Système de culture proximale : une technique de culture in vitro pour étudier la signalisation paracrine entre les cellules

Dans la signalisation paracrine, les cellules produisent et sécrètent des molécules de signalisation qui induisent des réponses dans les cellules voisines. Pour imiter la signalisation paracrine, commencez par préparer des suspensions unicellulaires de cellules cancéreuses de l’ovaire et de cellules mésothéliales dans leur milieu approprié.

Ensuite, prenez un insert membraneux poreux inversé dans une boîte de culture stérile. Pipetez la suspension de cellules cancéreuses sur la surface inférieure de la membrane d’insertion pour former un dôme liquide. Incuber pour permettre aux cellules de s’installer et de se fixer à la membrane.

Retournez l’insert pour vider le support. Transférez l’insert dans une boîte de culture fraîche contenant un milieu de croissance pour nourrir les cellules cancéreuses qui adhèrent à la surface inférieure de la membrane. Maintenant, ajoutez la suspension de cellules mésothéliales dans le puits d’insertion. Incuber pour permettre aux cellules d’adhérer du côté opposé de la membrane, en empêchant tout contact direct entre les deux types de cellules.

Pendant la culture, les deux types de cellules sécrètent des facteurs de signalisation. Ces molécules diffusent à travers la membrane poreuse vers les cellules voisines. Ils se lient à des récepteurs cellulaires spécifiques et induisent des cascades de signalisation complexes dans les deux types de cellules.

Commencez par détacher les cellules cancéreuses de l’ovaire d’un mélange confluent à 80 % avec 1 millilitre de trypsine à 0,25 % pendant 40 à 60 secondes, puis neutralisez la réaction avec 6 millilitres de milieu de croissance complet. Récupérez les cellules par centrifugation et remettez en suspension la pastille dans 5 millilitres de milieu de croissance complet frais.

Après le comptage, diluez les cellules à 100 000 cellules cancéreuses de l’ovaire par millilitre de concentration complète de milieu de croissance, et placez trois inserts de culture cellulaire à membrane en polycarbonate à pores inversés de 0,4 micromètre traités par culture tissulaire par condition expérimentale dans une boîte de culture de tissus stérile de taille appropriée. Étiquetez les inserts en fonction des conditions expérimentales et pipetez soigneusement les cellules cancéreuses au bas de chaque insert en cercles concentriques, en commençant par le milieu de la membrane et en se déplaçant vers l’extérieur, pour former un dôme de 800 microlitres.

Soyez extrêmement prudent lorsque vous ensemencez les cellules sur la surface inférieure de l’insert afin que le dôme des cellules contenant le milieu ne s’écoule pas des bords de l’insert pendant l’incubation.

Lorsque tous les inserts ont été ensemencés, couvrez le plat et placez soigneusement les inserts dans l’incubateur de culture cellulaire. Après environ 4 heures, détachez le HPMC avec 2 millilitres de trypsine à 0,25 % pendant une à deux minutes, puis neutralisez la réaction avec 12 millilitres de milieu de croissance complet.

Recueillir le HPMC par centrifugation et remettre en suspension la pastille dans 10 millilitres de milieu de croissance complet pour le comptage. Diluez les cellules à 300 000 HPMC par millilitre de milieu de croissance complet et ajoutez 2,5 millilitres de milieu de croissance complet frais à chaque puits d’une plaque de culture à 6 puits.

À l’aide d’une pince stérile, placez chaque insert à l’endroit dans chaque puits de la plaque à 6 puits de sorte que les surfaces attachées aux cellules cancéreuses de l’ovaire inférieures soient immergées dans le milieu. Ensuite, ensemencez 1,5 millilitre de HPMC dans le puits de chaque insert et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 72 heures.

• Paracrine Signaling - Cellular communication through secreted molecules affecting neighboring cells.
• Mesothelial Surface - The membrane where the mesothelial cells adhere and function.
• Culture System - Set-up where cells are grown under controlled conditions, often in vitro.
• Corning 10-013-CV - Specific type of culture dish used for cell adhesion and growth experiments.
• In Vitro Cell Culture Techniques - Methods used to cultivate cells in controlled environments outside of the living organism.

• Introduce Paracrine Signaling – Paracrine signaling is the process by which cells communicate and influence the behavior of neighboring cells via secreted molecules (e.g., paracrine).
• Key Concepts - We can simulate this biological process in an in vitro cell culture system using human mesothelial cells and cancer cells (e.g., culture system).
• Underlying Mechanisms - Both cell types secret signaling factors which bind to receptors and trigger complex responses (e.g., mesothelial surface).
• Connect to Experiment - To study this, cells are cultivated on either side of a porous membrane in a culture dish (e.g., corning 10-013-CV).

• What is paracrine signaling and how does it work in an in vitro culture system?
• How are mesothelial and cancer cells cultured for this study?
• What are the key concepts and mechanisms underlying paracrine signaling?

• Practical Applications - Understanding paracrine signaling could improve diagnosis and treatment of diseases like cancer (e.g., in vitro cell culture techniques).
• Industry Impact - The knowledge acquired is beneficial for the medical and pharmaceutical sectors (e.g., culture system).
• Societal Importance - The broader implications extend to improving patient outcomes and quality of care (e.g., mesothelial surface).
• Link to Scientific Advancements - The use of in vitro cultivation techniques continues to advance our understanding of cell communication (e.g., corning 10-013-CV).