Multi-photon imagerie de l'invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Un aperçu complet des techniques impliquées dans la génération d'un modèle murin de cancer de la bouche et le suivi quantitatif de l'invasion tumorale au sein de la langue grâce à la microscopie multi-photons de cellules marquées est présenté. Ce système peut servir de plate-forme utile pour l'évaluation de l'efficacité des médicaments moléculaires et des composés anti-invasive.

L’objectif global de cette procédure est de produire un modèle murin de cancer de la bouche qui permet la visualisation et la quantification de l’invasion tumorale dans la langue. Ceci est accompli en générant d’abord des cellules de carcinome épidermoïde oral pour l’imagerie à deux photons par infection lentivirale de la cerise d’acte M de la vie et sélection clonale stable. Ensuite, des tumeurs orthotopiques par xénogreffe sont produites chez des souris nues par injection de cellules de cerise marquées à la vie Act M dans la langue de souris anesthésiées.

Ensuite, les langues contenant des tumeurs sont imagées par microscopie à deux photons. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent une invasion tumorale buccale locale quantifiée dans le muscle de la langue grâce à l’imagerie à deux photons du tissu frais de la langue et à la reconstruction tridimensionnelle ultérieure assistée par ordinateur des tumeurs primaires et des groupes cellulaires envahis régionalement. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’immunohistochimie ou l’imagerie bioluminescente est que l’invasion des cellules tumorales peut être mesurée quantitativement en trois dimensions.

Les implications de cette technique s’étendent à l’intervention thérapeutique contre le cancer de la bouche car elle fournit un système modèle pour l’analyse des protéines impliquées dans l’invasion tumorale, ainsi que l’évaluation de composés précliniques sur des stratégies thérapeutiques anti-invasives. En général, les personnes novices dans cette technique auront du mal car l’injection des cellules tumorales dans la langue et la préparation de la langue pour deux photomicroscopies sont techniquement exigeantes, nécessitant des compétences et de la pratique. La visualisation de cette méthode est essentielle car l’injection de la tumeur en deux étapes photoniques est difficile à apprendre et nécessite des compétences spécialisées pour commencer la culture.

Lignées cellulaires tumorales humaines de la tête et du cou dans un milieu complet composé de DMEM complété par 10 % de FBS, 1 % de pénicilline streptomycine et 1 % d’acides aminés non essentiels. Afin de transférer la séquence d’enrobage de cerise LIFE Act M dans le site du vecteur lentiviral PLL 7.0, la mutagenèse dirigée doit d’abord introduire trois mutations silencieuses dans le SBF : un site de reconnaissance dans le mCherry CD NA parent. Ensuite, la PCR amplifie la séquence mCherry de l’acte de vie modifié avec ECO R flanquante, un SBF, un sites et sous-jacente à la PLL 7.0. Pour générer une construction de cerise PLL 7.0 LIFE Act M à la suite d’une culture de système d’expression lentivirale, la lignée cellulaire d’emballage 2 9 3 T 17 à 40 % de confluence dans un milieu complet.

À l’aide de Cal Foss, transfectez les cellules avec les vecteurs PLL 7.0, LIFE, Act, M, cherry, PS, PACS, deux et P-V-S-V-G dans un rapport de trois à deux pour un, respectivement. Après 24 heures, remplacez le milieu par un milieu frais et complet, collectez et remplissez le milieu toutes les 12 heures pendant 72 heures, et stockez le milieu collecté à quatre degrés Celsius pour produire des lignées cellulaires de la tête et du cou avec une expression de cerise stable de l’acte M. Faites tourner le milieu collecté à 2000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, ajoutez un millilitre du milieu clarifié contenant le virus à l’OSC 19 ou à l’US CCC une cellule pendant 12 heures.

Rincez les cellules, puis ajoutez un millilitre supplémentaire de virus pendant une autre période de 12 heures. Cultivez les cellules dans un milieu contenant 200 milligrammes par millilitre de mycine pure pendant deux semaines Pour sélectionner des colonies résistantes, en examinant visuellement les colonies survivantes pour la vie. Agir sur l’expression de la cerise par microscopie à fluorescence trypsine yeux, colonies individuelles positives à l’aide de disques de clonage stériles de trois millimètres.

Maintenez les cellules positives dans un milieu contenant 200 milligrammes par millilitre de mycine pure jusqu’à ce qu’elles soient congelées, ou utilisées pour l’injection orthotopique pour générer une tumeur orthotopique xénogreffe de trypsine vie Act. M cerise exprimant les cellules tumorales centrifuge ensuite la culture et remettre en suspension environ 2,5 fois 10 à la quatrième cellules dans 50 microlitres de milieu complet. Chargez les cellules tumorales dans une seringue d’un millilitre attachée à une aiguille d’un demi-pouce de calibre 27.

Anesthésie suivante, renard athymique femelle de huit semaines. Une souris nude avec une combinaison de 80 milligrammes par kilogramme de kétamine et de 10 milligrammes par kilogramme de xylazine. Une fois que l’animal cesse de bouger, appliquez une pommade lubrifiante pour les yeux et vérifiez la réactivité en enfonçant un ongle dans le coussinet plantaire.

Maintenez les souris sur un coussin chauffant entre 37 et 40 degrés Celsius. À l’aide d’une pince stérile, saisissez doucement le bout de la langue et retirez-la de la cavité buccale. Injectez lentement les cellules dans un côté de chaque langue pour créer une masse bulbeuse au centre de la langue.

Injectez aux souris 2,1 milligrammes par kilogramme de yohi et renvoyez-les dans le coussin chauffant pour les surveiller pendant la récupération de l’anesthésie. Placez les souris dans des cages stériles contenant une pâte transgénique molle. Pesez les souris tous les deux à trois jours et surveillez-les visuellement pour détecter l’apparition d’une tumeur.

Pour préparer les langues de souris à l’imagerie ex vivo, euthanasiez des souris porteuses de tumeurs à différents moments. En utilisant l’inhalation de dioxyde de carbone, extrayez les langues et rincez-les avec un XPBS. Ensuite, à l’aide d’un fil à coudre monofilament d’un magasin de bricolage local et d’une aiguille à coudre de taille huit.

Fixez la languette d’un côté d’une cassette d’enrobage de tissu de paraffine conventionnelle. Une fois la languette immobilisée, immergez l’ensemble de la cassette dans un XPBS. Traitez immédiatement les langues à l’aide de la microscopie à deux photons pour imager les langues à l’aide de la microscopie à deux photons.

Immergez les cassettes de languette dans une parabole de 60 millimètres contenant un XPBS. Fixez la parabole dans un support de conception personnalisée sur un bras cantilever rétractable positionné sous l’objectif du microscope à deux photons. Placez une lentille d’objectif à immersion dans l’eau à ouverture numérique de 40 x 0,8 directement sur ou au-dessus d’une lésion tumorale visible.

Imagez la langue par microscopie à deux photons avec le laser saphir en titane d’une intensité de 60 milliwatts et d’une longueur d’onde d’entrée de 755 nanomètres. Pour optimiser le signal Mcherry, collectez des images de balayage laser d’un micromètre à des profondeurs incrémentielles d’un micromètre sur une profondeur totale de tissu comprise entre 15 et 100 micromètres. Avec cette configuration, des tumeurs jusqu’à un millimètre de profondeur tissulaire peuvent être analysées.

Utilisez l’image numérisée pour capturer des images. L’image numérisée génère une sortie à deux canaux de motifs de balayage matriciel pour contrôler les miroirs de balayage métrique XY galvan et capture en même temps un signal d’entrée maximal de quatre canaux simultanément à partir de tubes photomultiplicateurs à travers une carte d’acquisition de données. L’image numérisée collecte les images de la pile Z en contrôlant l’axe Z de l’objectif et collecte les images en accéléré en mode unique ou cyclique.

Enregistrez les images dans un seul fichier TIF avec une profondeur de 16 bits. À l’aide du logiciel Amira, rendez les piles d’images tumorales en une seule image tridimensionnelle en ouvrant le fichier TIF contenant l’ensemble des images de la pile Z. Utilisez la fonction TEX pour générer un rendu tridimensionnel.

Une grande image de tumeur primaire avec plusieurs petits groupes invasifs dissociés ou igs sera probablement présente dans l’image rendue. Pour mesurer le volume tumoral, définissez le seuil de la zone tumorale primaire et chaque tranche de la pile d’images corrige et élimine la fluorescence de fond. Répétez la procédure de seuillage pour chaque groupe invasif.

Une fois que la tumeur primitive et tous les igs sont sélectionnés, déterminez la mesure du volume ainsi que les coordonnées OID de la tumeur X, Y et Z pour la tumeur primaire. Afin de calculer les distances des igs par rapport au point tumoral central, calculez l’indice invasif de la tumeur ou ti en utilisant le ti est égal à N NT fois VT fois dt. Où NT est égal au nombre total d’igs dans l’image, VT est égal au volume total de toutes les igs et DT est égal à la distance totale parcourue par tous les groupes invasifs à partir du centre de la tumeur primaire.

Des rendus tridimensionnels avec plus de détails topographiques peuvent être générés en important les fichiers d’embouts monochromes 16 bits originaux dans les éléments NIS de Nikon dans le logiciel. Créez un fichier ND à partir d’une pile d’images. Ensuite, calibrez manuellement le document pour spécifier la taille des pixels pour des rendus de meilleure qualité.

Ajoutez des tranches supplémentaires dans le plan Z. Cette figure montre un exemple de données brutes acquises à partir d’une image à deux photons, d’éléments NIS ou d’un miroir. Un logiciel peut être utilisé pour reconstruire les données brutes des tumeurs de la langue, comme le montre cette figure.

Ce panneau montre un exemple de rendu tridimensionnel à l’aide de la fonction TEX dans le logiciel Amira. Voici un exemple de seuillage d’une section individuelle à deux photons de la pile d’images pour identifier les groupes invasifs de la tumeur primaire ainsi que du centre de la tumeur primaire ou OID. Après l’analyse de chaque section de seuil, Amira quantifie le volume et la distance parcourus par chaque groupe invasif à partir du Centro.

Ces données peuvent être démontrées graphiquement et utilisées pour obtenir la valeur numérique du niveau complet d’invasion des cellules tumorales. Des images représentatives des tumeurs visualisées par le marquage immunohistochimique pathologique conventionnel sont attribuables au site primaire montré ici par rapport à une image tridimensionnelle d’une tumeur similaire à l’aide du protocole décrit. Une fois maîtrisée du point d’extraction de la langue au rendu 3D final, cette technique peut être réalisée en environ deux heures si elle est correctement exécutée lors de cette procédure. veillez à ne pas percer la langue avec l’aiguille, perdant ainsi des cellules tumorales et entravant la prise de la tumeur Suite à cette procédure. Des tests de composés thérapeutiques ou de cellules avec des niveaux de protéines manipulés peuvent être effectués afin de déterminer leur efficacité sur l’invasion du cancer de la bouche.

Dans un environnement in vivo, n’oubliez pas que travailler avec des cellules tumorales humaines modifiées avec du lentivirus est dangereux, des précautions telles que l’EPI approprié et le travail dans une hotte à flux laminaire certifiée BSL deux doivent toujours être prises lors du travail avec des souris injectées.