Isolement des cellules mésothéliales : une technique pour isoler les cellules mésothéliales primaires à partir d’un échantillon de tissu d’épiploon humain

Les cellules mésothéliales primaires humaines, ou HPMC, tapissent de nombreux organes viscéraux comme l’épiploon ou la couche de tissu adipeux présente dans la cavité péritonéale.

Pour isoler les cellules mésothéliales, commencez par immerger un échantillon d’épiploon humain dans un tampon approprié pour éliminer l’excès de globules rouges ou de globules rouges. Ensuite, placez l’épiploon dans un plat en verre et coupez-le en morceaux. Cela dissocie les tissus, libérant des HPMC avec les globules rouges contaminants.

Transférez les morceaux dans un tube conique et laissez-les rester immobiles pendant le temps souhaité. Le tissu haché riche en graisse de faible densité remonte vers le haut, tandis que les composants cellulaires denses se déposent vers le bas. Ensuite, aspirez le liquide au fond, contenant les HPMC et les GR, dans un tube frais.

Centrifugeuse pour collecter les cellules. Retirez le surnageant contenant la mémoire tampon. Remettez la pastille en suspension dans un milieu de croissance mésothélial et incubez pendant la durée souhaitée. Le média facilite la croissance sélective des HPMC par rapport aux GR.

Observez les cellules à l’aide d’un microscope optique pour confirmer la croissance de cellules mésothéliales humaines de forme cuboïde.

Lors de l’acquisition d’un échantillon chirurgical d’épiploon humain, immergez immédiatement l’échantillon dans du PBS à température ambiante. Dans les 2 heures suivant l’immersion, transférez l’épiploon dans un tube conique de 50 millilitres contenant 20 millilitres de PBS frais. Transférez le lavage PBS restant contenant les cellules mésothéliales humaines primaires ou HPMC et les globules rouges dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et faites tourner les cellules.

Ensuite, versez le contenu du tube dans une boîte de culture stérile de 10 centimètres et utilisez deux scalpels pour hacher le tissu en morceaux de 5 millimètres cubes. Pour isoler les cellules mésothéliales humaines primaires ou HPMC, transférez les morceaux d’épiploon dans un tube conique de 50 millilitres et attendez 1 minute pour que les morceaux solides flottent vers le haut. Le HPMC se déposera au fond du tube avec les globules rouges.

À l’aide d’une pipette, transférez le lavage PBS contenant des cellules mésothéliales et des globules rouges dans le tube contenant les cellules granulées et faites tourner les cellules. Ensuite, ajoutez 20 millilitres de PBS frais à l’épiploon et collectez le HPMC et le RBC contenant du PBS trois fois de plus, comme nous venons de le démontrer aux cellules granulées d’origine.

Après l’essorage final, plaquez les cellules dans une fiole de 75 centimètres carrés dans 15 millilitres de milieu de croissance complet. Pour isoler du HPMC supplémentaire à partir de l’échantillon d’épiploon, agitez le tissu solide restant dans 20 millilitres de PBS à 200 tr/min et 37 degrés Celsius. Après 10 minutes, laissez reposer l’échantillon pendant 1 minute pour permettre au tissu solide de remonter vers le haut du tube.

Ensuite, prélevez le HPMC et le RBC au fond du tube, comme nous venons de le démontrer. Maintenant, faites tourner les cellules du lavage secondaire et plaquez-les dans un flacon séparé de 75 centimètres carrés dans 15 millilitres de milieu de croissance complet. Pour isoler tout HPMC restant, agitez le tissu pendant encore 10 minutes, cette fois dans un mélange de PBS et de 10 millilitres de trypsine-EDTA, et placez ces HPMC et RBC dans une fiole de 75 centimètres carrés.

Ensuite, incubez les cultures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un environnement humidifié. Nourrir les cellules en plaques avec 15 millilitres de milieu de croissance frais les jours 3 et 5 sans retirer le milieu épuisé. Les HPMC peuvent être identifiés par leur forme cuboïdale et leur expression de cytokératine-8 et de vimentine.