Name: Analyse orale de biofilm palatine Expandeurs par fluorescence hybridation in situ et la microscopie confocale à balayage laser (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Découvrez l'analyse de biofilms oraux sur appareils orthodontiques par hybridation in situ et microscopie confocale. Cette méthode permet d'étudier la structure et la composition des communautés bactériennes.

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Ce travail a été soutenu par le Fonds d&#39;hygiène de l&#39;Université médicale de Graz. Tous les sujets ont donné leur consentement éclairé. L&#39;approbation institutionnelle du protocole d&#39;étude a été obtenue de l&#39;Université médicale de Graz.

1. Prélèvement <ol><li> Retirer fixes palatine expandeurs après 4 mois de service intra-buccale. Utilisation du système NOLA terrain sec pour isoler les appareils avant leur suppression (figures 1 et 2). </li><li> Utilisez des pinces stérilisées, des gants et des plateaux pour enlever expandeurs sans ajouter la contamination (figures 3 et 4). </li><li> Objets magasin dans des flacons de 120 ml Sarstedt à -20 ° C. Prenez au laboratoire sur de la glace et le processus dans les 24 heures. </li></ol> 2. Fixation du biofilm <ol><li> Grattez flocons biofilm avec un scalpel stérile, ou de recueillir des pièces avec des pinces stériles. </li><li> Ajouter une solution glacée de 4% jusqu'en PFA échantillon est bien couvert. </li><li> Incuber le mélange à 4 ° C (ne pas congeler) pour 3 à 12 heures. Temps de fixation plus longues ou à des températures supérieures de fixation peut rendre les enveloppes cellulaires des bactéries gram-négatives cellules moins perméable aux sondes oligonucléotidiques. </li><li> Retirer solution de PFA et laver avec glacée PBS 1X. Répétez cette étape 2-3 fois à reMove résiduelle PFA. </li><li> Resuspendre l'échantillon en 1 vol. glacée PBS 1X et ajouter 1 vol. glacée 96% (v / v) d'éthanol. </li><li> Conserver l'échantillon à -20 ° C. Les échantillons fixés en fonction de ce protocole peuvent être stockés pendant plusieurs mois à plusieurs années. </li></ol> 3. La déshydratation des échantillons fixés <ol><li> Appliquer ul 50-30 du PFA matériel fixé l'échantillon sur une lame de microscope. </li><li> Sec à 46 ° C pendant environ 15 min ou à température ambiante pendant plus longtemps. Décongeler le lysozyme et la formamide. </li><li> Ajouter 250 pi de lysozyme (1mg/ml) à température ambiante pendant 10 min, facilitant ainsi la pénétration des sondes dans les cellules par une destruction partielle des parois cellulaires. </li><li> Trempez glisser dans 50%, 80% et 96% (v / v) d'éthanol pendant 3 min chacune. L'effet diurétique de la série concentration d'éthanol va se désintégrer les membranes cellulaires. </li><li> Sécher les lames à 46 ° C pendant 10 min. </li></ol> 4. Hybridation in situ <ol><li> Préparer 1 ml detampon d'hybridation douce (voir le tableau 1 pour les concentrations). Le formamide concentrations utilisées dans cette étude: 10% (EUBmix), 20% (Bac303, POGI, MUT590) ou 45% (LGCmix). </li><li> Décongeler les solutions de sondes oligonucléotidiques. Sondes décongelés doivent être conservés sur la glace et protégé de la lumière. </li><li> Ajouter 2 ul de chaque sonde à 200 pi de tampon d'hybridation, bien mélanger et appliquer le mélange à l'échantillon déshydraté sur une lame de microscope. </li><li> Placez un morceau de papier de soie dans un plat carré de Pétri et versez le tampon d'hybridation reste sur le papier de soie. </li><li> Immédiatement placer la lame à l'horizontale dans le plat et fermer le plat. Incuber dans un four à 46 ° C pendant 1-5 heures (90 min suffiront dans la plupart des cas). Les fonctions plat comme une chambre de l'humidité empêchant l'évaporation de la solution d'hybridation de la diapositive. En particulier, l'évaporation de formamide peut provoquer non spécifiques se liant à la sonde cellules non cibles. </li><li> Préparer 50 ml de tampon de lavage (voir Tableau 2 pour concentrations). Préparer le tampon de lavage dans un tube de 50 ml et préchauffer à 48 ° C dans un bain d'eau. L'étape de lavage est effectué à 48 ° C. </li><li> Retirer le plat avec la lame du four d'hybridation. Laver immédiatement le tampon d'hybridation avec un petit volume de tampon de lavage pré-chauffé, et le transfert de la glisser dans le tampon de lavage restant. </li><li> Placer le tube contenant le tampon de lavage et de la glisser dans le bain d'eau et incuber à 48 ° C pendant 10-15 min. </li><li> Retirer glisser dans le tube et plonger dans la glace froide O ddH 2 pour 2-3 secondes pour éliminer les résidus de tampon de lavage. </li><li> Sécher à l'air de la diapositive aussi rapidement que possible (l'utilisation d'air comprimé est recommandé). Séchage rapide permettra de réduire la sonde de dissociation. </li><li> Diapositives séchées peuvent être stockés dans l'obscurité à -20 ° C pendant plusieurs semaines sans perte significative de sonde conféré signal de fluorescence. </li></ol> 5. Microscopie <ol><li> Après FISH et le lavage, apply deux gouttes de près antifadent les extrémités gauche et droite d'une diapositive (tranches congelé doit être réchauffé à la température ambiante avant cette étape). </li><li> Placez un couvercle sur le dessus de glissement de microscope et attendre que le antifadent s'est répandu sur la lame entière. Notez qu'une quantité excessive de antifadent peuvent brouiller l'image du microscope. </li><li> Observez les échantillons sous un microscope confocal à balayage laser équipé de filtres appropriés ou des lasers. Nous avons utilisé un Leica TCS unité (HCX PL APO/63x; NA 1.2). Les données peuvent être analysées avec un logiciel tel que Imaris ou Amira. </li><li> Diapositives intégrées dans antifadent peuvent être conservés à 4 ° C (ne pas congeler) jusqu'à 7 jours avant la sonde de fluorescence conféré commence à diminuer. Alternativement, le antifadent peuvent être enlevés avec ddH 2 O, et les lames séchées peuvent être conservées à -20 ° C pour une période de temps prolongée. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Grattage biofilm hors appareils orthodontiques fixes (Figure 5) de flocons de rendements adéquats (figure 6) qui peuvent être hybridées directement sur lames de verre recouvertes de microscopie. De cette façon, les différents groupes de bactéries orobiome peuvent être identifiés dans leur milieu naturel en trois dimensions environnement en marquage ARNr bactériens étiquetés différemment des sondes spécifiques (figures 7 et 8). Dans la figure 7, le biofilm était tachée de EUBmix (vert, toutes les bactéries) et LGCmix (jaune, Firmicutes). Firmicutes apparaissent en vert, comme ils ont été colorés avec du jaune et du bleu. Dans la figure 8, le biofilm était tachée de EUBmix (rouge, toutes les bactéries), Bac303 (bleu, Bacteroidetes) et POGI (jaune, Porphyromonas gingivalis). Porphyromonas gingivalis est montré dans blanc jaunâtre, comme tous les trois sondes se lient à l'ADN et le chevauchement des résultats de couleurs dans un signal blanc. Les différences morphologiques entre les groupes de bactéries peuvent également être identifiés (figures 9 et 10). Grands groupes de bactéries coccoïdes sont présentés dans la figure 9, où la coloration a été réalisée avec EUBmix (vert, tous les bacteria). Différentes formes de bactéries orales ont été visualisées dans la figure 10, où les bactéries coccoïdes et filamenteuses peuvent être distingués par coloration avec EUBmix (rouge). En outre, un type de champignon comme la structure du biofilm peut être traitée via la modélisation 3D des données CLSM (figures 11 et 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">Cliquez ici pour regarder un film de la modélisation 3D.</a> <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Correction d'extension palatine in situ. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Système de Nola terrain sec. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Stérilisé pinces, des gants et un plateau. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Suppression d'extension. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Grattage biofilm avec un scalpel stérile. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Flocons de résine figure 6. Directement hybridés sur des lames de verre enduit. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 7"> Figure 7 Image CLSM:. Différenciation d'un groupe spécifique de bactéries. Superposition de données 2D 3D pile CLSM. Biofilm colorés avec EUBmix (vert, toutes les bactéries) et LGCmix (jaune, Firmicutes). <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 8"> Figure 8 images CLSM:. Différenciation d'un groupe spécifique de bactéries. Superposition de données 2D 3D pile CLSM. Tachés biofilm avec EUBmix (rouge, toutes les bactéries), Bac303 (bleu, Bacteroidetes) et POGI (jaune, Porphyromonas gingivalis). <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 9"> Figure 9 images CLSM:. Différenciation des morphologies particulières. Superposition de données 2D 3D pile CLSM. Biofilm colorés avec EUBmix (vert, toutes les bactéries). Grands groupes de bactéries coccoïdes (flèches). <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 10"> Images CLSM Figure 10:. Différenciation des morphologies particulières. Superposition de données 2D 3D pile CLSM. Biofilm colorés avec EUBmix (rouge, toutes les bactéries). Coccoïde (flèche bas) et des bactéries filamenteuses (flèche haut) peuvent être distingués. <img alt="Figure 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 11"> Structure de champignons Figure 11., Vues 3D à partir de ci-dessous. Piles de flocons de biofilm (gratté la surface d'un appareil orthodontique), colorées avec EUBmix et procéduresSSED avec Imaris (image CLSM). <img alt="Figure 11" src="/files/ftp_upload/2967/2967fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 11"> Structure de champignons Figure 12., Vue de côté 3D. Piles de flocons de biofilm (gratté la surface d'un appareil orthodontique) traitées avec Imaris (image CLSM). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Tampon d'hybridation (200 pi) </td></tr><tr><td> Concentration de formamide </td><td> 10% </td><td> 20% </td><td> 45% </td></tr><tr><td> 5 M de NaCl </td><td> 36 </td><td> 36 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 2% de SDS </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FA </td><td> 20 </td><td> 40 </td><td> 90 </td></tr><tr><td>2 O </td><td> 138 </td><td> 118 </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Toute sonde FISH </td><td> 2 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Constituants Tableau 1. De tampon d'hybridation (concentrations en pl). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Tampon de lavage (50 ml) </td></tr><tr><td> Concentration de formamide </td><td> 10% </td><td> 20% </td><td> 45% </td></tr><tr><td> 5 M de NaCl </td><td> 4500 </td><td> 2150 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M </td><td> 0 </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> ddH 2 O </td><td> 44 500 </td><td> 46 350 </td> 48 200 </tr></tbody></table> Constituants Tableau 2. De tampon de lavage (concentrations en pl). Vidéo 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2967/Film1%20Klug%20Santigli%2001_2_JES_Web.mov">Cliquez ici pour regarder le film.</a>

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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Le présent protocole décrit une approche très réaliste de biofilms coloration recueillies à partir de matériaux durs. L&#39;échantillonnage et l&#39;hybridation sont les étapes les plus critiques. Lors de l&#39;échantillonnage, il faut prendre soin que les tranches d&#39;épaisseur suffisante, sont collectées afin de s&#39;assurer que la structure du biofilm reste intacte. Pendant l&#39;hybridation, il est essentiel d&#39;éviter les fluctuations excessives de température, évitant ainsi la liaison non spécifique, ou de perte de liaison, des sondes marquées par fluorescence. Ce protocole FISH est une méthode élégante pour colorer normale biofilm hétérogènes directement sur les lames de verre, sans perturber sa composition. Les diapositives peuvent être immédiatement utilisés pour la microscopie, sans besoin de déplacer l&#39;échantillon une fois de plus. De cette façon, une amélioration par rapport à coloration dans des tubes est réalisé par la force de cisaillement moins d&#39;être appliquée à la biofilm. Tranches&gt; 50 um d&#39;épaisseur peut être préparé et étudié dans ce mode.

analyse orale de biofilm palatine expandeurs par fluorescence hybridation in situ et la microscopie confocale à balayage laser

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Microscopie confocale à balayage laser (CLSM) du biofilm hétérogènes naturel est aujourd&#39;hui facilitée par une gamme complète de techniques de coloration, l&#39;un d&#39;eux étant l&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH) 1,2. Nous avons réalisé une étude pilote dans lequel des échantillons de biofilms oraux recueillis auprès fixes appareils orthodontiques (palatine expandeurs) ont été colorées par FISH, l&#39;objectif étant d&#39;évaluer l&#39;organisation tridimensionnelle des biofilms naturels et l&#39;accumulation de plaque. 3,4 POISSONS crée une opportunité pour colorer des cellules dans leur environnement natif du biofilm par l&#39;utilisation de 16S marqués par fluorescence ARNr de ciblage des sondes. 4-7,19 Comparé à d&#39;autres techniques comme l&#39;étiquetage d&#39;immunofluorescence, c&#39;est un peu coûteuse, la technique de l&#39;étiquetage précis et simple d&#39;enquêter sur différents groupes bactériens dans des consortiums mixtes biofilm. 18,20 sondes ont été utilisées général qui se lient aux eubactéries ( EUB338 + + EUB338II EUB338III, ci-après EUBmix), 8-10 Firmicutes (LGC354 AC;. LGCmix ci), 9,10 et Bacteroidetes (Bac303) 11 De plus, les sondes de liaison spécifique à Streptococcus mutans (MUT590), 12,13 et Porphyromonas gingivalis (POGI) 13,14 ont été utilisés . L&#39;extrême dureté des matériaux de surface impliquées (en acier inoxydable et résine acrylique) nous a obligés à trouver de nouvelles façons de préparer le biofilm. Comme ces matériaux de surface ne pouvait pas être facilement coupé avec un cryotome, diverses méthodes d&#39;échantillonnage ont été explorées afin d&#39;obtenir intacte biofilm orale. Le plus pratique de ces approches est présenté dans cette communication. De petits éclats de la résine acrylique biofilm porteurs ont été grattées avec un scalpel stérile, en prenant soin de ne pas endommager la structure du biofilm. Pince ont été utilisés pour recueillir des biofilms sur les surfaces en acier. Une fois collectés, les échantillons ont été fixés et placés directement sur polysine lames de verre recouvertes. FISH a été effectuée directement sur ces diapositives avec les sondes mentionnées ci-dessus. Protocoles divers poissons ont été combinés et modifiés pour créer un nouveau protocole qui a été facile à manipuler. 5,10,14,15 Par la suite, les échantillons ont été analysés par microscopie confocale à balayage laser. Bien connu des configurations 3,4,16,17 pourrait être visualisées, y compris les champignons de style formations et des grappes de bactéries coccoïdes envahi par des canaux. En outre, la composition bactérienne de ces structures typiques du biofilm ont été analysés et des images 2D et 3D créés.

Nous présentons un protocole pour l&#39;analyse structurelle et compositionnelle du biofilm naturel d&#39;administration orale à partir d&#39;appareils orthodontiques<em&gt; In situ</emL&#39;hybridation&gt; (FISH) et microscopie confocale à balayage laser (CLSM). Échantillons de biofilms oraux ont été recueillies auprès de expandeurs palatine, le grattage de résine acrylique s&#39;écaille leur surface et leur référence pour le traitement moléculaire.

Analyse orale de biofilm palatine Expandeurs par fluorescence hybridation in situ et la microscopie confocale à balayage laser

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L'objectif général de cette procédure est d'obtenir un biofilm oral natif à partir d'expandeurs palatins pour une hybridation in situ en fluorescence. Cette opération s'effectue tout d'abord en retirant l'expanseur palatin, qui transporte le biofilm âgé de quatre mois provenant du patient. Ensuite, les éclats de résine acrylique contenant le biofilm sont grattés à partir de l'expanseur palatin.Ensuite, la fluorescence in situ par hybridation sur le biofilm fixé est réalisée directement sur des lames recouvertes. Enfin, l'analyse du biofilm coloré est effectuée à l'aide d'une microscopie à balayage laser confocale. À la fin, la structure et la composition des communautés bactériennes en biofilm sont mises en évidence par hybridation in situ en fluorescence et par microscopie à balayage laser confocale. Nous avons eu l'idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons observé des biofilms épais sur des élargisseurs orthodontiques visibles à l'œil nu.Ils nous ont amenés à réfléchir aux associations possibles entre eux et les maladies parodontales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie buccale, telles que l'agencement spatial et la composition des biofilms buccaux natifs. La méthode est interdisciplinaire et doit être réalisée par différents spécialistes.Elizabeth est orthodontiste et Barbara est biologiste en laboratoire moléculaire. Pour commencer, après quatre mois d'exposition en surface intra-orale, à l'aide du système de champ sec NOLA, isolez l'expansateur palatal fixe afin d'éviter toute contamination. Retirez l'appareil de la bouche du patient à l'aide de pinces, de gants et de plateaux stérilisés.Conserver les échantillons dans des flacons de 120 millilitres à moins 20 degrés Celsius. Les transporter au laboratoire sur de la glace et les traiter dans les 24 heures pour fixer les spécimens. Racler les lamelles de biofilm à l’aide d’un scalpel stérile ou prélever des fragments à l’aide de pinces stériles.Il est essentiel de prélever des éclats de résine acrylique d'une épaisseur adéquate afin de garantir que la structure du biofilm reste intacte à froid glacial. Ajouter une solution de paraformaldéhyde à 4 % jusqu'à ce que l'échantillon soit bien recouvert. Incuber le mélange à quatre degrés Celsius pendant trois à douze heures.Des durées de fixation plus longues ou des températures de fixation plus élevées peuvent rendre les enveloppes cellulaires des cellules gram-négatives moins perméables aux sondes d'oligonucléotides. Après l'incubation, éliminer la solution de paraldéhyde et rincer avec du PBS froid à une fois. Répéter cette étape deux à trois fois pour éliminer le paraldéhyde résiduel, puis transférer l'échantillon dans un volume de PBS froid à une fois et ajouter un volume d'éthanol glacé à 96 %. Conserver l'échantillon à moins 20 degrés Celsius.Les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs mois à plusieurs années afin de déshydrater l'échantillon. Appliquez d'abord cinq à trente microlitres de matériau d'échantillon fixé à la paraldéhyde sur une lame de microscope. Faites sécher l'échantillon pendant 15 minutes à 46 degrés Celsius ou plus longtemps à température ambiante, pendant que l'échantillon sèche, afin que la lysozyme et la formaldéhyde dégradent partiellement les parois cellulaires.Pour une meilleure pénétration des sondes, ajouter 250 microlitres d'une solution de un milligramme par millilitre de lysozyme pendant 10 minutes à température ambiante, puis plonger les lames dans de l'éthanol à 50, 80 et 96 % pendant trois minutes chacun. L'effet déshydratant de la série de concentrations d'éthanol détruit les membranes, permettant une meilleure absorption des sondes d'oligonucléotides. Enfin, sécher les lames à 46 degrés Celsius avant de réaliser l'hybridation in situ U.Commencez par préparer un millilitre de tampon d'hybridation frais et préchauffez-le à 47 degrés Celsius. Décongelez les solutions d'oligonucléotides sondes sur de la glace et maintenez-les protégées de la lumière. Placez un morceau de papier absorbant dans une boîte de Pétri carrée et ajoutez 800 microlitres de tampon d'hybridation sur le papier absorbant à l’aide d’une pipette.Fermez immédiatement la chambre car le tampon contient de la formamide, ajoutez deux microlitres de chaque sonde à 200 microlitres du reste du tampon d'hybridation. Mélangez soigneusement et appliquez le mélange immédiatement sur l'échantillon déshydraté déposé sur une lame de microscope. Placez horizontalement la lame dans la boîte et recouvrez-la. Incubez la boîte dans une étuve pendant une à cinq heures à 46 degrés Celsius.La boîte joue le rôle de chambre humide empêchant l'évaporation de la solution d'hybridation à partir de la lame. En particulier, l'évaporation du formamide peut provoquer une liaison non spécifique de la sonde à des cellules non cibles. Préparez 50 millilitres de tampon de lavage et préchauffez-le à 48 degrés Celsius dans un bain-marie.Retirer le plat avec la lame du four d'hybridation. Laver immédiatement le tampon d'hybridation à l'aide d'un petit volume de tampon de lavage préchauffé et transférer la lame dans le tampon de lavage restant. Remettre le tube contenant le tampon de lavage et la lame dans le bain-marie et incuber de 10 à 15 minutes à 48 degrés Celsius.Pour colorer les échantillons avec plusieurs sondes, répétez les étapes précédentes après avoir éliminé le tampon de lavage, en prenant soin de commencer par la forme la plus élevée à une concentration faible. Retirez la lame du tube et plongez-la dans la glace.De l’eau distillée froide pendant deux à trois secondes. Pour éliminer le tampon de lavage résiduel, séchez l’objet au contact de l’air le plus rapidement possible, car un séchage rapide réduit la dissociation de la sonde.Conserver les lames sèches à l’obscurité à moins 20 degrés Celsius pendant plusieurs semaines sans perte significative du signal de fluorescence conféré par la sonde. Pour imager les échantillons, appliquer deux gouttes de réactif Antifa près des extrémités gauche et droite d’une lame, puis ajouter une lamelle. Observer les échantillons au microscope confocal à balayage laser équipé de filtres ou de lasers appropriés ; les lames peuvent être conservées à quatre degrés Celsius pendant jusqu’à sept jours, ou peuvent être rincées à l’eau doublement distillée et conservées à moins 20 degrés Celsius pendant de plus longues périodes.Il s'agit de biofilm prélevé sur des appareils orthodontiques fixes. Vous obtiendrez des lamelles adaptées qui peuvent être hybridées directement sur des lames de verre recouvertes pour l'examen microscopique ; ainsi, différents groupes du microbiome oral, ainsi que les bactéries en configuration tridimensionnelle, peuvent être identifiés à l'aide de sondes spécifiques. Sur cette figure, le biofilm a été coloré avec le mélange EUB et le mélange LGC, les firmacutes apparaissant en vert car elles ont été colorées en jaune et en bleu.Ici, le biofilm a été coloré avec le mélange EUB mix back 3 0 3 et du pogi. Les bactéries du groupe bacteria dts apparaissent en rose et en rouge foncé. Ramons gingivalis est visible en blanc jaunâtre, car les trois sondes se lient à son ADN, et le recouvrement des couleurs produit un signal blanc morphologique.Des différences entre les groupes de bactéries peuvent également être identifiées, ainsi que certaines structures telles que les grands amas de bactéries cocci. Des exemples de tels amas sont présentés ici, où le mélange EUB a été utilisé pour la coloration. En outre, une structure typique en forme de champignon du biofilm peut être reconstruite par modélisation 3D des données de microscopie à balayage laser confocal (CLSM).Ceci est une animation 3D du biofilm coloré mixte EUB. Cette méthode peut fournir des informations sur la formation de biofilms induite par l'orthodontie. Elle peut également être appliquée à toute autre surface artificielle dans le corps humain portant des structures de biofilm complexes possédant une pathogénicité potentielle.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de préparer des biofilms buccaux natifs pour l'hybridation in situ en fluorescence et la microscopie à balayage laser confocale. Il est important de se rappeler qu'il s'agit d'un domaine interdisciplinaire et que vous ne pouvez réussir qu'au sein d'une équipe. Traitez donc toujours vos collègues avec courtoisie.

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