Encyclopédie des expériences JoVE
Recherche sur le cancer
0 vues • 4:13 min • April 30th, 2023
Les cellules tumorigènes de la trompe de Fallope stimulent les cellules ovariennes saines à produire des communicateurs chimiques ou de petites molécules qui favorisent les métastases tumorales. Pour visualiser ces communicateurs chimiques, commencez par assembler un séparateur de puits sur une lame de verre appropriée. Placez un séparateur en plastique en diagonale dans le puits pour séparer le puits en deux compartiments de taille égale. Distribuez une suspension de cellules tumorales de la trompe de Fallope dans de l’agarose liquide dans un compartiment du puits. Lors du refroidissement, l’agarose se solidifie et forme un réseau 3D permettant le piégeage des cellules tumorales.
Retirez le séparateur et placez un tissu ovarien sain au centre du compartiment vide. Recouvrez-le d’un mélange d’agarose liquide. Permettez à l’agarose de se solidifier et d’intégrer le tissu ovarien à proximité des cellules cancéreuses. Incuber pour la durée souhaitée. Les cellules tumorales et les cellules ovariennes saines produisent de petites molécules qui diffusent à travers le réseau d’agarose vers leurs cellules voisines.
Retirez le séparateur de puits. Séchez la co-culture pour dessécher et aplatir l’agar, et capturer les petites molécules libérées dans la matrice. Visualisez la distribution de petites molécules à l’aide de la spectroscopie de masse imageuse ou IMS.
Placez le séparateur à 8 puits sur la lame traitée ITO et insérez les séparateurs en plastique en diagonale dans les puits. Préparez les cultures cellulaires comme fait précédemment et combinez 100 microlitres de suspension cellulaire et 100 microlitres d’agarose liquéfiée dans un tube de 2 millilitres. Immédiatement, plaquez 150 microlitres de mélange d’agarose cellulaire sur un côté du diviseur tout en maintenant une pression vers le bas sur le diviseur.
Laissez l’agarose refroidir et se solidifier pendant environ 1 minute, puis retirez le séparateur. Utilisez une pince pour placer l’explant d’ovaire au centre de la moitié vide du puits. Ajoutez 150 microlitres de mélange d’agarose cellulaire sur le dessus de l’ovaire. Incuber la lame à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié.
Après quatre jours, retirez le séparateur de chambre des bouchons d’agarose. À l’aide d’une spatule plate, détachez les côtés de l’agarose de la chambre et tirez doucement la chambre vers le haut. Si des bouchons d’agarose sont déplacés, repositionnez-les doucement de manière à ce qu’ils ne se touchent pas.
Placez la lame dans un four à 37 degrés Celsius pendant environ quatre heures et faites-la pivoter de 90 degrés toutes les heures pour assurer une répartition uniforme de la chaleur dans tout l’échantillon. La lame doit être complètement sèche ; sinon, cela pourrait conduire à une explosion de l’échantillon dans l’environnement de vide poussé du spectromètre de masse MALDI-TOF.
Le séchage de la lame et le suivi de la progression sont les étapes les plus critiques pour obtenir une résolution spatiale élevée et des spectres de masse de qualité. En cas d’écaillage ou de plis excessifs, nous ne recommandons pas de collecter les données de spectrométrie de masse.
Avec les paramètres définis sur le pulvérisateur matriciel, appliquez la solution matricielle sur la lame. Pour utiliser du rouge de phosphore comme étalon, ajoutez 1 microlitre de rouge de phosphore à un endroit dégagé sur la lame. Pour utiliser le mélange peptidique comme calibrateur, mélangez-le avec de la matrice sur du parafilm dans un rapport de 1 à 1 pour faciliter l’ionisation et placez 0,5 à 1 microlitre sur la lame. Attendez que l’étalon sèche avant d’obtenir les données d’imagerie par spectrométrie de masse.