Développement d'un type de cellule spécifique anti-VIH gp120 aptamères pour la livraison de siRNA

L'objectif général des expériences suivantes est de produire in vitro un ARN Aptima dirigé contre la protéine GP120 du VIH-1 à l'aide d'une membrane en nitrocellulose. Cette production est réalisée par PCR suivie d'une transcription in vitro par l'ARN polymérase T7. Pour préparer l'ADN initial et la bibliothèque aléatoire d'ARN, dans une deuxième étape, le mélange de la protéine cible et de la bibliothèque d'ARN est appliqué sur un filtre en nitrocellulose préhumidifié, ce qui permet d'isoler les molécules d'ARN liées des espèces d'ARN non liées.

Après 12 cycles de sélection, la bibliothèque d'ARN est clonée et séquencée afin d'identifier les candidats individuels d'aptamères ARN présents dans la bibliothèque. Les résultats obtenus permettent d'identifier plusieurs nouveaux aptamères ayant une affinité dans la gamme nanomolaire, selon les essais de migration sur gel et la microscopie confocale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les tests par lots ou les méthodes d'isolement basées sur colonne, réside dans sa simplicité et dans le fait qu'elle ne nécessite aucun prétraitement de la protéine ou des bibliothèques, comme l'immobilisation de la protéine sur la phase solide. La bibliothèque d'ARN destinée à l'isolement d'aptamères ARN anti-GP120 du VIH est préparée à partir d'une bibliothèque d'ADN synthétisée commercialement, contenant 50 nucléotides de séquences aléatoires.

La séquence de la bibliothèque d'oligonucléotides d'ADN simple brin compte 81 nucléotides de long. Comme indiqué sur ce schéma, la région aléatoire est encadrée par des régions constantes : un fragment de 30 nucléotides à l'extrémité cinq prime, et un fragment de 16 nucléotides MA à l'extrémité trois prime. Les régions constantes comprennent un promoteur T7 destiné à la transcription in vitro, ainsi qu'une séquence marqueur en trois prime pour la RT-PCR.

Amplifiez la bibliothèque aléatoire d'oligonucléotides d'ADN simple brin par PCR, en limitant la PCR à 10 cycles afin de préserver l'abondance de la bibliothèque d'ADN initiale. Après les réactions de PCR, le pool d'ADN double brin amplifié est récupéré à l'aide d'un kit de purification sur gel. L'ADN double brin est ensuite converti en une bibliothèque d'ARN à l'aide du kit cript, conformément aux instructions du fabricant, en remplaçant dans le mélange de réaction de transcription le CTP et l'UTP par deux pyrimidines fluorées, respectivement le CTP à deux pyrimidines fluorées et l'UTP à deux pyrimidines fluorées, afin de produire un ARN résistant aux ribonucléases.

Lorsque les réactions de transcription sont terminées, digérez les réactions avec la DNase I afin d'éliminer l'ADN matrice et purifiez par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 8 % contenant de l'urée à sept molaire. Enfin, quantifiez la bibliothèque d'ARN purifiée par spectrophotométrie UV. Avant la sélection des optimas, préparez les tampons nécessaires et stockez-les aux températures appropriées.

Tampon de HEPES à température ambiante et tampons pour le repliement de l'ARN et la liaison ARN à moins 20 degrés Celsius. Avant de commencer le premier cycle de sélection, pré-incuber la population d'ARN aléatoire sur un filtre en nitrocellulose pré-humidifié à température ambiante pendant 30 minutes afin de minimiser la liaison non spécifique au filtre. Après 30 minutes, retirer le filtre en nitrocellulose.

Combiner le pool d'ARN aléatoire pré-épuré et la protéine HIV one bowel GP one 20 dans un tampon de liaison à l'ARN à faible concentration saline, puis incuber sur une plateforme rotative à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, faire passer la réaction à travers un filtre en nitrocellulose pré-humidifié et laver avec un millilitre de tampon de liaison à l'ARN à faible concentration saline afin d'éluer l'ARN lié du filtre. Retirer la membrane en nitrocellulose du porte-filtre.

Ajoutez 200 microlitres de tampon d'élution à la membrane et chauffez à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Une fois l'ARN élué du filtre, centrifugez brièvement le tube, transférez la solution d'ARN dans un nouveau tube, puis effectuez une extraction au phénol-chloroforme sur l'éluat. Utilisez une colonne MicroCon YM 30 pour concentrer l'ARN et éluez l'ARN récupéré avec 20 microlitres d'eau exempte de RNases.

La population d'ARN récupérée est ensuite rétrotranscrite et amplifiée pendant 15 cycles de PCR. Après purification de la population d'ADN double brin amplifié, elle est transcrit en une nouvelle population d'ARN comme indiqué précédemment, avant le prochain tour de sélection. Replier la population d'ARN dans un tampon HBS à une concentration unité en chauffant à 95 degrés Celsius pendant trois minutes, puis laisser refroidir lentement jusqu'à 37 degrés Celsius.

Poursuivre l'incubation à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Adsorber l'ARN replié et transférer sur un filtre en nitrocellulose pendant 30 minutes avant l'incubation avec la protéine cible HIV bowel GP120 pour le prochain tour de sélection. Afin d'obtenir avec succès les aptamères ayant une affinité de liaison plus élevée, la sévérité de la sélection doit être soigneusement contrôlée en ajustant les conditions de sélection.

Les conditions de sélection sont indiquées dans ce tableau. Pour les tours de cellex un à quatre, incuber le pool d'ARN pré-clarifié avec la protéine cible dans un tampon de liaison à faible concentration saline pendant 30 minutes. Après le quatrième tour de cellex, utiliser un tampon de liaison à forte concentration saline à mesure que le cellex progresse.

Réduire la quantité de protéine GP120 et augmenter l'ARNt compétiteur de levure afin d'augmenter la sélectivité de la sélection d'aptamères à chaque cycle. L'évolution de la sélection optimale de GP120 du VIH-1 est surveillée par un test de liaison sur filtre. Dans cette vidéo, les 12 pools d'ARN collectés après tous les cycles de sélection seront analysés.

Tout d'abord, éliminez le triphosphate en position cinq prime en traitant chaque pool d'ARN avec la phosphatase intestinale de veau pendant une heure à 37 degrés Celsius. Pour préparer l'ARN traité par la CIP en vue de son marquage à l'aide de la kinase polynucléotidique T4 et du P32 80 p, chauffez à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez sur de la glace. Le marquage de l'ARN est effectué dans une salle chaude spécialement conçue pour les expériences impliquant des radio-isotopes, en présence de tampon PNK, de kinase polynucléotidique T4, d'un microlitre d'ATP gamma-P32 et d'eau jusqu'à un volume final de 20 microlitres. Incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après 30 minutes, ajouter 20 microlitres d'eau dans chaque réaction et purifier par une colonne G 50. Enfin, obtenir 40 microlitres d'ARN marqué à une concentration finale de 250 nanomolaire. Replier chaque pool d'ARN marqué dans un tampon HBS 1 fois en chauffant à 95 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, laisser refroidir jusqu'à 37 degrés Celsius, ce qui prendra de 30 à 40 minutes.

Poursuivre l'incubation à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Une fois le repliement du pool d'ARN terminé, réaliser une réaction de liaison de 100 microlitres. Combiner le pool d'ARN marqué à l'extrémité avec la protéine GP un 20 et un excès molaire dix fois supérieur de tARN non spécifique comme compétiteur, dans un tampon de liaison pour ARN à haute force ionique, puis incuber à température ambiante pendant 30 minutes.

À la fin des 30 minutes, séparer 50 microlitres de la réaction de liaison à l’aide d’un filtre en nitrocellulose préalablement humidifié. Laver ensuite le filtre avec deux millilitres de tampon de liaison et mesurer l’activité radioactive retenue sur le filtre à l’aide d’un compteur à scintillations polyvalent comme comptage de contrôle d’entrée. Les 50 microlitres restants de la réaction de liaison, en parallèle, l’essai de liaison du pool d’ARN après chaque cycle de sélection a été analysé par un essai de liaison sur filtre avec de l’ARNt compétiteur afin de suivre l’évolution du VIH-1, GP120.

Les activités de liaison de fixation d'Optima ont été calculées comme le pourcentage d'ARN d'entrée retenu sur le filtre dans le complexe protéine-ARN, comme indiqué ici. Le pool d'ARN initial montre seulement 0,1 % de l'ARN d'entrée retenu sur la membrane. Toutefois, après neuf cycles de sélection, la neuvième bibliothèque d'ARN présente 9,72 % de l'ARN d'entrée lié.

Bien que des tours supplémentaires de sélection aient été réalisés, aucune autre enrichissement n'est observé, suggérant que la liaison maximale du pool d'ARN a été atteinte. Les activités de liaison des pools d'ARN ont été confirmées par des tests de migration sur gel. Ces résultats démontrent que certains ligands présentant une forte spécificité de liaison pour la protéine cible sont progressivement enrichis dans ces pools d'ARN.

Dans cet exemple, le 12e pool d'ARN a montré l'activité de liaison la plus élevée, car la liaison maximale du pool d'ARN a été atteinte après le 12e cycle de sélection. Ce pool d'ARN a ensuite été rétrotranscrit en ADNc, qui a par la suite été amplifié par PCR. Le produit de PCR a alors été purifié et cloné dans un vecteur de clonage TA, puis séquencé après alignement de 140 clones. Six groupes d'anti GP one 20 optimas ont été identifiés.

Seules les séquences aléatoires des régions centrales Aptima sont indiquées dans ce tableau. Environ 40 % des clones contiennent une séquence conservée. Une séquence représentative de chaque groupe a été choisie pour une caractérisation ultérieure en raison de leur abondance relative au sein de leur groupe, à l’aide d’un test de migration en gel natif, et la constante de dissociation KD de ces aptamères représentatifs a été calculée, par exemple, A un.

Le meilleur des abers présente une valeur de KD apparente de 52 nanomolaire. Comme indiqué ici. Ces abers sélectionnés peuvent se lier sélectivement à la cible GP120 du VIH-1, mais pas à la protéine GP120 du VIH de la souche CM, sur des cellules CHO-G160 exprimant de façon stable la glycoprotéine d’enveloppe du VIH, GP160, utilisées pour tester la liaison et l’internalisation des optimas anti-GP120 sélectionnés.

Ces cellules ne traitent pas la GP160 en GP120 et G41, car elles ne possèdent pas les protéases encodées par gag nécessaires au traitement de l’enveloppe. Une analyse en cytométrie en flux révèle que les aptamères marqués S3 se lient spécifiquement aux cellules CHO exprimant la GP160, mais pas aux cellules CHO EE témoins, qui n’expriment pas la GP160. De plus, une microscopie confocale en temps réel sur cellules vivantes selon l’axe Z indique qu’après deux heures d’incubation, l’aptamère marqué S3 est internalisé de manière sélective par les cellules CHO GP160, mais pas par les cellules témoins CHO EE. On a également observé que l’aptamère s’agrègeait dans le cytoplasme, suggérant ainsi que l’aptamère GP120 pourrait pénétrer dans les cellules par une endocytose médiée par récepteur.

Enfin, après avoir visionné ce module, vous devriez avoir une bonne compréhension de l'utilisation et de la mise en œuvre des méthodes sur le terrain pour isoler les ARN d'Abies.