres de PCR à l’hybridation pour un volume total de 150 microlitres.

Faire bouillir pendant deux minutes et mettre dans de l’eau glacée pendant au moins deux minutes. Faites tourner brièvement les tubes avant de les utiliser. Retirez le tampon de pré-hybridation des matrices et ajoutez 120 microlitres de mélange PCR d’hybridation pour éviter l’évaporation.

Couvrez les joints du réseau avec un endroit difficile, hybridez-vous pendant 16 heures à 42 degrés Celsius et 20 tr/min. Retirez les matrices du four d’hybridation et retirez les points durs des puces. Retirez lentement le mélange d’hybridation des réseaux à l’aide d’une pipette et remplissez les réseaux.

Avec 120 microlitres de lavage, chargez les matrices dans la rondelle de la station fluidique amorcée. Les puces seront lavées à l’aide du protocole du gène Flex SV 3, 4, 50, avec les modifications suivantes. Une étape supplémentaire avec le lavage A avant la teinture.

Lavage B, température de 42 degrés Celsius au lieu de 40 degrés Celsius et coloration à 42 degrés Celsius sur la station fluidique au lieu de 25 degrés Celsius. Après les opérations fluidiques, exécutez la station fluidique, arrêtez quatre protocoles 50. Déchargez la laveuse après vous être assuré qu’il n’y a pas de bulles d’air.

Placez les réseaux dans le scanner et balayez à une longueur d’onde d’émission de 560 nanomètres. Le produit PCR à 130 paires de bases est utilisé pour le séquençage de codes-barres de nouvelle génération afin d’accomplir ce premier échantillon d’ADN séparé de 12 échantillons sur un gel de 12 %. Ensuite, colorez le gel avec du cyber vert et découpez la bande de gel qui vous intéresse.

L’ADN extrait du gel est ensuite quantifié par PCR en temps réel pour générer des grappes sur une cellule de flux à lecture unique à l’aide du CBOT et du kit de génération de grappes à lecture unique. Chargez la cellule d’écoulement dans le séquenceur et observez la première base se détacher. Le séquenceur présenté ici est un tableau représentatif des données collectées à certains points du protocole.

Le groupe de mutants marqués a été cultivé pendant 20 générations en présence de l’agent antifongique clotrimazole et dans le DMSO en tant que log de contrôle, un rapport de deux a été calculé et tracé pour chaque gène. Toutes les souches qui sont significativement sensibles au traitement au clotrimazole avec un rapport log deux de deux sont surlignées en rouge. Quatre souches sont représentées dans cet exemple, NCP, un ERG deux, et deux allèles indépendants de ERG 11.

La sensibilité de la cible protéique connue des souches de clotrimazole du médicament antifongique détectées comme sensibles dans un dépistage groupé devrait être vérifiée dans des essais de croissance individuels en présence de la même concentration de médicament. Le graphique suivant montre les résultats d’une expérience de confirmation ici. Les quatre souches détectées à l’écran avaient une croissance réduite par rapport à la souche parentale de type sauvage.

BWP 17 indiqué en noir. Ces courbes de croissance individuelles mettent en évidence une caractéristique importante de ces criblages de gènes médicamenteux regroupés, à savoir que le rang absolu d’une souche particulière ne reflète pas nécessairement son niveau exact de sensibilité. De plus, les résultats montrent l’intérêt d’avoir plusieurs allèles pour chaque gène.

Dans ce cas, les deux mutants perturbateurs de l’ERG 11 ont des sensibilités légèrement différentes au médicament. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq jours, de l’inoculation de l’écran à l’analyse des données, si elle est effectuée correctement. Ainsi, bien que chaque expérience individuelle soit biologiquement révélatrice, le véritable pouvoir vient lorsque vous avez fait beaucoup d’expériences et que vous avez collecté une base de données telle que vous êtes maintenant en mesure de prédire la fonction des gènes et l’action des médicaments.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des collections de mutants à code-barres à l’échelle du génome pour le criblage en pool, ainsi que de la façon d’utiliser les microrayons ou le séquençage pour identifier les gènes d’intérêt après son développement. Cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la génomique fonctionnelle d’explorer la fonction de chacun des 6 000 gènes différents du génome de la levure.