Name: Écrans concurrentiel des bibliothèques génomiques de levure Barcoded (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Découvrez le criblage compétitif de bibliothèques génomiques de levure à codes-barres pour étudier les interactions gène-médicament chez Candida albicans. Cette méthode automatisée permet l'analyse parallèle de milliers de mutants.

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Nous tenons à remercier Ron Davis, Adam Deutschbauer, et le laboratoire HIP HOP entière à l&#39;Université de Toronto pour des discussions et des conseils. Le CN est soutenu par des subventions de la National Human Genome Research Institute (Numéro de la subvention HG000205), RO1 HG003317, les IRSC RdP-84 305, et Société canadienne du cancer (# 020380). Jo a été soutenu par le Programme de formation de Stanford Genome (Numéro de la subvention T32 HG00044 du National Human Genome Research Institute) et le National Institutes of Health (numéro Grant P01 GH000205). GG est soutenu par le NHGRI HG003317 RO1 et la Société canadienne du cancer, Grant # 020380, TD et le Centre de séquençage Donnelly est soutenu en partie par des subventions de la Fondation canadienne pour l&#39;innovation pour les docteurs. Brenda Andrews et Jack Greenblatt. AMS est soutenu par l&#39;Université de Toronto Bourse ouverte.

<ol><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li>
<li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li>
<li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li>
<li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetic+Landscape+of+a+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li>
<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenomic+profiling%3A+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li>
<li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li>
<li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li>
<li>Nislow, C., Giaever, G. Chapter 387. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNislow%2C+C+%22Yeast+Gene+Analysis%22">Yeast Gene Analysis</a>. Stark, I., Stansfields, M. J. R. , 2nd Edition, Elsevier Ltd. 387-414 (2007).</li>
<li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. Cold Spring Harbor Laboratory. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd. edn, Cold Spring Harbor Laboratory. (2001).</li>
<li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li>
<li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li>
<li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Ici, nous avons présenté un protocole qui, avec une modification modeste, peut facilement être adapté à un large éventail de collections existantes des codes-barres collections de mutants de microorganismes différents pour créer des collections de mutants étiquetés. Nous soulignons que, bien que nous avons rapporté un protocole sur la mutagenèse transposon marqués pour la levure pathogène C. albicans, un protocole très similaire pourrait être adapté à une grande variété de champignons unicellulaires. Mise à jour, ce protocole fonctionne bien chez les bactéries 13, et actuellement les collections d&#39;un certain nombre d&#39;autres génomes fongiques et bactériennes sont en construction. A l&#39;heure actuelle, ce test fournit la seule complète, l&#39;ensemble du génome d&#39;écran impartiale pour les interactions gène-petite molécule. Une caractéristique particulièrement convaincante de l&#39;essai est qu&#39;aucune connaissance préalable du gène ou de petites molécules est nécessaire. En dépit de la portée et la puissance de ces tests, leur transférabilité à d&#39;autres laboratoires a été entravée par le peu d&#39;investissement initial et outils informatiques pour l&#39;analyse des résultats. Avec l&#39;adoption d&#39;une lecture séquence prochaine génération combinée avec des outils robustes pour l&#39;analyse, nous nous attendons à leur adoption à augmenter.

<table border="1"><tbody><tr><td> Antibiotiques </td><td> Numéros de fournisseur et le catalogue </td></tr><tr><td> Carbénicilline </td><td> Sigma, pièce # C1613 </td></tr><tr><td> Kanamycine </td><td> Sigma, pièce # K1876 </td></tr><tr><td> spectinomycine </td><td> Sigma, pièce # S0692 </td></tr><tr><td> Le chloramphénicol </td><td> Sigma, pièce # C0378 </td></tr><tr><td> DNA Clean-up et des kits de concentration </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprep Kit </td><td> Qiagen, pièce # 27106 </td></tr><tr><td> HiSpeed ​​Maxi Kit Plasmid </td><td> Qiagen, pièce # 12663 </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification </td><td> Qiagen, pièce # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> Qiagen, pièce # 28704 </td></tr><tr><td> PCR et des réactifs d&#39;électrophorèse </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA polymerase (Mg-libres) Tampon </td><td> New England Biolabs, pièce # M0320L </td></tr><tr><td> Mélanger une solution désoxynucléotides </td><td> New England Biolabs, pièce # N0447L </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 </td><td> Sigma, pièce # 63036 </td></tr><tr><td> Agarose, le colorant de charge et d&#39;acides nucléiques tache adapté à l&#39;électrophorèse sur gel </td><td> Divers </td></tr><tr><td> 10X tampon TAE </td><td> Sigma, pièce # T8280 </td></tr><tr><td> 1 Kb DNA Ladder plus </td><td> Invitrogen, pièce # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD bouillon </td><td></td></tr><tr><td> 10 g d&#39;extrait de levure </td><td> Sigma, pièce # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 g de peptone Bacto </td><td> BD Biosciences, pièce # 211677 </td></tr><tr><td> 20 g de dextrose </td><td> Sigma, pièce # D9434 </td></tr><tr><td> Labware </td><td></td></tr><tr><td> Pipettes multicanaux (1000, 200, et 20 pi) </td><td> Divers </td></tr><tr><td> Jetables réservoirs de pipetage </td><td> Divers </td></tr><tr><td> 15 et 50 ml tubes à centrifuger </td><td> Divers </td></tr><tr><td> 96 - et 384 puits profonds plaques à puits </td><td> Axygen scientifique, pièce # P-2ML-SQ-CS &amp; P-384240SQCS </td></tr><tr><td> 96 puits et 384 puits de PCR et le film d&#39;étanchéité </td><td> Divers </td></tr><tr><td> Plaque pour rouleaux d&#39;étanchéité plaques multi-puits </td><td> Sigma, pièce # R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C et 37 ° C en secouant incubateurs pour la culture des bactéries et de levures sur les assiettes et dans les tubes </td><td> Divers </td></tr><tr><td> In vitro transposon mutagenèse </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Tn5 transposase </td><td> Biotechnologies Epicentre, pièce # TNP92110 </td></tr><tr><td> À haut débit de transformation </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 Kit HT Prep Plasmid </td><td> Edge Biosystems, pièce # 84359 </td></tr><tr><td> polyéthylène glycol, poids moléculaire 3350 </td><td> Divers </td></tr><tr><td> l&#39;acétate de lithium </td><td> Sigma, pièce # 517992 </td></tr><tr><td> Plaques de 6 puits, stériles </td><td> Corning, pièce # 3335 </td></tr><tr><td> 50 mg / ml d&#39;uridine </td><td> Sigma, pièce # U3750 </td></tr><tr><td> Solution de 100X tampon Tris-EDTA </td><td> Sigma, pièce # T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td> Divers </td></tr><tr><td> Saumon testicule ADN </td><td> Sigma, pièce # 1626 </td></tr><tr><td> La croissance des collections code-barres </td><td></td></tr><tr><td> Plaques de 48 puits, et si de plus en plus les cultures en plaques </td><td> Greiner, pièce # M9437 </td></tr><tr><td> Sceaux plaque adhésive </td><td> ABgene, pièce # AB-0580 </td></tr><tr><td> 200 flacons de culture ml </td><td> Divers </td></tr><tr><td> Spectrophotomètre permettant d&#39;absorbance </td><td> Divers </td></tr><tr><td> À température contrôlée shaker pour flacons de 250 ml ou spectrophotomètre secouant </td><td> Divers </td></tr><tr><td> Microtube Safe-Lock, 2 ml </td><td> Eppendorf, pièce # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> Hybridation équipements </td><td></td></tr><tr><td> 640 Four à hybridation </td><td> Affymetrix, pièce # 800138 </td></tr><tr><td> GeneChip fluidique station 450 </td><td> Affymetrix, pièce # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray Scanner 3000 </td><td> Affymetrix, pièce # 00-0212 </td></tr><tr><td> Bain d&#39;eau bouillante avec rack flottante </td><td> Divers </td></tr><tr><td> Hybridation des consommables </td><td></td></tr><tr><td> GenFlex Tag tableau 16K v2 </td><td> AffymEtrix, pièce # 511331 </td></tr><tr><td> Solution de Denhardt, concentré 50X </td><td> Sigma, pièce # D2532 </td></tr><tr><td> Streptavidine, la R-phycoérythrine conjugué (SAPE) </td><td> Invitrogen, pièce # S866 </td></tr><tr><td> Microtube Safe-Lock, 0,5 mL </td><td> Eppendorf, pièce # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> Teeny Tough-Spots </td><td> Diversified Biotech, pièce # LTTM-1000 </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M </td><td> BioRad, pièce # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10% de Tween </td><td> Sigma, pièce # T2700 </td></tr><tr><td> Monohydraté MES sans acide </td><td> Sigma, pièce # M5287 </td></tr><tr><td> Sel de sodium MES </td><td> Sigma, pièce # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M de NaCl </td><td> Sigma, pièce # 71386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> Sigma, pièce # S2015 </td></tr><tr><td> Moléculaire de l&#39;eau de qualité de biologie </td><td> Sigma, pièce # W4502 </td></tr><tr><td> Primaires hybridation </td><td> Divers fournisseurs (dessalage standard) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5 &#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotine-GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &#39;biotine-GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &#39;biotine-CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Amorces de séquençage: Plate-forme Illumina </td><td> Divers fournisseurs </td></tr><tr><td> UpTag Forward (100uM) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC CGA ATA GCT ATC CTT GCC T GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTag inverse (100uM) </td><td> 5 &#39;AAT GCG GAT ACG CAC CAC GAC LOI CTT TCC CTA CAC GAC TGC CTT GCC ATC T NNNNN GTC GAC CTG ACG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Forward (100uM) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC CGA ATA GCT ATC CTT GCC T GAA GAA CTC GAG AAC TTC ATC G 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag inverse (100uM) </td><td> 5 &#39;AAT GCG GAT ACG CAC CAC GAC LOI CTT TCC CTA CAC GAC TGC CTT GCC ATC T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3 ` </td></tr><tr><td> Lire 1 UP-tag suivants amorce (100uM) </td><td> 5 &#39;GTC GAC CTG ACG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Lire une BAS-tag amorce SEQ (100uM) </td><td> 5 &#39;TGT CGG CGG TCT CGT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> Lire 2 amorce de séquençage Index (standard Illumina R1 amorce) (100uM) </td><td> 5 &#39;AC LOI CTT TCC CTA CAC GAC TGC CTT GCC ATC T 3&#39; </td></tr><tr><td> Réactifs de séquençage supplémentaires / Equipement </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 Kit UF purification de PCR </td><td> Qiagen, pièce # 29051 </td></tr><tr><td> Pompe à vide </td><td> Tout vendeur </td></tr><tr><td> Collecteur à vide Macherey-Nagel </td><td> Macherey-Nagel, pièce # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen Quant-iT ADNdb BR Assay Kit </td><td> Invitrogen, pièce # Q32853 </td></tr><tr><td> Invitrogen tubes de dosage Qubit </td><td> Invitrogen, pièce # Q32856 </td></tr><tr><td> 40% d&#39;acrylamide, plus de 1% N, N&#39;-méthylène-bis-acrylamide, 37.5:1 </td><td> Bio Rad, pièce # 161-0148 </td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma, pièce # T1503-1KG </td></tr><tr><td> Acide borique </td><td> Sigma, pièce # B6768-500G </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M, pH 8,0 </td><td> Teknova, pièce # E0306 </td></tr><tr><td> Persulfate d&#39;ammonium </td><td> Sigma, pièce # A3678-25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop, pièce # TEM001.25 </td></tr><tr><td> Solution de bromure d&#39;éthidium </td><td> Bioshop, pièce # ETB444.10 </td></tr><tr><td> L&#39;acétate d&#39;ammonium 0,5 M </td><td> Teknova, pièce # A2000 </td></tr><tr><td> 10 mM acétate de magnésium tétrahydraté </td><td> Sigma, pièce # M0631-100G </td></tr><tr><td> 1mM EDTA, pH 8,0 </td><td> Voir EDTA 0,5 M, pH 8,0 </td></tr><tr><td> Éthanol </td><td> Divers </td></tr><tr><td> L&#39;acétate de sodium, pH 5,2 </td><td> Teknova, pièce # S0297 </td></tr><tr><td> Vitesse à vide </td><td> Divers </td></tr><tr><td> Single-Kit Lire Génération Cluster </td><td> Illumina, pièce # GD-300-1001 </td></tr><tr><td> 36c Séquencement v4 kit </td><td>Illumina, pièce # FC-104-4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> Recette de TBE 10X <table border="1"><tbody><tr><td> Montants </td><td> Réactifs </td></tr><tr><td> 108 grammes </td><td> Tris Base </td></tr><tr><td> 55 grammes </td><td> Acide borique </td></tr><tr><td> 40mL </td><td> EDTA 0,5 M (pH 8,0) </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajouter dH 2 O pour marquer 1L </td></tr></tbody></table> 12% de gel de polyacrylamide recette <table border="1"><tbody><tr><td> Volumes </td><td> Réactifs </td></tr><tr><td> 5,8 ml </td><td> 40% d&#39;acrylamide, plus de 1% N, N&#39;-méthylène-bis-acrylamide, 37.5:1 </td></tr><tr><td> 12 ml </td><td> dH 2 O </td></tr><tr><td> 2 ml </td><td> TBE 10X </td></tr><tr><td> 140 ul </td><td> Persulfate d&#39;ammonium à 10% </td></tr><tr><td> Le volume total: 20ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag mélange d&#39;amorces: Resuspendre Uptag et Buptagkanmx4 chacun dans ddH 2 O à 100 uM, puis mélanger dans un rapport 1:1 pour une concentration finale de 50 uM de chacun. Conserver à -20 ° C. Downtag mélange d&#39;amorces: Resuspendre Dntag et Bdntagkanmx4 chacun dans ddH 2 O à 100 uM, puis mélanger dans un rapport 1:1 pour une concentration finale de 50 uM de chacun. Conserver à -20 ° C. Oligonucléotides mixtes: Resuspendre chacun des huit suivantes oligos (standard dessalé) dans le trou DDH 2 O à 100 M: Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp. Mélanger un volume égal de huit oligonucléotides pour une concentration finale de 12,5 uM de chacun. 12X MES stock: Pour 10 ml, dissoudre 0,7 g MES monohydrate d&#39;acide libre et 1,93 g de sel de sodium dans 8 ml MES de biologie moléculaire, l&#39;eau de qualité. Après en mélangeant bien, vérifier le pH et l&#39;ajuster si nécessaire à un pH 6.5 au 6.7. Ajouter l&#39;eau pour un volume total de 10 ml. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière (par exemple, envelopper le tube dans du papier). Remplacer si la solution devient visiblement jaune ou après 6 mois. Tampon d&#39;hybridation 2X: Pour 50 ml, mélanger 8,3 ml de 12X MES stock (à partir de 2.9.14), 17,7 ml de NaCl 5 M, 4,0 ml d&#39;EDTA 0,5 M, 0,1 ml de 10% de Tween 20 (vol / vol), et 19,9 ml filtrée ddH 2 O. Stériliser par filtration. Lavez A: Mélanger 300 ml 20X SSPE, 1 ml de Tween 10% (vol / vol), 699 ml ddH 2 O. Stériliser par filtration. Lavez B: Mélanger 150 ml 20X SSPE, 1 ml de Tween 10% (vol / vol), 849 ml ddH 2 O. Stériliser par filtration. Amorces de séquençage Barcode Dans les séquences des amorces UP-tag 5 &#39;de la queue (en gras) sont des séquences d&#39;Illumina adaptateur spécifique incorporé dans l&#39;apprêt F et R. La séquence variable (en italique) représente la balise indexation 5-mer utilisée dans le multiplexage / index de lecture. La queue du 3 &#39;(souligné) représente l&#39;amorce commune flanquant le code à barres uptag et est nécessaire pour amplifier le code-barres de la levure. Dans BAS-tag apprêt séquences 5 &#39;queue est identique à 5&#39; queue de l&#39;UP-tag amorces (Illumina séquence spécifique), cependant, la 3 &#39;de la queue (souligné) est remplacé par les amorces communs qui sont utilisés pour amplifier le BAS- tag codes à barres.

Écrans concurrentiel des bibliothèques génomiques de levure barcoded

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

En vertu de progrès dans les technologies de prochaine génération de séquençage, nous avons accès à de nouvelles séquences du génome presque quotidiennement. Le tempo de ces avances est l&#39;accélération, en promettant une plus grande profondeur et la largeur. À la lumière de ces avancées extraordinaires, le besoin de méthodes rapides, parallèlement à définir la fonction des gènes devient de plus en plus important. Les collections de mutants de délétion du génome entier dans les levures et E. coli ont servi comme bêtes de somme pour la caractérisation fonctionnelle de la fonction des gènes, mais cette approche n&#39;est pas extensible, le courant de gènes de suppression des approches nécessitent chacune des milliers de gènes qui composent un génome à être supprimé et vérifiées. C&#39;est seulement après ce travail est terminé nous pouvons poursuivre le phénotypage à haut débit. Au cours des dix dernières années, notre laboratoire a affiné un portefeuille de la concurrence, miniaturisé et à haut débit l&#39;ensemble du génome des dosages qui peuvent être effectuées en parallèle. Cette parallélisation est possible en raison de l&#39;inclusion des «balises» de l&#39;ADN, ou «code-barres,&quot; dans chaque mutant, avec le code à barres servant de proxy pour la mutation et l&#39;on peut mesurer l&#39;abondance de codes à barres pour évaluer l&#39;aptitude de mutants. Dans cette étude, nous cherchons à combler le fossé entre la séquence d&#39;ADN et de code-barres collections de mutants. Pour ce faire, nous introduisons un transposon combinés des perturbations-barcoding approche qui ouvre de tests de codes à barres parallèles à nouveau séquencé, mais mal caractérisé les microbes. Pour illustrer cette approche, nous présentons une nouvelle collection de Candida albicans perturbations code-barres et décrire comment les deux basé sur un microréseau et la prochaine génération de plates-formes basées séquençage peut être utilisé pour collecter 10.000 - 1.000.000 gène-gène et gène-médicament interactions en une seule expérience.

Nous avons développé complètes, impartiales échelle du génome écrans à comprendre gène-médicament et les interactions gènes-environnement. Méthodes de dépistage de ces collections de mutants sont présentées.

Écrans concurrentiel des bibliothèques génomiques de levure Barcoded

Grâce aux progrès des technologies de séquençage de nouvelle génération, nous avons accès à de nouvelles séquences génomiques presque quotidiennement. Le rythme de ces avancées est...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser des collections de micro-organismes munies de codes-barres génomiques pour étudier les interactions gène-médicament et gène-environnement de manière hautement parallèle. Cela est réalisé en criblant la collection de micro-organismes pendant cinq à vingt générations de croissance en présence d'un médicament, en utilisant la robotique pour maintenir les cellules en croissance exponentielle. Dans un deuxième temps, les cellules sont collectées, ce qui nous permet d'extraire l'ADN génomique de 4 000 à 6 000 individus simultanément.Les produits de PCR suivants, comprenant les codes à barres amplifiés, sont quantifiés à l'aide soit d'une hybridation sur puces à ADN, soit d'un séquençage des codes à barres afin de quantifier ces derniers et ainsi déterminer l'abondance de chaque souche dans un pool complexe. En fin de compte, les résultats obtenus montrent quels mutants porteurs de codes à barres sont sensibles aux traitements et sont donc éliminés du pool au cours de l'expérience. Le principal avantage de la technique que nous allons voir aujourd'hui est qu'au lieu de manipuler les souches individuellement, sous forme de colonies sur des boîtes ou de cultures liquides individuelles, nous pouvons étudier des dizaines, voire des centaines de milliers de souches différentes et les analyser ensemble en un seul pool.Ainsi, une fois que nous avons pris conscience de la puissance de ce test, nous avons dû l'automatiser. Heureusement, je travaillais au centre de technologie génomique de Stanford, entouré d'ingénieurs qui m'ont permis de réaliser cela. Le protocole sera démontré aujourd'hui par Andrew Smith, un étudiant diplômé senior de mon laboratoire, qui présentera toutes les procédures et les protocoles associés, ainsi que par Tanya Durick, qui nous montrera comment effectuer les étapes de séquençage du protocole. Ce protocole utilise une bibliothèque de mutants de Candida albicans générés par mutagenèse par transposon, dans laquelle chaque mutant porte une étiquette codée à barres permettant de combiner les mutants individuels en un seul pool. Une copie de la bibliothèque est répliquée sur 3 84.Les plaques de culture contenant le milieu sont incubées à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours, jusqu'à ce que les colonies atteignent leur taille maximale. Ensuite, en travaillant dans un environnement de microbiologie avec une flamme et du matériel stérile, inonder chaque plaque avec cinq à 10 millilitres de milieu et laisser tremper pendant cinq minutes. Resuspendre les colonies à l'aide d'un répartiteur cellulaire, puis verser le liquide contenant les cellules dans un tube conique de centrifugation de 50 millilitres.Ajouter du DMSO à 7 %. Ajuster les cellules à une concentration finale d'OD 600 de 50 par millilitre avec un milieu contenant 7 % de DMSO, puis aliquoter des volumes de 40 microlitres dans des tubes en bande pour PCR ; les aliquotes de cellules regroupées peuvent être stockées indéfiniment à moins 80 degrés Celsius. Pour commencer cette procédure, décongeler les aliquotes de cellules regroupées sur de la glace, puis diluer immédiatement et délicatement le pool dans un milieu contenant un agent ou une condition choisis, en inoculant à une OD 600 de 0,0625 dans un volume total de 700 microlitres par puits dans une plaque de 48 puits. Aux fins de cette vidéo, des triplicats de deux conditions seront préparés.Inclure au moins un témoin solvant approprié sur la plaque. Sceller la plaque avec un film plastique, puis faire croître les cellules dans un spectrophotomètre ou un agitateur thermostaté à 30 degrés Celsius, en utilisant un régime d'agitation déterminé expérimentalement. Par exemple, agiter pendant 14 minutes, lire les puits pendant une minute, puis reprendre l'agitation.Une partie de la suspension cellulaire peut être récoltée par le robot et conservée sur une plaque de charbon située sur le plateau robotisé. Aux points temporels de génération définis par l'utilisateur, généralement après 5, 10, 15 et 20 générations de croissance, récoltez au moins deux unités d'absorbance à 600 nm de cellules pour chaque échantillon et chaque point temporel.Transférez les échantillons cellulaires récoltés dans des tubes de microcentrifugeuse à verrouillage de sécurité. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées pour l'extraction d'ADN génomique, dont la procédure sera présentée ci-après. ADN génomique purifié à partir de cellules récoltées à différents points temporels à l'aide d'un kit yeast star.Suivant les instructions du fabricant avec une modification, éluer l'ADN avec 300 microlitres de TE 0,1 X. Ensuite, préparer deux réactions PCR pour chaque échantillon : une pour les marqueurs UPT et une pour les marqueurs down.Analyser les produits de PCR obtenus sur un gel. Un produit de 60 paires de bases est attendu pour les deux PCR, utilisé pour l'hybridation comme indiqué dans les bandes une et trois. Dans cet exemple, un produit de 130 paires de bases est attendu pour les amplicons destinés au séquençage des codes-barres, comme illustré dans les bandes cinq et sept.À ce stade, les produits de PCR peuvent être utilisés soit pour une analyse par puces à ADN, soit pour un séquençage direct des codes-barres, selon le produit de PCR obtenu. Pour préparer l'analyse par puces à ADN, préchauffer le four d'hybridation à 42 degrés Celsius et préparer un bain d'eau bouillante ainsi qu'un seau à glace contenant un mélange glace-eau. Humidifier préalablement les puces en les remplissant lentement avec 120 microlitres d'hybridisation tampon à une concentration de un x.Incuber les puces dans le tampon d'hybridation à 42 degrés Celsius et 20 tr/min pendant 10 minutes ; pendant l'incubation des puces, préparer des tubes de 0,5 millilitre à bouchon vissé contenant chacun 120 microlitres de tampon d'hybridation par échantillon, plus un tube supplémentaire en guise de réserve. Ajouter 30 microlitres de PCR de séquence d'entrée et 30 microlitres de PCR de séquence de sortie au mélange d'hybridation, pour un volume total de 150 microlitres.Faire bouillir pendant deux minutes et placer dans de l'eau glacée pendant au moins deux minutes. Faire tourner brièvement les tubes avant utilisation. Retirer le tampon de pré-hybridation des puces et ajouter 120 microlitres de mélange d'hybridation PCR pour éviter l'évaporation.Couvrez les joints du réseau avec un point dur, hybriderez pendant 16 heures à 42 degrés Celsius et à 20 tr/min. Retirez les réseaux du four d'hybridation et ôtez les points durs des puces. Retirez lentement le mélange d'hybridation des réseaux à l’aide d’une pipette et remplissez les réseaux.Avec 120 microlitres de lavage A, chargez les puces dans le laveur de la station fluidique amorcée. Les puces seront lavées selon le protocole gene Flex SV 3 4 50 avec les modifications suivantes : une étape supplémentaire de lavage avec le lavage A avant la coloration.Laver B, à une température de 42 degrés Celsius au lieu de 40 degrés Celsius, et colorer à 42 degrés Celsius sur la station fluidique au lieu de 25 degrés Celsius. Après les opérations fluidiques, faire fonctionner la station fluidique, arrêter le protocole quatre 50. Décharger le laveur après s'être assuré qu'aucune bulle d'air n'est présente.Placez les puces dans le scanner et effectuez la numérisation à une longueur d'onde d'émission de 560 nanomètres. Le produit PCR de 130 paires de bases est utilisé pour le séquençage de codes-barres de nouvelle génération afin de séparer au préalable 12 échantillons d'ADN sur un gel PAGE à 12 %. Ensuite, révélez le gel avec du cyber green et excisez la bande de gel d'intérêt.L'ADN extrait du gel est ensuite quantifié par PCR en temps réel afin de générer des clusters sur une cellule d'écoulement à lecture unique à l'aide du CBOT et du kit de génération de clusters à lecture unique. Charger la cellule d'écoulement dans le séquenceur et observer la première base libérée. Le séquenceur illustré ici est un exemple représentatif. Les données recueillies à certains points du protocole.Le pool de mutants marqués a été cultivé pendant 20 générations en présence de l'agent antifongique clotrimazole et en présence de DMSO comme témoin ; le rapport logarithmique en base deux a été calculé et tracé pour chaque gène. Toutes les souches qui sont significativement sensibles au traitement par le clotrimazole, avec un rapport logarithmique en base deux égal à deux, sont mises en évidence en rouge. Quatre souches sont illustrées dans cet exemple : NCP1, ERG2 et deux allèles indépendants de ERG11.La cible protéique connue du médicament antifongique clotrimazole doit être vérifiée quant à sa sensibilité dans des tests de croissance individuels en présence de la même concentration de médicament, pour les souches détectées comme sensibles lors d'un écran groupé. Ce graphique suivant présente les résultats d'une expérience de confirmation réalisée ici. Les quatre souches détectées lors de l'écran présentaient une croissance réduite par rapport à la souche parentale de type sauvage.BWP 17 indiqué en noir. Ces courbes de croissance individuelles mettent en évidence une caractéristique importante de ces criblages génétiques pharmacologiques groupés, à savoir que le rang absolu d'une souche particulière ne reflète pas nécessairement son niveau exact de sensibilité. En outre, les résultats illustrent l'intérêt de disposer de plusieurs allèles pour chaque gène.Dans ce cas, les deux mutants présentant une disruption d'ERG 11 ont des sensibilités légèrement différentes au médicament. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq jours, de l'ensemencement de la culture jusqu'à l'analyse des données, à condition d'être effectuée correctement. Ainsi, bien que chaque expérience individuelle soit révélatrice sur le plan biologique, c'est véritablement lorsqu'un grand nombre d'expériences ont été réalisées et qu'une base de données a été constituée que l'on parvient à prédire la fonction des gènes et l'action des médicaments.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des collections de mutants marqués par des codes-barres à l'échelle du génome en vue de criblages en pool, ainsi que comment utiliser la microréalisation ou le séquençage pour identifier les gènes d'intérêt après son développement. Cette technique a permis aux chercheurs du domaine de la génomique fonctionnelle d'explorer la fonction de chacun des 6 000 gènes différents du génome de la levure.

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