Simple Drosophile Dissection ommatidie et imagerie
19 août 2011
Le facteur limitant dans l'utilisation de l'adulte Drosophile pour étudier la neurodégénérescence et de biologie cellulaire est l'imagerie difficile de processus intracellulaires. Nous décrivons la dissection des ommatidies simple pour générer un bona fide culture primaire de cellules neuronales, qui peut être soumis à un traitement médicamenteux et d'imagerie de pointe.
L'objectif général de cette procédure est de disséquer et d'imaginer un individu unique de drosophile ou de matia afin d'étudier les événements intracellulaires dans des modèles de neurodégénérescence. Cela est réalisé en fixant d'abord la tête de la mouche au reste du corps et en l'ouvrant par incision.
Ensuite, le cerveau et les autres tissus sont retirés de l'intérieur de la tête. La cuticule est alors enlevée et chaque rétine est coupée en deux. La dernière étape de la procédure consiste à extraire l'O à l'aide d'une aiguille en tungstène et à les déposer sur une lame.
En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des organites autophagiques cytoplasmiques par microscopie confocale en fluorescence. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une analyse biologique cellulaire à haute résolution dans des modèles de drosophile pour la neurodégénérescence, domaine dans lequel on ne pouvait jusqu'à présent obtenir que des informations génétiques, ce qui démontre que la procédure sera variable. Un étudiant diplômé de mon laboratoire, avec l'aide de Daniel Mackay, technicien en histologie et microscopie au centre.
Pour commencer, remplir un puits d'une lame en verre à trois puits avec du tampon salin phosphate, puis anesthésier les mouches au dioxyde de carbone. Une fois les mouches anesthésiées, prendre une mouche unique à l’aide de pinces et la déposer dans la petite coupelle contenant du PBS. Sous un microscope stéréo, pincer le proboscis avec les pinces, puis détacher la tête du corps en sectionnant le cou.
À l’aide d’une deuxième paire de forceps tenant la tête de la mouche par le proboscis, couper la tête en deux dans le sens de la ligne médiane rostrale latérale à l’aide de ciseaux microchirurgicaux. Pour mettre le cerveau en évidence, utiliser une pointe de pipette coupée pour prélever la tête avec la rétine et la transférer dans un autre puits rempli de milieu de Schneider. Retirer la majeure partie de la cuticule de la tête à l’aide de forceps, puis extraire le cerveau.
Gardez la rétine en sandwich entre la lamina et la cornée. Ensuite, transférez la rétine dans une goutte de 50 microlitres de milieu Schneider frais. Placée directement sur une lame de verre, saisissez l'extrémité la plus dorsale ou ventrale de la rétine avec une pince en utilisant des ciseaux microchirurgicaux.
Coupez la rétine en deux le long de la ligne médiane dorso-ventrale afin d'exposer l'AMIA au centre de l'œil. Continuez à tenir la rétine de manière à ce que la cornée soit orientée vers le bas et la lamina vers le haut. À l'aide d'une fine aiguille en tungstène, détachez d'abord l'oia de la lamina, puis de la cornée.
Une oia unique et des groupes d'OIA s'accumuleront au fond de la cavité ou de la lame. Éliminez tout résidu plus gros qui pourrait s'être accumulé avant de poursuivre. Pour analyser l'autophagie, diluez le traceur Lito à un pour 1000 dans une goutte de milieu Schneider, mélangez et attendez 10 secondes.
Retirez le liquide excédentaire de la lame en veillant à laisser l'AMIA en place. Ajoutez une goutte de Vector Shield pour recouvrir l'AMIA.
En utilisant la microscopie confocale, après avoir posé une lame de couverture et l’avoir scellée avec du vernis à ongles, on peut visualiser à la fois les phagosomes marqués par la protéine fluorescente g fp a TG huit et les lysosomes marqués par le colorant lyo Tracker dans un tedium isolé d’une drosophile exprimant une forme mutante de l’atropine. Le panneau de microscopie en champ clair en haut à droite montre la structure quasi intacte du tedium, et le cadre indique la zone scannée. Ici, le rouge marque les lysosomes et le vert marque l’autophagosome.
Les autolysosomes, qui résultent de la fusion des deux organites, apparaissent en jaune. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la culture de matériel et l'administration de médicaments peuvent être réalisées afin de répondre à différentes questions, par exemple les composés efficaces sur les marqueurs de l'autophagie dans les cellules neuronales de différents fonds génétiques.
Combiner les avantages de la génétique de drosophile avec certaines analyses biologiques cellulaires avancées possibles en culture cellulaire.
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Aperçu
Cet article décrit une procédure permettant de disséquer et d'imaginer des ommatidies individuelles de Drosophila afin d'étudier les événements intracellulaires dans des modèles de neurodégénérescence. La méthode permet la génération de cultures primaires de cellules neuronales qui peuvent être soumises à un traitement médicamenteux et à des techniques d'imagerie avancées.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Neurodégénérescence
Contexte
- L'imagerie des processus intracellulaires chez les adultes de Drosophila est difficile.
- La dissection de l'ommatidie unique fournit une solution pour l'étude des mécanismes cellulaires.
- Les cultures primaires de neurones permettent le traitement par des médicaments et l'imagerie avancée.
- Cette approche améliore la compréhension de la neurodégénérescence.
Objectif de l'étude
- Disséquer les ommatidies de Drosophila pour l'analyse cellulaire.
- Faciliter l'imagerie des événements intracellulaires.
- Créer une plateforme pour les études de traitement par médicaments.
Méthodes utilisées
- Fixer la tête de la mouche et l'ouvrir.
- Retirer le cerveau et les autres tissus internes.
- Couper la rétine en deux après avoir enlevé la cuticule.
- Extraire les ommatidies à l'aide d'une aiguille en tungstène et les déposer sur une lame.
Résultats principaux
- Disséction réussie d'ommatidies individuelles.
- Création de cultures primaires authentiques de cellules neuronales.
- Capacité à effectuer des traitements pharmacologiques sur des cellules en culture.
- Techniques d'imagerie avancées appliquées à l'étude des processus intracellulaires.
Conclusions
- La méthode fournit un outil précieux pour l'étude de la neurodégénérescence.
- La dissection d'ommatidies individuelles améliore les capacités d'imagerie cellulaire.
- Cette approche peut conduire à de nouvelles découvertes en neurobiologie.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La dissection et l'imagerie d'un ommatidium unique chez Drosophila permettent une analyse à haute résolution d'événements intracellulaires liés à la neurodégénérescence, en surmontant les limites de l'autofluorescence de l'œil entier. Cette technique soutient la détection mécanistique des risques et la validation des cibles en découverte précoce en permettant la visualisation directe des processus autophagiques et des réponses aux médicaments dans des cellules neuronales génétiquement définies. Son adaptabilité à l'imagerie vivante et à l'administration de composés en fait une plateforme réutilisable pour les chaînes de recherche sur la neurodégénérescence.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une interrogation directe de l'autophagie et du trafic intracellulaire dans des cellules neuronales pertinentes pour la maladie.
- Permet une validation fonctionnelle de cibles en visualisant les réponses subcellulaires à des perturbations génétiques ou pharmacologiques.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en distinguant les effets cellulaires autonomes dans des contextes génétiques mosaïques.
Développement de criblage et de tests
- Offre un système ex vivo validé pour l'imagerie quantitative des marqueurs autophagiques et lysosomaux.
- Permet la préparation reproductible d'échantillons unicellulaires pour des tests normalisés de composés.
- Prend en charge l'extensibilité des tests et la réutilisation de la plateforme pour le criblage d'agents modifiant la neurodégénérescence.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les voies pertinentes pour la maladie en modélisant un dysfonctionnement autophagique dans un système génétiquement modifiable.
- Permet une continuité allant de la découverte génétique à l'évaluation préclinique de composés dans des cellules neuronales.
- Facilite un développement adapté au risque en fournissant des lectures cellulaires prédictives pour les cibles de neurodégénérescence.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode fait le lien entre la découverte précoce et la recherche préclinique en permettant des tests fondés sur des hypothèses concernant les mécanismes intracellulaires et les effets des composés dans un contexte neuronal génétiquement défini.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur les voies d'autophagie et de dégénérescence neurodégénérative dans des ommatidies individuelles.
- Écrantage : Fournit des données d'imagerie quantitatives et reproductibles pour l'évaluation de composés.
- Analyse : Propose des mesures fondées sur la microscopie confocale des autophagosomes, des lysosomes et de leurs produits de fusion.
- Recherche translationnelle : Facilite la corrélation entre les phénotypes cellulaires et les modèles de maladies, ainsi que le développement de biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme modulaire adaptable à divers fonds génétiques et bibliothèques de composés.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles et les études mécanistiques de la dégénérescence neuronale.
- Valeur opérationnelle : Normalise les protocoles d'analyse et d'imagerie à l'échelle de la cellule unique afin d'assurer leur reproductibilité et leur évolutivité.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon en fournissant des preuves cellulaires directes de l'interaction avec la cible et de l'efficacité du composé.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles de dégénérescence neuronale et des candidats thérapeutiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en dissection de Drosophila et en techniques d'imagerie confocale.
- Suppose l'accès à une microscopie à fluorescence et à une infrastructure de culture cellulaire.
- Exige une standardisation interéquipes pour les protocoles de préparation des échantillons et d'imagerie.
- Adaptable à divers fonds génétiques grâce aux techniques d'analyse en mosaïque.
- Limité à l'analyse ex vivo ; une validation in vivo peut être nécessaire pour assurer une continuité translationnelle.
