Analyse orale de biofilm palatine Expandeurs par fluorescence hybridation in situ et la microscopie confocale à balayage laser

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir un biofilm oral natif à partir d’expanseurs palatins pour l’hybridation in situ en fluorescence. Ceci est accompli en retirant d’abord l’expanseur palatin, portant le biofilm de quatre mois du patient. Ensuite, les flocons de résine acrylique contenant le biofilm sont grattés de l’expanseur palatal.

Ensuite, la fluorescence en C deux, l’hybridation du biofilm fixé est réalisée directement sur des lames enrobées. Enfin, l’analyse du biofilm coloré est effectuée à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser P.In la fin, la structure et la composition des communautés de biofilms bactériens sont montrées par hybridation in situ en fluorescence et microscopie confocale à balayage laser. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons rencontré des biofilms épais sur des expanseurs orthodontiques visibles à l’œil nu.

Ils nous ont fait réfléchir à des associations possibles entre eux et les maladies parodontales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie buccale, telles que l’agencement spatial et la composition des biothermies buccales natives. La méthode est interdisciplinaire et doit être réalisée par différents spécialistes.

Donc, Elizabeth est orthodontiste et Barbara est biologiste de laboratoire de molécules Pour commencer. Après quatre mois de surface intrabuccale, à l’aide du système de champ sec NOLA, isolez l’expanseur palatin fixe pour éviter la contamination. Retirez l’appareil de la bouche du patient à l’aide de pinces, de gants et de plateaux stérilisés.

Conservez les objets dans des flacons de 120 millilitres à moins 20 degrés Celsius. Apportez-les au laboratoire sur de la glace et traitez-les dans les 24 heures pour fixer les échantillons. Grattez les flocons de biofilm avec un scalpel stérile ou prélevez des morceaux avec une pince stérile.

Il est crucial de gratter les flocons de résine acrylique d’une épaisseur suffisante pour s’assurer que la structure du biofilm reste intacte à froid comme de la glace. 4 % de solution de paraldéhyde jusqu’à ce que l’échantillon soit bien couvert. Incuber le mélange à quatre degrés Celsius pendant trois à 12 heures.

Des temps de fixation plus longs ou des températures de fixation plus élevées peuvent rendre les enveloppes cellulaires des cellules à Gram négatif moins perméables aux sondes oligonucléotidiques. Après l’incubation, retirez la solution de paraldéhyde et lavez-la une fois au PBS glacé. Répétez cette étape deux à trois fois pour éliminer le paraldéhyde résiduel, Reese a plié l’échantillon en un volume de glace froide une fois PBS et ajouter un volume de glace froide 96 % d’éthanol stocker l’échantillon à moins 20 degrés Celsius.

Les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs mois à plusieurs années pour les déshydrater. Tout d’abord, appliquez cinq à 30 microlitres de matériau d’échantillon fixé au paraldéhyde sur un microscope. Séchez l’échantillon pendant 15 minutes à 46 degrés Celsius ou plus longtemps à température ambiante pendant que l’échantillon sèche pour que le lysozyme et le maide décomposent partiellement les parois cellulaires.

Pour une meilleure entrée des sondes, ajoutez 250 microlitres d’une solution d’un milligramme par millilitre de lysozyme pendant 10 minutes à température ambiante, trempez les lames dans de l’éthanol à 50, 80 et 96 % pendant trois minutes chacune. L’effet déshydratant de la série de concentration d’éthanol désintégrera les membranes pour une meilleure absorption par la sonde d’oligonucléotides. Enfin, séchez les lames à 46 degrés Celsius pour effectuer une hybridation in situ de l’U.

Commencez par préparer un millilitre de tampon d’hybridation frais et préchauffez-le à 47 degrés Celsius. Décongelez les solutions de sonde oligonucléotidique sur de la glace et gardez-les à l’abri de la lumière. Placez un morceau de papier de soie dans une boîte de Pétri carrée et pipetez 800 microlitres du tampon d’hybridation sur le papier de soie.

Refermez immédiatement la chambre car le tampon contient du formulaire, ajoutez deux microlitres de chaque sonde à 200 microlitres du reste du tampon d’hybridation. Mélangez bien et appliquez le mélange sur l’échantillon déshydraté sur une lame de microscope placez immédiatement la lame horizontalement dans le plat et couvrez-la. Incuber le plat dans un four pendant une à cinq heures à 46 degrés Celsius.

Le plat fonctionne comme une chambre d’humidité empêchant l’évaporation de la solution d’hybridation de la lame. En particulier, l’évaporation de la forme amide peut provoquer la liaison d’une sonde non spécifique à des cellules non cibles. Préparez 50 millilitres de tampon de lavage et préchauffez-le à 48 degrés Celsius au bain-marie.

Sortez le plat avec la glissière du four d’hybridation. Lavez immédiatement le tampon d’hybridation avec un petit volume de tampon de lavage préchauffé et transférez la lame dans le tampon de lavage restant. Remettez le tube contenant le tampon de lavage et la glissière dans le bain-marie et incubez pendant 10 à 15 minutes à 48 degrés Celsius.

Pour colorer les échantillons avec plus d’une sonde. Répétez les étapes précédentes après avoir retiré le tampon de lavage, en prenant soin de commencer par la forme la plus élevée d’une concentration légère. Retirez la diapositive du tube et plongez-la dans de la glace.

L’eau froide doublait l’eau distillée pendant deux à trois secondes. Pour éliminer les résidus de tampon de lavage, séchez la glissière à l’air libre le plus rapidement possible, car le séchage rapide diminue. Dissociation sondée.

Conservez les lames séchées dans l’obscurité à moins 20 degrés Celsius pendant plusieurs semaines sans perte significative du signal de fluorescence conféré par la sonde. Pour imager les échantillons, appliquez deux gouttes de réactif Antifa près des extrémités gauche et droite d’une lame, puis ajoutez une lamelle. Observez les échantillons sous un microscope confocal à balayage laser équipé de filtres ou de lasers appropriés, les lames peuvent être stockées à quatre degrés Celsius jusqu’à sept jours, ou peuvent être lavées avec de l’eau doublement distillée et stockées à moins 20 degrés Celsius pendant de plus longues périodes.

C’est graver le biofilm des appareils orthodontiques fixes. Vous trouverez des flocons appropriés qui peuvent être hybridés directement sur des lames de verre revêtues pour la microscopie, tels que différents groupes de microbiome buccal, des bactéries en configuration tridimensionnelle peuvent être identifiées grâce à des sondes spécifiques. Dans cette figure, le biofilm a été coloré avec des aigus fermes du mélange EUB et du mélange LGC apparaissant verts car ils étaient colorés au jaune et au bleu.

Ici, le biofilm a été coloré avec du mélange EUB 3 0 3 et du pogi. Les bactéries du groupe bactéries dts apparaissent en rose et au feu médiocre. Ramons gingivalis est représenté en blanc jaunâtre car les trois sondes se lient à son ADN et le chevauchement des couleurs entraîne un signal morphologique blanc.

Des différences entre les groupes de bactéries peuvent également être identifiées, ainsi que certaines structures comme de grands groupes de bactéries de coco. Des exemples de tels amas sont présentés ici où un mélange d’EUB a été utilisé pour la coloration. De plus, une structure typique du biofilm semblable à celle d’un champignon peut être traitée via la modélisation 3D des données CLSM.

Il s’agit d’une animation 3D du biofilm coloré mixte de l’EUB. Cette méthode peut donner un aperçu de la formation de biofilms induite par l’orthodontie. Il peut également être appliqué à toute autre surface artificielle du corps humain qui porte des structures complexes de biofilm avec une pathogénicité possible.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des biofilms oraux natifs pour la fluorescence dans l’hybridation C deux et la microscopie confocale à balayage laser. Il est important de se rappeler qu’il s’agit d’un domaine interdisciplinaire et que vous ne pouvez réussir qu’en équipe. Traitez donc toujours vos collègues avec gentillesse.