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Recherche sur le cancer
0 vues • 4:34 min • April 30th, 2023
Au cours des métastases du cancer de l’ovaire, les cellules malignes se détachent du site tumoral primaire et commencent à circuler dans la cavité péritonéale. Ces cellules peuvent ensuite former des amas ou des sphéroïdes qui adhèrent à la monocouche de cellules mésothéliales tapissant la cavité péritonéale. Au fur et à mesure que la tumeur se développe, elle élimine les cellules mésothéliales sous-jacentes pour faciliter l’invasion.
Pour modéliser la clairance mésothéliale, commencez par ensemencer des cellules mésothéliales exprimant la protéine fluorescente verte ou GFP dans une boîte de culture à fond de verre recouverte de fibronectine. L’enrobage de fibronectine fournit une matrice qui favorise l’attachement cellulaire. Incuber la boîte pour permettre aux cellules mésothéliales de se propager et de former une monocouche.
Ensuite, transférez une suspension de sphéroïdes de cellules cancéreuses de l’ovaire exprimant la protéine fluorescente rouge sur la monocouche mésothéliale. Imagez la culture pendant une durée prolongée à l’aide de la microscopie à fluorescence à intervalle de temps. Les sphéroïdes fluorescents rouges se déposeront et se fixeront à la monocouche mésothéliale fluorescente verte.
Les cellules cancéreuses exercent une force sur les cellules mésothéliales, perturbant les jonctions cellulaires et altérant l’intégrité de la couche mésothéliale. La force déplace également les cellules mésothéliales sous-jacentes, générant un trou. Choisissez un réglage de filtre GFP approprié pour visualiser le trou résultant sous la forme d’un espace noir dans l’image. Mesurez l’espace pour quantifier l’étendue de la clairance mésothéliale.
Pour commencer cette procédure, pré-enduisez les puits d’une boîte MatTek à fond de verre à 6 puits avec de la fibronectine. Ajoutez 2 millilitres de solution de fibronectine/PBS dans chaque puits du plat et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Les cellules mésothéliales exprimant des protéines fluorescentes vertes, pour former une monocouche de cellules mésothéliales, sont cultivées dans un milieu de base à 10 %. Trypsinisez une plaque de cellules mésothéliales et faites-la tourner dans une centrifugeuse de table à 900 tr/min pendant trois minutes.
Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un milieu de base à 10 %. Ajuster à la concentration souhaitée avec un milieu de base à 10 %. Lorsque l’incubation de 30 minutes de la boîte MatTek est terminée, lavez les puits avec 2 millilitres de PBS. Aspirez le PBS et la plaque 6 fois 10 vers la cinquième cellule mésothéliale par puits dans chaque puits de la boîte MatTek à 6 puits. Incuber la boîte MatTek dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour permettre aux cellules mésothéliales de se fixer à la boîte et de former une monocouche.
À l’aide d’une pipette, prélevez les sphéroïdes du cancer de l’ovaire à partir de la plaque recouverte de poly-HEMA à 96 puits. Aspirez le milieu d’un puits de la boîte MatTek à 6 puits contenant une monocouche de cellules mésothéliales. Laver une fois avec 2 millilitres de PBS. Ajoutez tous les sphéroïdes de la plaque à 96 puits dans un puits de la parabole MatTek. C’est environ trois fois le nombre de sphéroïdes qui vont être imagés pour tenir compte du fait que les sphéroïdes atterrissent sur la partie de la parabole qui ne peut pas être imagée.
Comme nous ne voulons imager qu’un seul sphéroïde par champ de vision, l’agrégation des sphéroïdes doit être évitée. Secouez doucement le plat d’un côté à l’autre pour répartir uniformément les sphéroïdes sur la monocouche avant qu’ils ne se fixent.
Placez l’antenne MatTek sur la platine d’un microscope à fluorescence à grand champ inversé capable d’effectuer une imagerie en accéléré pendant une durée d’au moins huit heures. Utilisez une platine motorisée pour imager plusieurs positions dans la parabole, avec plusieurs événements d’intercalation sphéroïde, en une seule expérience. Les sphéroïdes des cellules cancéreuses de l’ovaire se déposeront au fond de la boîte et se fixeront à la monocouche de cellules mésothéliales. Collectez des images GFP, RFP et de phase de plus de 20 interactions sphéroïdes/monocouches toutes les dix minutes pendant huit heures.