Multi-photon imagerie de l'invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

L'objectif général de cette procédure est de produire un modèle murin de cancer buccal permettant la visualisation et la quantification de l'envahissement tumoral dans la langue. Cela est réalisé en premier lieu en générant des cellules de carcinome épidermoïde buccal destinées à l'imagerie à deux photons, par infection lentivirale avec LifeAct-mCherry et sélection clonale stable. Ensuite, des tumeurs xénogreffées orthotopiques sont produites chez des souris nues par injection de cellules marquées avec LifeAct-mCherry dans la langue de souris anesthésiées.

Ensuite, les langues contenant des tumeurs sont observées par microscopie à deux photons. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus, montrant une invasion tumorale orale locale quantifiée au sein du muscle de la langue grâce à l'imagerie à deux photons de tissus linguaux frais et à la reconstruction tridimensionnelle assistée par ordinateur des tumeurs primitives et des groupes cellulaires envahis de manière régionale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'immunohistochimie ou l'imagerie bioluminescente réside dans la possibilité de mesurer quantitativement l'invasion des cellules tumorales en trois dimensions.

Les implications de cette technique s'étendent à l'intervention thérapeutique dans le cancer buccal, car elle fournit un système modèle pour l'analyse des protéines impliquées dans l'invasion tumorale, ainsi que pour l'évaluation de composés précliniques dans des stratégies thérapeutiques anti-invasives. En général, les personnes novices dans cette technique éprouveront des difficultés, car l'injection des cellules tumorales dans la langue et la préparation de la langue pour la microscopie à deux photons sont des procédures techniques exigeantes, nécessitant habileté et pratique. La visualisation de cette méthode est essentielle, car l'injection tumorale dans les étapes de la microscopie à deux photons est difficile à apprendre et requiert des compétences spécialisées pour commencer la culture.

Lignées cellulaires de tumeurs humaines de la tête et du cou en milieu complet composé de DMEM supplémenté avec 10 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine et 1 % d'acides aminés non essentiels. Afin de transférer la séquence codant pour LIFE Act M cherry dans le vecteur lentiviral PLL 7.0, une mutagenèse dirigée par site est d'abord nécessaire pour introduire trois mutations silencieuses dans le site de reconnaissance SBF un du cDNA mCherry parent. Ensuite, amplifier par PCR la séquence Life Act mCherry modifiée flanquée des sites ECO R un et SBF un, puis la sous-cloner dans le PLL 7.0. Pour générer un construct PLL 7.0 LIFE Act M cherry selon un système d'expression lentiviral, cultiver la lignée cellulaire d'emballage 2 9 3 T à une confluence de 17 à 40 % en milieu complet.

À l'aide de Cal Foss, transfectez les cellules avec les vecteurs PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS deux et P-V-S-V-G selon un rapport respectif de trois pour deux pour un. Après 24 heures, remplacez le milieu par du milieu complet frais, collectez-le et renouvelez-le toutes les 12 heures pendant 72 heures, puis stockez le milieu recueilli à quatre degrés Celsius afin d'obtenir des lignées cellulaires de tête et de cou exprimant de façon stable LIFE Act M cherry. Faites centrifuger le milieu recueilli à 2000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, puis ajoutez un millilitre du milieu clarifié contenant le virus aux cellules OSC 19 ou US CCC une pendant 12 heures.

Rincez les cellules, puis ajoutez un millilitre supplémentaire de virus pendant une autre période de 12 heures. Incubez les cellules dans un milieu contenant 200 milligrammes par millilitre de puréomycine pendant deux semaines afin de sélectionner les colonies résistantes. Examinez visuellement les colonies survivantes pour détecter leur viabilité. Analysez l'expression de mCherry par microscopie de fluorescence, puis détachez enzymatiquement à la trypsine les colonies positives individuelles à l’aide de disques de clonage stériles de trois millimètres.

Conserver les cellules positives dans un milieu contenant 200 milligrammes par millilitre de purogénine jusqu'à leur congélation ou leur utilisation pour une injection orthotopique afin de générer un xénogreffe tumorale orthotopique trypsine Life Act. M cerise exprimant des cellules tumorales, puis centrifuger la culture et resuspendre environ 2,5 × 10⁴ cellules dans 50 microlitres de milieu complet. Charger les cellules tumorales dans une seringue de 1 millilitre fixée à une aiguille de 27 gauge, demi-pouce.

Ensuite, anesthésiez une souris femelle athymique nue âgée de huit semaines à l’aide d’une combinaison de 80 milligrammes par kilogramme de kétamine et de 10 milligrammes par kilogramme de xylazine. Une fois que l’animal cesse de bouger, appliquez une pommade lubrifiante sur les yeux et vérifiez l’absence de réactivité en appuyant sur l’ongle du pied dans la plante du pied.

Conserver les souris sur un plateau chauffant entre 37 et 40 degrés Celsius. À l’aide de pinces stériles, saisir délicatement l’extrémité de la langue et la tirer hors de la cavité buccale. Injecter lentement les cellules dans un côté de chaque langue afin de former une masse bulbiforme au centre de la langue.

Injecter les souris avec 2,1 milligrammes par kilogramme de yohimbine et les replacer sur le coussin chauffant pour surveiller leur réveil de l'anesthésie. Placer les souris dans des cages stériles contenant un régime alimentaire mou à base de pâte transgénique. Peser les souris tous les deux à trois jours et les surveiller visuellement pour détecter l'apparition de tumeurs.

Pour préparer les langues de souris pour l'imagerie ex vivo, euthanasier les souris porteuses de tumeurs à différents moments. À l'aide d'une inhalation de dioxyde de carbone, extraire les langues et les rincer avec un XPBS. Puis, à l'aide d'un fil de couture monofilament provenant d'un magasin de loisirs créatifs local et d'une aiguille à coudre de taille huit.

Attacher la langue à un côté d'une cassette d'inclusion tissulaire conventionnelle en paraffine. Une fois la langue immobilisée, plonger l'ensemble de la cassette dans un XPBS. Traiter immédiatement les langues par microscopie à deux photons pour imaginer les langues en utilisant la microscopie à deux photons.

Immergez les cassettes contenant la langue dans une boîte de 60 millimètres contenant un XPBS. Fixez la boîte dans un support sur mesure monté sur un bras en porte-à-faux rétractable positionné sous l'objectif du microscope à deux photons. Placez un objectif à immersion dans l'eau de 40 x 0,8 d'ouverture numérique directement sur ou au-dessus d'une lésion tumorale visible.

Imager la langue par microscopie à deux photons à l’aide d’un laser au titane-saphir avec une intensité de 60 milliwatts et une longueur d’onde d’entrée de 755 nanomètres. Pour optimiser le signal M cherry, acquérir des images sérielles de balayage laser d’un micromètre d’épaisseur à des profondeurs incrémentielles d’un micromètre sur une profondeur tissulaire totale comprise entre 15 et 100 micromètres. Avec cette configuration, les tumeurs jusqu’à un millimètre de profondeur tissulaire peuvent être analysées.

Utilisez ScanImage pour capturer des images. ScanImage génère une sortie à deux canaux de motifs de balayage raster pour commander les miroirs galvanométriques de balayage XY et, simultanément, acquiert jusqu'à quatre signaux d'entrée provenant de photomultiplicateurs via une carte d'acquisition de données. ScanImage collecte des images en pile Z en contrôlant l'axe Z de l'objectif et enregistre des images en laps de temps en mode simple ou cyclique.

Enregistrez les images dans un fichier TIF unique avec une profondeur de 16 bits. À l'aide du logiciel Amira, rendez les séries d'images de tumeur en une seule image tridimensionnelle en ouvrant le fichier TIF contenant l'ensemble des images en pile Z. Utilisez la fonction TEX pour générer une restitution tridimensionnelle.

Une grande image de tumeur primaire avec plusieurs petits groupes envahissants dissociés, ou GE, sera probablement présente dans l'image rendue. Pour mesurer le volume tumoral, définissez le seuil de la zone de la tumeur primaire et chaque coupe de la pile d'images afin de corriger et d'éliminer la fluorescence de fond. Répétez la procédure de seuil pour chaque groupe envahissant.

Une fois la tumeur primaire et tous les GII sélectionnés, déterminez la mesure du volume ainsi que les coordonnées OID X, Y et Z de la tumeur primaire. Afin de calculer les distances des GII par rapport au point central de la tumeur, calculez l'indice d'invasion tumorale ou IT en utilisant la formule suivante : IT = N × NT × VT × dt, où NT correspond au nombre total de GII sur l'image, VT au volume total de tous les GII et DT à la distance totale parcourue par tous les groupes invasifs depuis le centre de la tumeur primaire.

Des rendus tridimensionnels avec un détail topographique plus élevé peuvent être générés en important les fichiers d'origine en nuances de gris de 16 bits dans Nikon NIS Elements à l'aide du logiciel. Créez un fichier ND à partir d'une pile d'images. Étalonner ensuite manuellement le document pour spécifier la taille des pixels afin d'obtenir des rendus de meilleure qualité.

Ajoutez des tranches supplémentaires dans le plan Z. Cette figure montre un exemple des données brutes acquises à partir d'une image à deux photons NIS elements ou d'un miroir. Un logiciel peut être utilisé pour reconstruire les données brutes des tumeurs de la langue, ce qui est illustré sur cette figure.

Ce panneau montre un exemple de rendu tridimensionnel utilisant la fonction TEX dans le logiciel Amira. Voici un exemple de seuillage d'une section individuelle à deux photons provenant de la pile d'images, permettant d'identifier les groupes invasifs issus de la tumeur primaire ainsi que le centre ou l'oid de la tumeur primaire. Après analyse de chaque section seuillée, Amira quantifie le volume et la distance parcourue par chaque groupe invasif depuis le Centro.

Ces données peuvent être représentées graphiquement et utilisées pour obtenir la valeur numérique du degré complet d'envahissement des cellules tumorales. Des images attribuées au site primaire, présentées ici, illustrent des tumeurs telles qu'observées par immunohistochimie pathologique conventionnelle, comparées à une image tridimensionnelle d'une tumeur similaire obtenue selon le protocole décrit. Une fois maîtrisée, de l'extraction de la langue au rendu 3D final, cette technique peut être réalisée en environ deux heures. Lors de l'exécution de cette procédure, veillez à ne pas transpercer la langue avec l'aiguille, ce qui entraînerait une perte de cellules tumorales et compromettrait l'implantation tumorale. Après cette procédure, des tests de composés thérapeutiques ou de cellules dont les niveaux protéiques ont été modifiés peuvent être effectués afin d'évaluer leur efficacité sur l'envahissement cancéreux buccal.

Dans un contexte in vivo, n'oubliez pas que travailler avec des cellules tumorales humaines modifiées par un lentivirus présente des risques ; des précautions telles que le port d'équipements de protection individuelle appropriés et l'utilisation d'une hotte à flux laminaire certifiée BSL-2 doivent toujours être prises lors de manipulations avec des souris injectées.