Name: Développement dun type de cellule spécifique anti-VIH gp120 aptamères pour la livraison de siRNA (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Découvrez la sélection d'aptamères ARN anti-gp120 du VIH-1 par méthode SELEX sur filtre nitrocellulose. Cette technique permet d'isoler des ligands à haute affinité pour le développement de thérapies antivirales ciblées.

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Nous remercions Britta Hoehn, Guihua Soleil, Harris Soifer et Lisa Scherer pour les discussions utiles. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health et de AI29329 HL07470 attribué à JJR Les réactifs suivants ont été obtenus par la recherche des NIH sida et Référence Reagent Program, Division du sida, du NIAID, NIH: Le CHO-EE et CHO-gp160 cellulaire ligne; l&#39;pNL4-3 Luc vecteur; VIH-1 gp120 du DAIDS BaL, le NIAID.

<ol><li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Robertson, D. L., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+in+vitro+of+an+RNA+enzyme+that+specifically+cleaves+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA.</a> Nature. 344, 467-468 (1990).</li>
<li>Fitzwater, T., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SELEX+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A SELEX primer.</a> Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).</li>
<li>Weiss, C. D., White, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+stable+Chinese+hamster+ovary+cells+expressing+wild-type%2C+secreted%2C+and+glycosylphosphatidylinositol-anchored+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein.</a> J Virol. 67, 7060-706 (1993).</li>
<li>Vodicka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indicator+cell+lines+for+detection+of+primary+strains+of+human+and+simian+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses.</a> Virology. 233, 193-198> (1997).</li>
<li>Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection%2C+characterization+and+application+of+new+RNA+HIV+gp+120+aptamers+for+facile+delivery+of+Dicer+substrate+siRNAs+into+HIV+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+biology+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The chemical biology of aptamers.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).</li>
<li>Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aptamers+and+aptazymes+in+biotechnology%2C+diagnostics%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy.</a> Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).</li>
<li>Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+mediated+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Aptamer mediated siRNA delivery.</a> Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).</li>
<li>McNamara, J. O., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+delivery+of+siRNAs+with+aptamer-siRNA+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras.</a> Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).</li>
<li>Dassie, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+optimized+aptamer-siRNA+chimeras+promotes+regression+of+PSMA-expressing+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors.</a> Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+cell-internalizing+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers.</a> Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dual+inhibitory+function+aptamer-siRNA+delivery+system+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy.</a> Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).</li>
</ol>

J. R et JZ ont déposé un brevet sur &quot;Cell-type de système de livraison spécifique aptamère-siRNA pour le VIH-1 thérapie&quot;. USPTO, n °<strong&gt; 12/328994</strong&gt;, La date de publication: Juin 11, 2009.

Les aptamères sont des acides nucléiques in vitro évolué qui supposent spécifique et stable des formes tridimensionnelles, offrant ainsi très spécifique, obligatoire serré pour 8 molécules ciblées. La faible affinité nanomolaire liaison et la spécificité exquise d&#39;aptamères à leurs cibles en font des outils polyvalents pour le diagnostic, l&#39;imagerie in vivo, et de la thérapeutique 9. Avec l&#39;avènement de la technologie pour aptamère livraison de siRNA ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> MF-Millipore filtre à membrane </td><td> Millipore </td><td> HAWP01300 </td><td> La taille des pores 0,45 pm </td></tr><tr><td> Swinnex Porte-filtre </td><td> Millipore </td><td> SX0001300 </td><td> 13 mm de diamètre </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28706 </td><td> Purification d&#39;ADN </td></tr><tr><td> Microcon YM-30 colonne </td><td> Millipore </td><td> 42410 </td><td> Concentration d&#39;ARN </td></tr><tr><td> Bio-spin 30 colonnes </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6250 </td><td> Purification d&#39;ARN </td></tr><tr><td> Taq polymérase ADN PCR </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1806 </td><td></td></tr><tr><td> ThermoScript RT-PCR </td><td> Invitrogen </td><td> 11146-024 </td><td></td></tr><tr><td> DuraScribe Kit de transcription T7 </td><td> EpiCentre </td><td> DS010925 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP pour la PCR </td><td> Roche </td><td> 1 581 295 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide ribonucléique, le transfert de E.coli </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R1753 </td><td> compétiteur ARNt </td></tr><tr><td> VIH-1 Ba-L protéine gp120 </td><td> l&#39;AIDS Research and Référence Reagent Program </td><td> 4961 </td><td> Protéine cible </td></tr><tr><td> Kit de marquage Silencieux siARN - Cy3 </td><td> Ambion </td><td> 1632 </td><td></td></tr><tr><td> Acide phénol / chloroforme 5 / 1 solution (pH 4,5) </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td><td></td></tr><tr><td> Chloroforme / isopropanol 24 / 1 solution </td><td> Sigma </td><td> C0549 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphatase intestinale de veau (CIP) </td><td> La Nouvelle-Angleterre BioLab </td><td> M0290L </td><td></td></tr><tr><td> T4 polynucléotide kinase </td><td> La Nouvelle-Angleterre BioLab </td><td> M0201L </td><td></td></tr><tr><td> Le glycogène </td><td> Roche </td><td> 10 901 393 001 </td><td> ARN précipitations </td></tr><tr><td> Gamma-P 32-ATP </td><td> MP Biomédical </td><td> 013502002 </td><td> Radiactivity </td></tr><tr><td> 40% AccuGel 19:01 </td><td> Diagnostic national </td><td> CE-850 </td><td></td></tr><tr><td> 10xTBE </td><td> Diagnostic national </td><td> CE-860 </td><td></td></tr><tr><td> N, N, N, N&#39;-tétraméthyléthylènediamine (TMEMD) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td> Le persulfate d&#39;ammonium (APS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3678 </td><td></td></tr><tr><td> L-methioine sulfoximine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5379-250 mg </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 avec les médias </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-030 </td><td></td></tr><tr><td> Une solution de bicarbonate de sodium, 7,5% p / v </td><td> Invitrogen </td><td> 25080-094 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum Essential Medium (MEM) (10 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11430-030 </td><td></td></tr><tr><td> MEM non acides aminés essentiels (100 ) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> TA cloning kit avec pCR 2.1 </td><td> Invitrogen </td><td> K2040-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

développement d&#39;un type de cellule spécifique anti-vih gp120 aptamères pour la livraison de sirna

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

L&#39;épidémie mondiale d&#39;infection par le VIH a créé un besoin urgent de nouvelles classes d&#39;agents antirétroviraux. La puissante capacité d&#39;interférents (SI) des ARN pour inhiber l&#39;expression des transcrits d&#39;ARN complémentaires est exploitée comme une nouvelle classe d&#39;agents thérapeutiques pour une variété de maladies dont le VIH. Beaucoup de rapports précédents ont montré que les nouvelles stratégies à base RNAi anti-VIH/SIDA thérapeutiques très prometteurs, mais un obstacle majeur à l&#39;application réussie thérapeutiques et la traduction clinique de siRNA est une livraison efficace. En particulier, compte tenu de la sécurité et l&#39;efficacité des traitements à base RNAi, il est hautement souhaitable de développer une approche ciblée intracellulaire livraison de siRNA à des populations spécifiques de cellules ou de tissus. Le VIH-1 protéine gp120, une glycoprotéine de l&#39;enveloppe sur la surface du VIH-1, joue un rôle important dans l&#39;entrée virale dans les cellules CD4. L&#39;interaction de la gp120 et du CD4 qui déclenche le VIH-1 entrée et initie la fusion cellulaire a été validé comme cliniquement pertinente anti-viraux stratégie de découverte de médicaments. Ici, nous avons d&#39;abord discuter de la sélection et l&#39;identification de la 2&#39;-F modifiés anti-VIH gp120 aptamères d&#39;ARN. En utilisant une méthode SELEX nitrocellulose filtre classique, plusieurs aptamères nouvelle avec une affinité nanomolaire ont été isolés à partir d&#39;un aléatoire 50 bibliothèques nt ARN. Pour réussir à obtenir des espèces lié avec une affinité plus élevée, la rigueur de sélection est soigneusement contrôlée en ajustant les conditions. Les aptamères sélectionnés peuvent se lier spécifiquement et rapidement être internalisés dans les cellules exprimant la protéine d&#39;enveloppe du VIH-1. De plus, les aptamères seul peut neutraliser le VIH-1 infectant. Sur la base des meilleures aptamère A-1, nous créons également un roman à double fonction inhibitrice anti-gp120 aptamère-siRNA chimère dans laquelle les deux l&#39;aptamère et les portions siARN ont une puissante activité anti-VIH. De plus, nous utilisons la gp120 aptamère-siRNA chimères pour un type de cellule spécifique de la livraison de siRNA sur le VIH-1 des cellules infectées. Cette double fonction chimère montre un potentiel considérable pour combiner divers agents acides nucléiques thérapeutiques (aptamère et de siRNA) à supprimer l&#39;infection VIH-1, ce qui rend les chimères aptamère-siRNA attrayants candidats thérapeutiques pour les patients en échec thérapie antirétrovirale hautement active (HAART).

Plusieurs 2&#39;-fluoro aptamères d&#39;ARN contre le VIH-1BA-L gp120 avec nanomole affinité sont isolées à partir d&#39;une bibliothèque d&#39;ARN en<em&gt; In vitro</em&gt; La procédure SELEX. Un nouveau double fonction inhibitrice anti-gp120 aptamère-siRNA chimère est créé et montre prometteur pour systémiques thérapie anti-VIH.

Développement d&#39;un type de cellule spécifique anti-VIH gp120 aptamères pour la livraison de siRNA

L'épidémie mondiale d'infection par le VIH a créé un besoin urgent de nouvelles classes d'agents antirétroviraux. La capacité puissante des petits interférants...

L'objectif général des expériences suivantes est de produire in vitro un ARN Aptima dirigé contre la protéine GP120 du VIH-1 à l'aide d'une membrane en nitrocellulose. Cette production est réalisée par PCR suivie d'une transcription in vitro par l'ARN polymérase T7. Pour préparer l'ADN initial et la bibliothèque aléatoire d'ARN, dans une deuxième étape, le mélange de la protéine cible et de la bibliothèque d'ARN est appliqué sur un filtre en nitrocellulose préhumidifié, ce qui permet d'isoler les molécules d'ARN liées des espèces d'ARN non liées.Après 12 cycles de sélection, la bibliothèque d'ARN est clonée et séquencée afin d'identifier les candidats individuels d'aptamères ARN présents dans la bibliothèque. Les résultats obtenus permettent d'identifier plusieurs nouveaux aptamères ayant une affinité dans la gamme nanomolaire, selon les essais de migration sur gel et la microscopie confocale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les tests par lots ou les méthodes d'isolement basées sur colonne, réside dans sa simplicité et dans le fait qu'elle ne nécessite aucun prétraitement de la protéine ou des bibliothèques, comme l'immobilis

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Découvrez la sélection d'aptamères ARN anti-gp120 du VIH-1 par méthode SELEX sur filtre nitrocellulose. Cette technique permet d'isoler des ligands à haute affinité pour le développement de thérapies antivirales ciblées.

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