Dosage de l’agarose : une technique pour intégrer des organoïdes pour l’analyse histologique

Les

cultures organoïdes 3D de cellules cancéreuses récapitulent de nombreuses caractéristiques physiopathologiques des cancers humains. Ainsi, ces cultures in vitro constituent un excellent modèle pour la recherche sur le cancer.

Pour le traitement de ces organoïdes, commencez par une culture d’organoïdes 3D préformés cultivés dans une matrice de membrane basale appropriée. Ajoutez le milieu de récupération cellulaire de votre choix et incuberez. Le milieu facilite la dépolymérisation du gel matriciel, libérant les organoïdes 3D dans la solution.

Centrifuger ce mélange pour granuler les organoïdes. Le fluide de récupération contenant les composants de la matrice reste dans le surnageant. Jetez le surnageant. Ensuite, ajoutez une solution de paraformaldéhyde à la pastille organoïde. Le produit chimique pénètre dans les cellules organoïdes et se lie aux acides aminés, provoquant la réticulation des protéines et la fixation de l’échantillon. Cette étape est vitale pour toute application histologique en aval.

Granulez les organoïdes pour séparer et éliminer le surnageant contenant du paraformaldéhyde. Ajouter de l’agarose fondue chaude aux organoïdes. À l’aide d’une aiguille, détachez et dispersez les organoïdes granulés dans l’agarose liquide. Laissez l’agarose se solidifier et encastrer les organoïdes. Utilisez le bouchon d’agarose contenant des organoïdes pour les tests histologiques en aval.

Pour traiter les organoïdes pour l’histologie, retirez les milieux existants du puits en prenant soin de ne pas aspirer les dômes de la membrane basale. Ajoutez un volume égal de solution de récupération cellulaire et incubez la plaque pendant 60 minutes à 4 degrés Celsius.

Après l’incubation, délogez le dôme de la membrane basale à l’aide d’une pipette et écrasez-le avec la pointe de la pipette. Recueillez le dôme dissocié et la solution de récupération cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifugez le tube à 300 x g et 4 degrés Celsius pendant 5 minutes, puis retirez le surnageant et mettez-le de côté.

Conservez tout le surnageant jusqu’à l’étape finale où la présence d’organoïdes est confirmée. Ajoutez le volume souhaité de PBS froid et pipetez doucement de haut en bas pour déloger mécaniquement la pastille sans perturber les organoïdes. Répétez la centrifugation et retirez le surnageant.

Fixez le granulé dans un volume correspondant de 4 % de PFA pendant 60 minutes à température ambiante. Après la fixation, répétez l’étape de centrifugation et le lavage PBS. Ensuite, ajoutez lentement 200 microlitres d’agarose chaud à 2 % et détachez immédiatement mais doucement la pastille cellulaire de la paroi du tube sans la perturber à l’aide d’une aiguille de calibre 25 attachée à une seringue de 1 millilitre.

Pour la méthode de centrifugation de l’agarose, il est essentiel de détacher la pastille cellulaire de la paroi du tube juste après avoir ajouté de l’agarose à l’aide d’une aiguille de calibre 25.

Une fois que l’agarose s’est complètement solidifiée, détachez-la du tube à l’aide d’une aiguille de calibre 25 attachée à une seringue de 1 millilitre et transférez-la dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Remplissez le tube avec de l’éthanol à 70 % et suivez le protocole conventionnel de déshydratation des tissus et d’incorporation de paraffine.